Il-17 produzierende gd T-Zellen in der Gallengangatresie als Therapieansatz

Da das Zytokin IL-17 als Entzündungsstoff im BA-Mausmodell in kranken Tieren verstärkt nachweisbar ist, wobei gd T-Zellen und nicht Th-17-Zellen als Produzenten von IL-17 identifi-ziert worden sind, stellen gd T-Zellen in der Gallengangatresie möglicherweise die entschei-denden Zellen der fehlregulierten Immunantwort und einen wichtigen Faktor bzgl. der Pa-thogenese dar.

In Vorarbeiten konnte unsere Gruppe zeigen, dass eine Antikörper basierte Anti-IL-17-Therapie den Krankheitsverlauf der experimentellen Gallengangatresie verbessert⁵². Günsti-ger und sicherer als eine Antikörpertherapie ist eine pharmakologische Hemmung der IL-17 Produktion mit Präparaten, die bereits bei anderen Erkrankungen klinischen Einsatz gefun-den haben. Eine hierfür in Frage kommende Stoffgruppe sind Retinoide.

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Sowohl natürliche als auch synthetische Retinoide wurden und werden ebenfalls in ver-schiedenen autoimmunen Krankheitsmodellen getestet. Kwok et al. untersuchten die Aus-wirkungen von ATRA auf die Entwicklung der rheumatoiden Arthritis und die pathophysiolo-gischen Mechanismen, die hinter der ATRA-Wirkung stehen⁶¹. Als Ergebnis konnten die For-scher feststellen, dass eine intraperitoneale Injektion von ATRA den Krankheitsverlauf der Tiere verbesserte und die Inzidenz der Arthritis verminderte. Die Anzahl der IL-17 produzie-renden T-Zellen zeigte sich deutlich reduziert, wobei die regulatorischen T-Zellen bei den ATRA-behandelten Mäusen zunahmen⁶¹.

Im Tiermodell der Vaskulitis reduzierte eine tägliche Gabe von 1mg/kg bzw. 4mg/kg AM80 deutlich die Ansammlung von inflammatorischen Zellen in der Aorta und den Koronararte-rien und somit die histologischen Merkmale der Vaskulitis. Mit einer prophylaktischen, nicht aber mit einer therapeutischen Gabe von AM80 gelang es den Vaskulitis-Score dosisabhän-gig zu verbessern. Auf Zellebene konnte die verstärkte Migration von neutrophilen Gra-nulozyten und ihre Elastasefreisetzung im Modell der Vaskulitis durch den Einsatz von AM80 vermindert werden⁶².

Auch in der experimentellen, autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), einem Mausmodell der Multiplen Sklerose, waren Retinoide wirksam. Nach oraler Behandlung mit AM80 verzögerte sich das Auftreten der Symptome bei behandelten Mäusen deutlich und die Krankheits-schwere war im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant geringer. Weiterhin wurde gezeigt, dass die IL-17-Produktion von bereits differenzierten und zur IL-17-Sekretion stimulierten Th17-Zellen durch AM80 reduziert werden kann⁶³.

18 2. Fragestellung

Die Gallengangatresie als Erkrankung des Neugeborenen ist hinsichtlich ihrer Ursachen und ihrer Pathogenese noch nicht abschließend erforscht, wobei sich jedoch deutliche Hinweise auf eine autoimmun-entzündliche Komponente bei der Entstehung der Krankheit finden¹⁴. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass als initiale Träger der Immunreaktion der Gallengangatresie IL-17 produzierende gd T-Zellen fungieren⁵². Unklar war, ob Retinoide die IL-17 Produktion von gd T-Zellen beeinflussen und in der experimentellen Gallengang-atresie einen therapeutischen Effekt haben können.

Das Ziel der Arbeit ist daher, zunächst ein in vitro System für gd T-Zellen zu entwickeln in dem diese IL-17 produzieren und hieran eine Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen AM80 und der IL-17-Produktion zu ermitteln. Anschließend gilt es die gewonnenen Erkenntnisse in vivo am Tiermodell anzuwenden um translational ggf. neue Therapien der Gallengangatresie zu schaffen.

Es leiten sich folgende Fragestellungen ab:

1. Was sind die optimalen Kulturbedingungen in Hinblick auf Stimulationszeit und Zugabe von Zytokinen um gd T-Zellen in vitro zur IL-17 Produktion anzuregen?

2. Kann AM80 die IL-17 Produktion der gd T-Zellen in der Zellkultur vermindern und wenn ja, gibt es eine Beziehung zwischen eingesetzter AM80-Dosis und Konzentration des Zy-tokins IL-17?

3. Hat AM80 einen Einfluss auf die Effektorfunktion geprimter Lymphozyten, die bereits im Tiermodell der BA die murine Leber infiltrierten?

4. Verbessert die Anwendung des Retinoids AM80 im Tiermodell der Gallengangatresie den Krankheitsverlauf der Tiere bzw. kann die Inzidenz der Erkrankung gesenkt werden?

19 3. Material und Methoden

Die für die unterschiedlichen Methoden verwendeten Materialien wie z.B. Medien, Enzyme und Puffer werden in dem Abschnitt aufgeführt, in dem die jeweilige Methode beschrieben wird. Eine detaillierte Auflistung aller verwendeten Geräte, Reagenzien, Verbrauchsmateria-len, Antikörper, Zytokine und Primer-Sequenzen folgt im Anhang.

3.1.Versuchstiere

3.1.1. Versuchstierhaltung

Alle tierexperimentellen Studien dieser Arbeit wurden gemäß dem deutschen Tierschutzge-setz und der Europäischen Richtlinie 2010/63/EU durchgeführt. Die Gesundheitsüberwa-chung der Tiere wurde nach FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Association) Richtlinien durchgeführt. Alle tierexperimentellen Studien wurden vom Nds.

Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) genehmigt (Tierver-suchsantrag #12/0785 und #16/2164 + §4 2014/53). Die Tierhaltung erfolgte in den klimati-sierten Räumen des Zentralen Tierlaboratorium der MHH mit einem Lichtzyklus von 14:10 Stunden (hell:dunkel). Futter und Wasser standen ad libitum zur Verfügung.

Für das Tiermodell der experimentellen Gallengangatresie wurden adulte Tiere des Maus-stamms Balb/cAnNCrl im Alter von 6-8 Wochen von den Charles River Laboratories (Sulzfeld, Deutschland) bezogen. Die Tiere wurden im S2-Genlabor unter IVC-Bedingungen (individual-ly ventilated cages) gehalten. Bei Erreichen der Geschlechtsreife wurden sie in eine 2:1 Ver-paarung gesetzt (jeweils zwei Weibchen zu einem Männchen). Diese VerVer-paarung wurde nach einer Woche beendet. Trächtige Weibchen erhielten für die Aufzucht der Jungtiere einen eigenen Käfig. Männliche Tiere im Alter von 9 – 15 Wochen wurden ferner zur Gewinnung von Leukozyten genutzt. Jungtiere bis zu einem Alter von 14 Tagen wurden bei Versuchsen-de oVersuchsen-der Erreichen Versuchsen-der Abbruchkriterien (s. ergänzenVersuchsen-de Abbildung 1) Versuchsen-dekapitiert. Dabei wur-den Tiere der Kategorie 4 stets engmaschiger, d.h. 2-mal täglich kontrolliert und bei einem Übergang zu Kategorie 3 umgehend schmerzfrei euthanasiert. Die Tötung von älteren Tieren erfolgte durch zervikale Dislokation. Meine Mitarbeit an den tierexperimentellen Versuchen beschränkte sich auf den Zeitraum bis 07/2015 (TVA #12/0785), die nachfolgenden Experi-mente wurden durch Dr. Gertrud Vieten und Stephanie Dippel durchgeführt.

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Ergänzende Tabelle: Genehmigter Score der in vivo Versuche (#12/0785 und

#16/2164). Mäuse ab einem Punktwert von 3 wurden schmerzfrei euthanasiert.

Für alle in vitro Versuche wurden fünf bis sieben Wochen alte C57BL/6J Mäuse verwendet, die entweder der eigenen Zucht entstammten oder im Tierhaus bzw. bei Charles River be-stellt wurden. Diese Mäuse wurden im S1-Genlabor des zentralen Tierlabors der Medizini-schen Hochschule Hannover mit sterilisiertem Futter in einer sog. Barrierehaltung gehalten.

Die Tiere wurden in dem dafür vorgesehenen Raum des Labors von mir oder anderen Wis-senschaftlern mit Versuchstierkunde-Zertifikat zunächst durch cervikale Dislokation getötet.

Nach dem Einsprühen mit Ethanol (70%) wurden die Tiere auf einer Styroporplatte für die Präparation und Entnahme von Milz und Lymphknoten vorbereitet. Für einige durchflusszy-tometrische Untersuchungen wurden spezielle TCRgd reporter Mäusen von der AG um Im-mo Prinz (Immunologie, MHH) bezogen. Da die gd T-Zellen dieser speziellen Mäuse eine intrinsische grüne Fluoreszenz besitzen, lassen sie sich durchflusszytometrisch einfacher dar-stellen. Die Haltung der Tiere erfolgt ausschließlich durch die Mitarbeiter der AG Prinz.

3.2.In Vivo Versuche: Wirkung von AM80 im Tiermodell der Gallengangatresie Für alle in vivo Versuche wurde das etablierte und in der Einleitung beschriebene RRV-Mausmodell für die Gallengangatresie verwendet. In einer ersten in vivo Versuchsreihe wur-den die BALB/c Neonaten innerhalb von 24 Stunwur-den nach ihrer Geburt intraperitoneal mit

Punktwert Qualität Merkmale

6 Sehr aktiv Kräftig, neugierig, schnelle Bewegungen, Gewichtszu-nahme oder stabiles Gewicht, kein öliges Fell, kein Ikterus

5 Aktiv Neugierig, schnell, vereinzelte Aktivitätspausen, Ge-wichtszunahme oder stabiles Gewicht, kein öliges Fell, kein Ikterus

4 Eingeschränkt

aktiv

Reagiert auf Zuwendung, häufige Aktivitätspausen, stabiles Gewicht oder Gewichtsabnahme, leicht öliges Fell, sichtbarer Ikterus

3 Ruhig Desinteressiert an der Umwelt, seltene Aktivität, schläfrig, herabges. Nahrungsauf- und -annahme, Ge-wichtsabnahme, öliges Fell, sichtbarer Ikterus 2 Lethargisch Keine Aktivität, Verharren, keine Nahrungsauf- und

annahme, Gewichtsabnahme, stark öliges Fell, deutli-cher Ikterus

1 Moribund Keine Aktivität, Gewichtsabnahme, Atemschwierigkei-ten, Tod zu erwarAtemschwierigkei-ten, stark öliges Fell, deutlicher Ikte-rus

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50 µl Rhesus Rotavirus infiziert. Durch eine intraperitoneale Virusapplikation innerhalb der ersten 24 Lebensstunden nach der Geburt entwickeln 80% der infizierten Tiere klinische Zei-chen der Gallengangatresie. Der verwendete Rotavirusstamm MMU18006 wurde ursprüng-lich von ATCC (American Type Culture Collection (Manassas, VA)) erworben und in der per-manenten embryonalen Rhesusaffennierenzelllinie MA104 angezüchtet und vermehrt. Der Titer der gewonnenen Virussuspension wurde nach Lindenbach und Kollegen⁶⁴ festgestellt.

Das Virus wurde aliquotiert und bei -80°C gelagert. Es wurde immer der gesamte Wurf eines Käfigs infiziert, wobei nur solche Würfe mit vier bis acht Jungtieren in den Versuch einge-schlossen wurden. Die infizierten Würfe wurden dann in eine Kontroll- und eine Behand-lungsgruppe eingeteilt und dementsprechend durch Tätowierung markiert. Die Tatsache, dass Kontroll- und Behandlungsgruppe zu demselben Wurf gehören, schließt aus, dass mög-liche Unterschiede im Überleben der Tiere aus Faktoren, wie zum Beispiel der unterschiedli-chen Fürsorge der Mutter, resultieren. Der weitere Versuchsablauf gestaltete sich so, dass der Behandlungsgruppe ab dem ersten Lebenstag jeden zweiten Tag das Retinoid AM80 in der Dosis 1 µg (Volumen 50 µl) i.p. injiziert wurde. Die Kontrollgruppe erhielt stattdessen nur die Trägersubstanz CMC, in der das Retinoid gelöst wurde. Entsprechend des TVA erfolgte das Monitoring ein- bis mehrmals täglich. Dazu wurden die Tiere nach den klinischen Zei-chen der Gallengangatresie (Allgemeinzustand, Gewichtsverlauf, Ikterus und öliges Fell) be-gutachtet (s.Beobachtungsbogen, Kapitel 9.2.9.). Die Erfassung wurde bis zum Erreichen der Abbruchkriterien durchgeführt bzw. bis zum Tod aller erkrankten Tiere. Sowohl die überle-benden Jungtiere ohne Zeichen der Gallengangatresie als auch die Mutter wurden am Ende des Versuchs euthanasiert.

3.3.In Vivo Versuche: Behandlung BA-posi tiver Tiere mit AM80, Vergleich von Überlebens-und Gewichtskurven behandelter und unbehandelter Tiere Zweite Versuchsreihe nach Überarbeitung des Mausmodells:

Der Versuchsaufbau wurde insofern überarbeitet, als dass die intraperitoneale Infektion der BALB/c Neonaten nun mit einer Viruskonzentration von 2x10² PFU (Virusinoculum: 10µl RRV Stammlösung + 20µl PBS) erfolgte. Die Tiere wurden weiterhin innerhalb von 24 Stunden nach ihrer Geburt infiziert. Alle Tiere eines Wurfs wurden infiziert, wobei nur solche Würfe mit vier bis acht Tieren in den Versuch eingeschlossen wurden. Im Zuge der Injektion wurden die Tiere per Tätowierung einzeln markiert. Die Würfe wurden in dieser Versuchsreihe nicht aufgeteilt, sondern ein ganzer Wurf wurde als Behandlungs- bzw. Kontrollgruppe verwendet,

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da sich im Rahmen der ersten in vivo Versuchsreihe gezeigt hatte, dass die Ergebnisse ver-schiedener Würfe durchaus vergleichbar sind und die mütterliche Fürsorge nicht derart vari-iert, dass dies Überleben der Tiere stark beeinflusst würde.

Der Behandlungsgruppe wurde wie schon in der ersten Reihe der in vivo Versuche ab dem ersten Lebenstag 50 µl des Retinoids AM80 i.p. injiziert. Dabei enthielt eine Gabe AM80 1 µg der Substanz. Da das Körpergewicht der Tiere während eines Versuchs von ca. einem Gramm am Tag der Geburt bis zum Tod auf ca. sechs Gramm ansteigt, wurde den Tieren also bei jeder Gabe ungefähr 0,18-1,0 mg/kg AM80 injiziert. Diese Dosis hatte sich im Verlaufe der ersten in vivo Versuchsreihe als die erfolgversprechendste herausgestellt. Die Behandlung erfolgte ab dem ersten Lebenstag jeden zweiten Tag, wobei die klinische Begutachtung der Tiere erneut täglich erfolgte. Die Kontrollgruppe erhielt statt des Retinoids jeden zweiten Tag 50 µl PBS.

In dieser zweiten Versuchsreihe wurden jeweils vier Behandlungs- und vier Kontroll-Würfe zur Erstellung von Gewichtsverläufen und Überlebenskurven verwendet. Die weiteren Würfe wurden zur Untersuchung verschiedener Parameter herangezogen. Am 14. Lebenstag wur-den sowohl behandelte als auch unbehandelte Mäuse per Dekapitation euthanasiert. Allen Tieren wurde Blut zur Gewinnung von Serum entnommen. Diese Serumproben wurden auf die Leberwerte GOT, GPT und Bilirubin hin untersucht. Desweiteren wurden den Tieren die Leber entnommen. Jeweils ein Leberlappen wurde zur histologischen Untersuchung in Iso-pentan aufgenommen und anschließend bei -80 °C gelagert. Eine weitere Leberprobe jedes Tieres wurde benutzt um sie später per quantitativer PCR zu untersuchen. Hierfür wurden die Proben in der Substanz RNA later ebenfalls bei -80 °C eingefroren.

Das übrige Lebergewebe wurde am Tag der Präparation für eine Untersuchung per Durch-flusszytometrie aufbereitet. Dafür wurden zunächst die intrahepatischen Leukozyten mit Hilfe eines Percoll-Gradienten gewonnen und anschließend mit Fluochrom-gekoppelten An-tikörpern gefärbt. Der Ablauf der Zellisolierung mittels Percoll-Gradient und der Oberflä-chenfärbung für die Durchflusszytometrie ist den entsprechenden Abschnitten (3.8.4. und 3.9.2.) des Methodenteils zu entnehmen. Es wurde sowohl eine T-Zell-Phänotypisierungsfärbung als auch eine Färbung von myeloiden Zellen durchgeführt.

24 3.4.Serum-Chemie

Das gewonnene Blut wurde bei 800 x g für 10 Minuten zentrifugiert und das Serum in 1,5ml Eppendorftubes abpipettiert und bis zur Analyse wurde das Serum bei -80°C aufbewahrt. Bei zu geringem Serumvolumen wurden Tiere gleicher Gruppen gepoolt. Nach Verdünnung des Serums im Verhältnis 1:2 wurden die Messungen von Bilirubin, Laktatdehydrogenase (LDH), Alanin transaminase (ALT = GPT) und Aspartat transaminase (AST = GOT) mit einem AU 400 Olympus Analyzer (Olympus, Tokio, Japan) der Arbeitsgruppe von Prof. Faikah Güler, Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen der MHH durchgeführt (wie in Rong et al beschrie-ben).

3.5.Histologie

Zum Nachweis der entzündungsbedingten Veränderungen in den Lebern der infizierten Tiere wurden am Ende des Beobachtungszeitraumes einige Lebern nach Präparation nicht der Durchflusszytometrie zugeführt, sondern für eine feingewebliche Untersuchung verwendet.

Hierfür erfolgte nach Präparation eine Aufnahme in flüssigem Stickstoff. Die Organe wurden bis zur histologischen Aufbereitung bei -80 °C gelagert.

Die histologische Aufarbeitung wurde von der Arbeitsgruppe von Prof. Faikah Güler, Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen der MHH durchgeführt. Die in 4%igem Isopen-tan/Paraformaldehyd tiefgefrorenen Leberproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und in Sörensen-Puffer überführt.

3.6.Immunhistologie

Die immunhistologischen Untersuchungen wurden von der Arbeitsgruppe von Prof. Faikah Güler, Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen der MHH durchgeführt.

Für die immunhistologischen Untersuchungen wurden 1,5 µm dicke Parafffinschnitte ange-fertigt. Nach Entparaffinierung der Leberproben in einer absteigenden Alkoholreihe und an-schließender Rehydratisierung erfolgte die Inkubation mit den jeweiligen Antikörpern. Als Antikörper wurden GR-1 und F4/80 eingesetzt.

Für die Immunfluoreszenz-Färbung wurden Kryoschnitte mit einer Dicke von 2-4μm verwen-det. Nach Rehydratisierung der Proben erfolgte die Applikation und anschließende Inkubati-on mit dem Primärantikörper über Nacht. Am Folgetag wurde der Sekundärantikörper auf

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die Schnitte aufgetragen. Nach Inkubationszeit und Waschschritten folgte das Eindecken der Schnitte mit Aquapolymount und DAPI.

3.7.Zellkultur

3.7.1. Allgemeine Zellkulturbedingungen

Zur Kultivierung der eingesetzten Zellkulturplatten wurden CO2 Inkubatoren (95% Luftfeuch-tigkeit, 5% CO2 und 37°C) verwendet. Alle Arbeiten mit den Zellkulturen wurden aseptisch in Sterilwerkbänken vorgenommen. Die Ergebnisse der Zellkulturversuche wurden in zwei Wiederholungsversuchen bestätigt.

3.7.2. Zellzahlbestimmung

Zur Bestimmung der Zellzahlen wurde eine Neubauer Zählkammer eingesetzt. Je nach zu erwartender Zellzahl wurde die Zellsuspension aus den entsprechenden Kulturplatten in ei-nem Verhältnis von 1:10 bzw. in eiei-nem Verhältnis von 1:100 mit Trypanblau (Invitrogen Molecular probes, Eugene, USA) verdünnt. 10 µl der Färbelösung wurden auf die Kammer gegeben, woraufhin anschließend die Auszählung der vier Felder der Neubauer Zählkammer und die Bildung des Mittelwertes erfolgte. Die Gesamtzellzahl ergibt sich aus dem Mittelwert der gezählten Zellen multipliziert mit dem Kammerfaktor (10⁴ ), dem Verdünnungsfaktor der Färbung (10 bzw. 100) und dem Gesamtvolumen der Zellsuspension.

Es ergibt sich: Zellen x Verdünnungsfaktor (10 oder 100) x Kammerfaktor 10⁴ = Zellzahl/ml Zellzahl/ml x Volumen (mL) = Gesamtzellzahl

3.7.3. Puffer und Medien

Komplettes Medium für Zellkultur:

RPMI 1640 + GlutaMAXTM-I 500 ml Gibco, Grand Island, USA

FCS Lot. No. CPL0252 50 ml Thermo Scientific HyClone, Erembodegem, B Penicillin/Streptomycin 2,5 ml Biochrom, Berlin, D

Beta-Mercaptoethanol 0,5 ml Gibco, Grand Island, USA Ammonium-Chlorid-Kalium Lyse Puffer:

NH4CL 8,3 g

KHCO3 1,0 g

EDTA 0,1 mM

26 Destilliertes Wasser 1 l

pH 7,2 - 7,4

PBS Gibco, Grand Island, USA

(Phosphat gepufferte Salzlösung)

FACS Puffer: PBS + 1 % BSA

MACS Puffer: PBS + 0.5 % BSA + 2 mM EDTA

3.8.Zellgewinnung und -aufbereitung

3.8.1. Isolation von gd T-Zellen Zellen aus Lymphknoten und Milz

Nach cervikaler Dislokation des Versuchstiers wurden sowohl die Milz als auch die inguina-len, cervikainguina-len, axillären, mesenterialen und paraaortalen Lymphknoten (LK) entfernt und in einem 15 ml Falcon bzw. einer Petrischale mit kaltem PBS aufgenommen. Nach vorherigem Zerkleinern mit einem Skalpell wurden Milz und Lymphknoten durch ein 70 µm Zellsieb ge-rieben. Anschließend erfolgte ausführliches Spülen mit PBS und ein fünfminütiger Zentrifu-gationsschritt bei 300 x g. Das Pellet mit den LK-Zellen wurde nach Dekantieren des Über-stands in 5 ml PBS resuspendiert, das Milzpellet hingegen musste noch einer zweiminütigen Erythrozytenlyse unterzogen werden. Nach einem weiteren Waschschritt konnte auch diese Zellen in 5 ml PBS aufgenommen und mit den Lymphknoten-Zellen zusammengeführt wer-den.

Daraufhin wurden die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer wie oben beschrieben ausge-zählt, wobei die Zellausbeute pro Versuchstier zwischen 0,43 x 10⁸ und 3,07 x 10⁸ Zellen lag.

3.8.2. Isolation von leberinfiltrierenden Leukozyten

Für diesen Teil der Versuche wurden Mäuse verwendet, die zuvor mit dem Rhesus Rotavirus infiziert worden waren. Das bedeutet, dass in den Tieren bereits eine Immunreaktion statt-gefunden hat und die zu untersuchenden Leukozyten schon aktiviert (geprimet) wurden, was sich auf die Bedingungen der Zellkultur auswirkt. Im Vergleich zu den in vitro Versuchen mit juvenilen C57BL/6J Mäusen wurden die Zellen der erkrankten Balb-c Neonaten nicht aus Milz und Lymphknoten gewonnen, da die Immunzellen nach ihrer Aktivierung aus den Lymphknoten in die Peripherie des Organismus auswandern. Stattdessen wurden den symp-tomatischen Tieren nach Dekapitation die Lebern entnommen und in kaltem PBS gelagert.

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Nach Homogenisierung der Lebern mit Hilfe eines Spritzenstempels und eines Zellsiebs er-folgte anschließend an einen Erythrozytenlyse-Schritt die Aufbereitung der hämatopoeti-schen Zellen mittels eines Percoll-Gradienten (s. entsprechender Abschnitt). Nach dem fina-len Zentrifugationsschritt konnten die mononukleären Zelfina-len abgesaugt und in ein 15 ml Falcon überführt werden.

Zur Zellzählung wurde ebenfalls eine Neubauer-Zählkammer verwendet, wobei die Zellzah-len in den sechs ex vivo Experimenten bei 0,13 x 10⁶ bis 3,12 x 10⁶ Leukozyten pro Leber la-gen.

3.8.3. MACS-Verfahren

3.8.3.1. Material und Reagenzien

TCR gd+- Isolation Kit , mouse Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, D 3.8.3.2. Durchführung

Nach der Homogenisierung von Lymphknoten und Milz wurden die gd T-Zellen aus der Zell-suspension mit Hilfe des TCRgd+ Isolation Kit gemäß Herstellerprotokoll separiert. Der Ablauf ist dabei so gestaltet, dass zunächst alle Nicht-T-Zellen mit einem Antikörper, der mit einem magnetischen Bead gekoppelt ist, markiert und dadurch in einer ersten magnetischen Säule zurückgehalten wurden. Alle T-Zellen fließen durch die Säule hindurch und werden aufge-fangen. In einem zweiten Schritt werden alle gd T-Zellen per Antikörper markiert, in einer zweiten Säule festgehalten und können anschließend mit einem Stempel herausgedrückt werden.

Die gd T-Zellzahl wird mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt, wobei die Zellen in einer 1:10 Verdünnung gezählt werden. In den Versuchen erhielten wir Zellzahlen zwischen 5,3 x 10⁵ und 9,9 x 10⁵ Zellen pro Maus (Milz und Lymphknoten). Nach Erfassung der Zellzahl und einem Waschschritt konnten die Zellen so in Medium aufgenommen werden, dass sich in 200 µl Medium jeweils 1-2x 10⁵ Zellen befanden, die anschließend in einer 96-well Kultur-platte mit flachem Boden ausgesät wurden.

Die Zellseparation per MACS-Verfahren wurde nur für die in vitro Versuche angewendet. Für die Zellkulturen mit pathologischen leberinfiltrierenden gd T-Zellen wurden Zellsuspensionen genutzt, die alle Leber-Leukozyten enthielten. Die gd T-Zellen wurden dann spezifisch stimu-liert um zu gewährleisten, dass die beobachteten Effekte nur ihnen und nicht anderen Leu-kozyten zugeschrieben werden können.

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abrupt bremsen darf, sondern langsam auslaufen muss, um eine Beibehaltung der Phasen-trennung zu gewährleisten. Die Leukozyten konnten aus der Interphase abgesaugt und in ein neues Reaktionsgefäß überführt werden. Je nach Versuch wurden sie dann einer Zellfärbung für die Durchflusszytometrie zugeführt oder in Kulturmedium aufgenommen.

3.9.Überprüfung der Reinheit der gd T-Zell-Kultur mittels Durchflusszytometrie

3.9.1. Material und Reagenzien

FACSCanto II Flowcytometer BD Bioscience, San Jose, USA

3.9.2. Durchführung der Reinheitskontrolle

Das Verfahren der Durchflusszytometrie wurde angewendet um die Reinheit der positiv se-lektierten gd T-Zell-Fraktion zu überprüfen. Dafür wurden nach Abschluss der magnetischen Separation ca. 5x10^5 Zellen aus der gd T-Zell-Fraktion entnommen und in 1,5 ml FACS-Tubes überführt. Nach zweimaligem Waschen mit 200 µl FACS-Puffer bei 250 x g wurden die Zellen zunächst in PBS mit einem fluoreszierenden Antikörper, der an aminreaktive Gruppen

Das Verfahren der Durchflusszytometrie wurde angewendet um die Reinheit der positiv se-lektierten gd T-Zell-Fraktion zu überprüfen. Dafür wurden nach Abschluss der magnetischen Separation ca. 5x10^5 Zellen aus der gd T-Zell-Fraktion entnommen und in 1,5 ml FACS-Tubes überführt. Nach zweimaligem Waschen mit 200 µl FACS-Puffer bei 250 x g wurden die Zellen zunächst in PBS mit einem fluoreszierenden Antikörper, der an aminreaktive Gruppen

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