Effekte synthetischer Retinoid-Rezeptor-Liganden auf IL-17 produzierende γδ T-Zellen in der experimentellen Gallengangatresie

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AUS DER ARBEITSGRUPPE DES FORSCHUNGSLABORS DER KINDERCHIRURGIE DER MEDIZINISCHEN HOCHSCHULE HANNOVER

Effekte synthetischer

Retinoid-Rezeptor-Liganden

auf IL-17 produzierende gd T-Zellen in der experimentellen Gallengangatresie

DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER MEDIZIN IN DER MEDIZINISCHEN HOCHSCHULE HANNOVER

VORGELEGT VON

NORA MÖHN

AUS HASELÜNNE HANNOVER 2019

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Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule: 21.01.2020 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns Betreuer: Prof. Dr. med. Claus Petersen 1. Referent /in: PD Dr. med. Burkhard Rodeck 2. Referent/in: Prof. Dr. med. Frank Lehner Tag der mündlichen Prüfung: 21.01.2020

Prüfungsausschuss

Vorsitz: Prof. Dr. med. Hermann Haller 1. Prüfer/in: Prof. Dr. sc. hum. Armin Koch 2. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Martin Sauer

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3 Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG ... 6

1.1. DAS KRANKHEITSBILD DER GALLENGANGATRESIE ... 6

1.1.1. Definition ... 6

1.1.2. Untergruppen der Gallengangatresie ... 6

1.1.3. Klinik und Diagnostik ... 7

1.1.4. Ätiologie und Pathogenese ... 8

1.1.5. Therapieoptionen ... 9

1.2. GALLENGANGATRESIE IM TIERMODELL ... 10

1.2.1. Anfänge ... 10

1.2.2. Viral induzierte Gallengangatresien ... 11

1.2.3. Das RRV-Mausmodell ... 11

1.3. IMMUNREAKTION IN DER GALLENGANGATRESIE ... 13

1.3.1. Das Zytokin IL-17 als pathogenetischer Faktor bei der Gallengangatresie ... 13

1.3.2. Produzenten von IL-17 ... 14

1.3.3. gd T-Zellen und IL-17 Produktion ... 15

1.3.4. Il-17 produzierende gd T-Zellen in der Gallengangatresie als Therapieansatz ... 15

2. FRAGESTELLUNG ... 18

3. MATERIAL UND METHODEN ... 19

3.1. VERSUCHSTIERE ... 19

3.1.1. Versuchstierhaltung ... 19

3.2. IN VIVO VERSUCHE:WIRKUNG VON AM80 IM TIERMODELL DER GALLENGANGATRESIE ... 20

3.3. IN VIVO VERSUCHE:BEHANDLUNG BA-POSITIVER TIERE MIT AM80,VERGLEICH VON ÜBERLEBENS-UND GEWICHTSKURVEN BEHANDELTER UND UNBEHANDELTER TIERE ... 21

3.4. SERUM-CHEMIE... 24

3.5. HISTOLOGIE ... 24

3.6. IMMUNHISTOLOGIE ... 24

3.7. ZELLKULTUR ... 25

3.7.1. Allgemeine Zellkulturbedingungen ... 25

3.7.2. Zellzahlbestimmung ... 25

3.7.3. Puffer und Medien ... 25

3.8. ZELLGEWINNUNG UND -AUFBEREITUNG ... 26

3.8.1. Isolation von gd T-Zellen Zellen aus Lymphknoten und Milz ... 26

3.8.2. Isolation von leberinfiltrierenden Leukozyten ... 26

3.8.3. MACS-Verfahren ... 27

3.8.4. Isolation von Leukozyten mittels Percoll-Gradient ... 28

3.9. ÜBERPRÜFUNG DER REINHEIT DER gdT-ZELL-KULTUR MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE ... 29

3.9.1. Material und Reagenzien ... 29

3.9.2. Durchführung der Reinheitskontrolle ... 29

3.10. KULTUR UND STIMULATION ... 31

3.11. APOPTOSE-UND NEKROSE-BESTIMMUNG ... 32

3.12. ENZYM-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) ... 33

3.13. INTERLEUKIN-17ELISA ... 33

3.14. INTERFERON-gELISA ... 34

3.14.2. Durchführung ... 34

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3.15. CHARAKTERISIERUNG DER T-ZELL-VERTEILUNG INKL. DES ANTEILS IL-17 POSITIVER gdT-ZELLEN MITTELS

DURCHFLUSSZYTOMETRIE ... 34

3.15.1. Oberflächenfärbung ... 34

3.15.2. Intrazelluläre Zytokinfärbung ... 35

3.16. CYTOMETRIC BEAD ARRAY (CBA) ... 36

3.16.2. Durchführung ... 36

3.17. RNAAUFREINIGUNG ... 37

3.17.2. Durchführung ... 37

3.18. BESTIMMUNG DER RNA-KONZENTRATION ... 38

3.19. REVERSE-TRANSKRIPTION: CDNASYNTHESE ... 39

3.19.2. Durchführung ... 39

3.20. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) ... 39

3.21. QUANTITATIVE REAL-TIME-PCR(QRT-PCR) ... 40

3.21.1. Primer ... 40

3.21.2. Housekeeping-Gen GAPDH ... 40

3.21.4. Durchführung ... 41

3.21.5. Auswertung der Daten ... 42

3.22. STATISTISCHE AUSWERTUNG UND ERSTELLEN VON GRAPHEN ... 42

4. ERGEBNISSE ... 43

4.1. TCRgd-STIMULATION,CD28-CO-STIMULATION UND IL-23 INDUZIEREN IL-17PRODUKTION VON gd T-ZELLEN IN VITRO 43 4.1.1. Das in vitro System ... 43

4.1.2. AM80 inhibiert die IL-17-Achse in gd T Zellen in vitro ... 47

4.2. AM80 SUPPRIMIERT DIE IL-17PRODUKTION VON LEBERINFILTRIERENDEN gdT-ZELLEN AUS MÄUSEN MIT GALLENGANGATRESIE ... 55

4.2.1. Wirkung von AM80 auf die IL-17 Produktion pathogener gd T-Zellen ex vivo ... 55

4.3. WIRKUNG VON AM80 IM TIERMODELL DER GALLENGANGATRESIE IN VIVO ... 56

4.3.1. Auswirkung der AM80-Behandlung auf den Krankheitsverlauf der Tiere... 56

4.3.2. Auswirkung der AM80-Behandlung auf die hepatische Inflammation ... 61

5. DISKUSSION ... 64

5.1. SUPPRESSION VON IL-17 DURCH RETINOIDE ... 64

5.2. ETABLIERUNG DER ZELLKULTUR FÜR gdT-ZELLEN ... 65

5.3. DOSISABHÄNGIGE SUPPRESSION DER IL-17PRODUKTION VON gdT-ZELLEN DURCH RETINOIDE ... 67

5.3.1. Dosisabhängige Reduktion von IL-17A, IL-17F, IFN-g sowie reziproke Induktion von IL-4 in gd T Zellen durch AM80 ... 67

5.3.2. Reduktion der il17 und RORgt mRNA in der gd T-Zell Kultur durch AM80 ... 68

5.3.3. Reduktion der Anzahl IL-17-produzierender gd T-Zellen nach Behandlung mit AM80 ... 69

5.3.4. Wirkung von AM80 auf Leukozyten erkrankter Tiere aus dem BA-Tiermodell (ex vivo) ... 69

5.4. ROLLE IL-17 PRODUZIERENDER gdT-ZELLEN IN DER EXPERIMENTELLEN BA ... 71

5.5. EFFEKTE DER RETINOIDE IN DER EXPERIMENTELLEN BA ... 73

5.5.1. Anzahl GR-1 positiver Zellen in der murinen Leber wird durch Behandlung mit AM80 signifikant reduziert ... 73

5.5.2. Prophylaktisch mit AM80 behandelte Mäuse überleben tendenziell länger und weisen ein höheres Gewicht auf ... 73

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5.6. GRENZEN DES TIERMODELLS ... 76

6. ZUSAMMENFASSUNG ... 77

7. LITERATURVERZEICHNIS ... 79

8. LEBENSLAUF ... 88

9. ANHANG ... 91

9.1. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 91

9.2. MATERIALIEN ... 92

9.2.1. Geräte und Pipetten ... 92

9.2.2. Software ... 92

9.2.3. Verbrauchsmaterialien ... 92

9.2.4. Zytokine ... 95

9.2.5. Kits... 95

9.2.6. Antikörper ... 96

9.2.7. Primer ... 97

9.2.8. Beobachtungsbogen ... 98

10. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS ... 99

10.1. ABBILDUNGEN ... 99

10.2. TABELLEN ... 100

11. EINGEREICHTES MANUSKRIPT ... 101

12. DANKSAGUNG ... 126

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6 1. Einleitung

1.1.Das Krankheitsbild der Gallengangatresie

1.1.1. Definition

Die Gallengangatresie (biliary atresia, BA) ist eine seltene Erkrankung des Neugeborenen, deren Inzidenz in Mitteleuropa ca. 1:18000 beträgt. In Deutschland treten zwischen 35 und 38 Fälle pro Jahr auf und stellt die häufigste Indikation für eine pädiatrische Lebertransplan- tation dar¹. Sie manifestiert sich innerhalb der ersten Lebenswochen durch eine ätiologisch nicht geklärte fortschreitende entzündliche Veränderung der Gallengänge^2,3. Im klinischen Verlauf dominiert das Bild des cholestatischen Ikterus, während die Leber kontinuierlich fib- rotisch umgebaut wird. Bei Fortschreiten der Erkrankung kommt es zum vollständigen Um- bau der Leber, sodass schließlich das Stadium der Zirrhose mit letztendlich letal verlaufen- den Folgen des Leberversagens und der portalen Hypertension eintritt⁴.

1.1.2. Untergruppen der Gallengangatresie

Anhand von klinischen und morphologischen Kriterien wurde die BA historisch in zwei große Gruppen unterteilt. Dabei treten ca. 90 % der Gallengangatresien isoliert auf. Die entzündli- che Veränderung der Gallengänge scheint hier sehr wahrscheinlich erst postnatal oder zu- mindest zu einem sehr späteren Zeitpunkt in der embryonalen Entwicklung zu beginnen, da kein anderes Organsystem betroffen ist^4,2,5. Die übrigen 10 % wurden als embryonale Gal- lengangatresie bezeichnet und der sogenannten syndromalen Form zugerechnet, da die BA hier mit anatomischen Veränderungen wie z.B. Polysplenie, Situs inversus oder kardialen Fehlbildungen einhergeht und die Cholestase bereits bei der Geburt besteht. Als Ursache dieses „biliary atresia splenic malformation (BASM) syndrom“ wird ein embryonaler Entwick- lungsdefekt während der Differenzierung der Leberplatte vermutet^6,7. Neuere Untersuchun- gen zeigen, dass die Gruppe der an Gallengangatresie erkrankten Kinder mit weiteren kongenitalen Anomalien in drei Unterformen aufgeteilt werden kann. Neben dem BASM- Syndrom kann die Gallengangatresie auch mit anderen eigenständigen Syndromen wie dem Katzenaugen-Syndrom, welches auf einer chromosomalen Aberration beruht, auftreten.

Zudem scheint es eine Assoziation mit nicht-syndromalen kongenitalen Fehlbildungen wie der Ösophagusatresie oder der anorektalen Atresie zu geben, welche nicht zum BASM ge- zählt werden⁵. Allen Formen ist gemein, dass definitionsgemäß ein vollständiger und irrever- sibler Verschluss der extrahepatischen Gallengänge bedingt durch einen fibrotischen Umbau

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vorliegt⁴ bzw. dass der extrahepatische Anteil des Gallengangsystems atrophiert ist⁵. Geson- dert zu nennen ist die zystische Gallengangatresie⁸ bei der zystische Formationen und krankhaft veränderte intrahepatische Gallengänge vorliegen, welche häufig in pränatalen Ultraschalluntersuchungen zu erkennen sind⁵.

1.1.3. Klinik und Diagnostik

Die Gallengangatresie manifestiert sich im Säuglingsalter mit unspezifischen Symptomen, die auf den zunehmenden Umbau des Leberparenchyms zurückzuführen sind. Die betroffenen Neugeborenen präsentieren sich mit einem über den vierzehnten Lebenstag hinaus beste- henden Ikterus, entfärbtem, acholischen Stuhl und dunklem Urin⁹. Weiterhin kann sich einige Zeit nach der Geburt eine Gedeihstörung entwickeln, welche auf eine ungenügende Ab- sorption von Fetten zurückgeführt werden kann. Hieraus resultiert ein Mangel an den fett- löslichen Vitaminen D, A, E und K. Letzteres spielt eine entscheidende Rolle in der Gerin- nungskaskade, weshalb ein Vitamin K-Mangel zu einer erhöhten Blutungsneigung und im schlimmsten Fall sogar zu intrakraniellen Blutungen führen kann⁹.

Da auch etwa die Hälfte aller gesunden Kinder einen passageren Neugeborenen-Ikterus auf- weist, bleibt die Gallengangatresie zunächst oft unentdeckt. Jeder Neugeborenen-Ikterus, der länger als zwei Wochen bzw. bei Muttermilchernährung länger als drei Wochen besteht, sollte daher laborchemisch und apparativ sorgfältig abgeklärt werden¹⁰. Bei der BA ist der Anteil des direkten Bilirubins am Gesamtbilirubin im Serum z.T. deutlich erhöht. Neben den übrigen Cholestaseparametern wie der Gamma-Glutamyltransferase oder der alkalischen Phosphatase können auch die Aminotransferasen (GPT und GOT) als Parameter des Leber- zellschadens ansteigen. Die weitere Labordiagnostik sollte zudem eine Bestimmung der Le- berfunktionsparameter und einen serologischen Ausschluss der häufigsten hepatotropen Viren beinhalten^4,11. In der abdominellen Sonographie ist die Gallenblase der betroffenen Kinder kontrahiert bzw. nicht darstellbar und es kommt bei Nüchternheit nicht zu einer Fül- lung. Zusätzlich können mit dieser Untersuchung mögliche weitere intraabdominelle Fehlbil- dungen, wie sie bei der syndromalen BA vorliegen, identifiziert werden^4,11. Vollständig aus- geschlossen werden kann die Gallengangatresie nur mit Hilfe der offenen Cholangiographie, die eine Kontrastmitteldarstellung der Gallengänge erlaubt¹¹. Nichtinvasive Verfahren wie die hepatobiliäre Sequenzszintigrafie (HBSS) oder die Bildgebung mittels MRT bieten bisher keine ausreichende Spezifität bzw. ein zu geringes Auflösungsvermögen um auf die offene Cholangiographie verzichten zu können¹². An wenigen Zentren werden auch bei Säuglingen

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routinemäßig endoskopische retrograde Cholangiopankreatikographien (ERCPs) durchge- führt, welche z.T. einen Ausschluss der Verdachtsdiagnose ermöglichen und so den Kindern eine Laparotomie ersparen. Bei Vorliegen einer BA käme der Ductus hepaticus communis in der ERCP nicht oder nur distal zur Darstellung¹².

1.1.4. Ätiologie und Pathogenese

Sowohl Ätiologie als auch Pathogenese der Gallengangatresie sind nach wie vor nicht ge- klärt. Die favorisierte Theorie für die Entstehung der isolierten Gallengangatresie ist, dass es auf dem Boden einer bisher nicht näher identifizierten genetischen Prädisposition durch Infektion mit einem vermutlich hepatotropen Virus zu einer Autoimmunreaktion kommt¹³. Die Gallengänge werden durch die Virusinfektion angegriffen und es kommt daraufhin zu einer überschießenden bzw. einer autoimmun bedingten Reaktion des Abwehrsystems gegen das Gallengangepithel, woraus schließlich eine fortschreitende Zerstörung und ein Ver- schluss der Gallengänge resultiert¹⁴. Diese Hypothese wird durch den häufigen Nachweis von hepatotropen Viren in Leberbiopsien erkrankter Kinder gestützt¹, jedoch ist eine Kausalität retrospektiv nicht beweisbar. Interessanterweise tritt die Gallengangatresie ausschließlich bei Neugeborenen auf somit manifestiert sich die Autoimmunreaktion nur in einem kurzen Zeitraum nach der Geburt, was für eine Besonderheit des neonatalen, sich in Reifung befind- lichen Immunsystems spricht¹⁵. Für eine genetische Disposition bei der Krankheitsentste- hung spricht, dass die Prävalenz der BA zwischen unterschiedlichen Ethnien variiert. So er- krankt in Taiwan eins von 5.000 neugeborenen Kindern an der isolierten Gallengangatresie, in Nordeuropa hingegen nur eins von 20.000⁵. Bisher gibt es keine Hinweise darauf, dass Faktoren wie das Geschlecht des Kindes oder das Alter der Mutter sowie beeinflussbare No- xen wie ein etwaiger Alkohol- oder Nikotinkonsum der Mutter während der Schwanger- schaft eine Rolle bei der Entstehung der Gallengangatresie spielen¹⁶. Allerdings waren man- che Kinder mit BASM-Syndrom möglicherweise intrauterin durch mütterlichen Diabetes oder eine Thyreotoxikose der Mutter belastet⁵.

Problematisch bei der Frage nach Ätiologie und Pathogenese der Erkrankung ist, dass die Gallengangatresie erst diagnostiziert werden kann, wenn sie sich in einem weit fortgeschrit- tenen Stadium befindet. So können z.B. humane Leberproben erst zum Zeitpunkt der Kasai- Operation und damit Wochen nach Entstehung der Krankheit auf Viren untersucht werden und somit kein Kausalzusammenhang bewiesen werden^17,18. Durch die Grundlagenforschung in tierexperimentellen Modellen hingegen können Erkenntnisse zu den frühen Stadien der

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Gallengangatresie und ihren Entstehungsfaktoren untersucht und im Sinne der translationa- len Forschung in der klinische Medizin eingesetzt werden (siehe Kap. 1.2.) .

1.1.5. Therapieoptionen

Ohne Therapie versterben Patienten mit Gallengangatresie innerhalb der 2 ersten Lebens- jahre. Aktuell besteht die primäre Therapie der Erkrankung in einer nach ihrem Erstbe- schreiber Morio Kasai benannten Operation, der Hepatoporto-Enterostomie¹⁹. Bei dieser Operationstechnik werden Gallenblase und die Reste der extrahepatischen Gallenwege chi- rurgisch entfernt und eine biliodigestive Anastomose in Y-Roux-Technik als neues Abflusssys- tem zur Ableitung der Galle angelegt^9,19. Die Operation kann allerdings nicht den intrahepatischen Entzündungsprozess aufhalten, schafft aber die Voraussetzungen für den Abfluss der Galle und kann so z.T. einen vollständigen Rückgang des Ikterus sowie eine Wiederherstel- lung der exkretorischen und sekretorischen Leberfunktion ermöglichen⁴. Kinder die erst nach dem 90. Lebenstag operiert werden, haben ein weniger gutes Outcome als diejenigen, die vor dem 60. Lebenstag behandelt werden²⁰.

Nach wie vor ist der Nutzen einer postoperativen Behandlung mit Glukokortikoiden unklar.

Auf der Grundlage einer möglichen entzündlich-autoimmunen Genese der Erkrankung wurden und werden diese Stoffe wegen ihrer anti-inflammatorischen Wirkung häufig eingesetzt²¹. Eine Metaanalyse von Sarkhy, Schreiber et al. aus dem Jahr 2011 ergab keinen signi- fikanten positiven Effekt einer postoperativen Glukokortikoidtherapie gegenüber der her- kömmlichen Therapie sowohl in Bezug auf eine Normalisierung des Bilirubin Gehalts im Se- rum als auch bezüglich einer Verzögerung des Zeitpunktes der Lebertransplantation²². Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen die Autoren der START-Studie, in der eine hochdosierte postoperative Glukokortikoidtherapie nach sechs Monaten nicht zu einem signifikant besse- ren Outcome im Vergleich zu Placebo führte. Außerdem traten unerwünschte postoperative Ereignisse wie Darmperforationen oder Anastomoseninsuffizienzen in der Steroidgruppe zwar nicht häufiger aber signifikant früher auf als in der Placebogruppe²³.

Trotz der etablierten Operationstechnik und Ansätzen in der adjuvanten Therapie bleibt die Gallengangatresie die häufigste Indikation für eine Lebertransplantation im Kindesalter²⁴. Gelingt es operativ nicht die Voraussetzungen für den Galleabfluss zu schaffen, ist eine Le- bertransplantation schon sehr frühzeitig notwendig, um das Überleben der Kinder zu si- chern²⁴. Da die Kasai-Operation selbst den Entzündungsprozess in der Leber nicht beeinflussen kann, setzt sich der Entzündungsprozess fort⁴ und kann zur portalen Hypertension mit

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Aszites und Ösophagusvarizenblutungen sowie einem akuten Leberversagen oder einem hepatopulmonalen Syndrom führen^4,11. Der vermeintlich autoimmunologische Entzün- dungsprozess ist letztendlich selbst limitierend und bis heute medikamentös nicht sicher zu beeinflussen, sodass eine Lebertransplantation in den meisten Fällen und auf lange Sicht nicht zu vermeiden ist.

Zusammenfassend ist die Prognose der Gallengangatresie aufgrund früherer Diagnosestel- lungen und einer Anbindung der Patienten an spezialisierte Zentren mit etablierten Operati- ons- und Nachsorgeverfahren heutzutage deutlich verbessert. In erfahrenen Zentren (>5 Fälle pro Jahr) liegt die 10-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit BA bei über 90 %. Auch Fortschritte bei der Lebertransplantation tragen dazu bei, dass ca. 90% der Kinder, die mit Gallengangatresie geboren werden, bis ins Erwachsenenalter überleben¹¹.

Da die bisherigen Therapieoptionen rein symptomatisch sind und eine Lebertransplantation immer eine nachfolgende Immunsuppression mit vielfältigen Nebenwirkungen wie Nephro- und Neurotoxizität oder auch posttransplantationslymphoproliferativen Erkrankungen er- fordert, ist es weiterhin von großer Bedeutung die Ätiologie der BA näher zu erforschen und den Weg für mögliche kausale Therapien zu ebnen.

1.2.Gallengangatresie im Tiermodell

1.2.1. Anfänge

Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ist die humane Gallengangatresie schon weit fortge- schritten, sodass die frühen morphologischen und immunologischen Veränderungen in Le- ber und Gallengängen nicht untersucht werden können²⁵. In den 1960er Jahren wurde daher begonnen, die Erkrankung in Versuchstieren nachzustellen²⁵. Zunächst dominierten chirurgi- sche Herangehensweisen zur Induktion einer Cholestase. So führte beispielsweise Dr. Spitz eine intrauterine Ligatur des Ductus choledochus bei fetalen Lämmern durch, welche eine Cholestase und zystische Veränderungen der Gallengänge zum Zeitpunkt der Geburt zur Fol- ge hatte²⁶. Zwar konnten mit einer postnatalen Ligatur des Ductus choledochus sowie der Injektion von sklerosierenden Stoffen in das Gallengangssystem verschiedener Tierarten die metabolischen Veränderungen einer neonatalen Cholestase nachempfunden werden, zur Simulation des langsam fortschreitenden Entzündungsprozesses in den extra- und intrahepatischen Gallengängen waren diese Verfahren allerdings weniger geeignet⁵, sodass die For-

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schung sich v.a. ab den 1980er Jahren auf die Etablierung von Mausmodellen konzentrier- te²⁵.

1.2.2. Viral induzierte Gallengangatresien

In den ersten Mausmodellen wurden Mäuse intraperitoneal mit Reoviren verschiedener Se- rotypen, wie z.B. dem Typ 3 (Abney), infiziert^27,28. In diesen Studien konnte zwar eine Ent- zündungsreaktion in Leber und Gallengängen mit nachfolgendem Ikterus induziert werden, doch eine tatsächliche Atresie der Gallengänge war nicht nachweisbar²⁵. Die Induktion einer Gallengangatresie-ähnlichen Obstruktion der extrahepatischen Gallengänge gelang erstmals der Gruppe um Riepenhoff-Talty im Jahr 1993²⁹. In ihrem Tiermodell wurden neonatale BALB/c-Mäuse 48 Stunden nach der Geburt oral mit Rhesus Rotaviren (RRV) infiziert²⁹. Etwa die Hälfte der infizierten Tiere entwickelte im Verlauf einen Ikterus und die meisten dieser Tiere verstarben innerhalb von drei Wochen. Histologisch zeigten sich intrahepatische ent- zündliche Infiltrate und Gallengangsproliferate wie sie auch bei der humanen Gallengang- atresie auftreten²⁵.

1.2.3. Das RRV-Mausmodell

Ausgehend von den Ergebnissen der Gruppe um Riepenhoff-Talty wurde das RRV- Mausmodell in Hannover weiterentwickelt³⁰. Es erfolgte die intraperitoneale Injektion des RRV in 24 bis 48 Stunden alte BALB/c-Neonaten³⁰. Hierdurch konnte die Inzidenz der cholestatischen Tiere zunächst auf etwa 60 %³¹ und später auf 80%³² erhöht werden, wobei die Symptome wie Ikterus, acholischer Stuhl und öliges Fell zwischen dem vierten und elften Tag nach Infektion auftraten³². In der makroskopischen und mikroskopischen Untersuchung der Organe nach dem 14. Lebenstag zeigten sich neben einer fleckigen Leberoberfläche sowohl lang- als auch kurzstreckige Atresien des Ductus choledochus²⁵. Histologisch lässt sich fünf bis sieben Tage nach der Injektion des Virus eine Infiltration der intra- und extrahepatischen Gallengänge durch neutrophile Granulozyten und Monozyten erkennen (Abbildung 1). Das entzündliche Bild geht eine Woche später in eine progressive Fibrose und beginnende Okklu- sion der Gallengänge über und endet in einer irreversiblen Gallengangatresie^32,30,33. In den nachfolgenden Jahren der Arbeit mit dem RRV-Tiermodell als Grundlage zur Erforschung der humanen BA stellte sich heraus, dass vier Faktoren eine Schlüsselrolle im Modell spielen: 1.

der verwendete Mausstamm 2. das verwendete Virus 3. der Zeitpunkt der Infektion und 4.

die Virusdosis. Um eine hohe Erkrankungsinzidenz von mindestens 80%-90% zu erreichen,

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Dilatation des Gallengangs sowie das Auftreten von Gallenansammlungen („bile lakes“) auf der Leberoberfläche als Folge des behinderten Gallenabflusses. Rechts: Die Histologie zeigt Gewebeschnitte in H&E Färbung zu drei verschiedenen Zeitpunkten gesunder Mäuse in der oberen Reihe und erkrankter in der unteren Reihe. Die schwarzen Pfeile kennzeich- nen die Gallengänge mit peribiliärer Leukozyteninfiltration in BA+ Tieren

1.3.Immunreaktion in der Gallengangatresie

1.3.1. Das Zytokin IL-17 als pathogenetischer Faktor bei der Gallengangatresie Trotz der wachsenden Erkenntnisse zur Ätiologie und Pathogenese der Gallengangatresie, die v.a. mit Hilfe des Mausmodells gewonnen werden konnten, ist die Pathogenese bis heute nicht abschließend geklärt. Die favorisierte Hypothese besteht darin, dass in den Lebern der betroffenen Kinder ein möglicherweise viral getriggerter progressiver, inflammatorischer Prozess stattfindet, der in einen autoimmunen Prozess übergeht.

Bei autoimmunen Prozessen spielen Zytokine als Mediatoren der Entzündungsreaktion eine wichtige Rolle. Ein solches inflammatorisches Zytokin ist IL-17, welches die Produktion von inflammatorischen Zytokinen, Adhäsionsmolekülen und akute Phase Proteinen verstärkt und vor allem neutrophile Granulozyten zum Ort der Entzündung lockt³⁸. Physiologisch ist IL- 17 in der Infektabwehr insbesondere gegen extrazelluläre Bakterien wichtig³⁹, z.B. durch die Induktion der Expression von Chemokinen wie CXCL1, CXCL2, oder CXCL8 auf verschiedenen Zellen und andererseits auch durch die direkte Mobilisierung der neutrophilen Granulozyten und ihre anschließende Aktivierung⁴⁰.

Neben dieser physiologischen Rolle wurde IL-17 aber auch bei verschiedenen humanen Le- bererkrankungen wie der primären biliären Zirrhose und der T-Zell vermittelten Hepatitis bzw. deren murinen Modellen und bei Autoimmunerkrankungen wie dem Morbus Crohn oder der Psoriasis als pathogener Faktor identifiziert^40,41. Darüber hinaus konnte in den fol- genden Krankheitsmodellen unterschiedlicher autoimmuner Erkrankungen eine wichtige Rolle von IL-17 nachgewiesen werden⁴²:

In einem Model der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA), welches als Mausmodell für die rheumatoide Arthritis verwendet wird, konnte nachgewiesen werden, dass IL-17 produzierende Zellen sich in Lymphknoten und Gelenken infizierter Mäuse sammeln und vermeh- ren⁴³. Depletiert man die Zellen mit Hilfe von Antikörpern, sinken sowohl die Inzidenz der

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Erkrankung als auch ihre Schwere⁴⁴. Auch in Mausmodellen zu neuroinflammatorischen Pro- zessen konnte eine pathogene Rolle von IL-17 nachgewiesen. Zwar sind Il-17 produzierende Zellen nicht allein in der Lage eine Krankheit wie z.B. die experimentelle autoimmune Enze- phalomyelitis (EAE), welche als Mausmodell für die Multiple Sklerose fungiert, auszulösen, doch zeigen Mäuse ohne IL-17 produzierende Zellen eine weniger schwere Form der Erkran- kung⁴⁵.

1.3.2. Produzenten von IL-17

Das Zytokin IL-17 wird von diversen Immunzellen des angeborenen und erworbenen Immun- systems produziert. Hier sind u.a. natürliche Killerzellen (NK-Zellen), neutrophile Granulozy- ten oder gd T-Zellen zu nennen³⁹. Vor einigen Jahren konnten die sogenannten Th17-Zellen, eine Unterform der T-Helfer-Lymphozyten, als einer der wichtigsten Produzenten von IL-17 charakterisiert werden. Der sog. Master-Transkriptionsfaktor RORgt ist dabei entscheidend für die Induktion der IL-17-Transkription und die Th17-Zell-Differenzierung⁴⁶. Unter anderem beim Morbus Crohn und der Psoriasis wurden Th17-Zellen als Hauptakteure der pathogenen autoimmunen Reaktion identifiziert⁴¹. Auch konnten mehrere Studien die Bedeutung von Th-17-Zellen bei autoimmunen Lebererkrankungen nachweisen^47-49. So korreliert beispiel- weise bei Patienten mit Autoimmunhepatitis die Anzahl der Th-17-Zellen im peripheren Blut und in der Leber mit der Schwere der hepatischen Inflammation⁴⁷.

Grundsätzlich regulieren Zytokine des angeborenen Immunsystems die Differenzierung von T-Helfer Zellen. Die Entwicklung von naiven T-Zellen zu Th-17-Zellen wird durch Interleukin 6 (IL-6) und dem sog. Transforming growth factor b (TGFb) vermittelt⁵⁰. Im Speziellen induziert TGFb die Entwicklung naiver T-Zellen in regulatorische T-Zellen und IL-6 lenkt das Transkrip- tions-Programm so um, sodass Th-17-Zellen entstehen⁵¹. Das Zytokin IL-23 wirkt dabei als Stabilisator des Th-17 Phänotyps⁵¹.

Auch in der Gallengangatresie bzw. deren Mausmodell spielt IL-17 eine wichtige Rolle. Dabei konnte eine IL-17 Expression vor allem in Zellen der periduktalen Region nachgewiesen werden⁵². Eine entscheidende Beobachtung in diesem Zusammenhang ist, dass im Mausmodell der Gallengangatresie nicht die klassischen Th-17-Zellen die IL-17-Produzenten sind. Statt- dessen ist die IL-17 Produktion hier ausschließlich auf sogenannte gd T-Zellen beschränkt, während Th-17-Zellen gänzlich fehlen⁵².

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15 1.3.3. gd T-Zellen und IL-17 Produktion

gd T-Zellen sind bei allen Wirbeltieren die ersten T-Zellen, die sich im Organismus entwickeln. So dominieren z.B. bei Rindern die gd T-Zellen das T-Zell-Kompartiment während des ersten Lebensjahres⁵³. Im Gegensatz zu ab T-Zellen sind gd T-Zellen als vergleichsweise oli- goklonal zu bezeichnen, das heißt sie besitzen in Abhängigkeit ihrer Lokalisation im Gewebe eine geringere Diversität ihrer T-Zell-Rezeptoren. Der frühe Zeitpunkt ihrer Entwicklung legt den Schluss nahe, dass eine vorrangige Aufgabe der gd T-Zellen der Schutz des Neugebore- nen Organismus mit noch nicht vollständig entwickelter adaptiver Immunität ist⁵⁴.

Allerdings hat sich auch gezeigt, dass IL-17 produzierende gd T-Zellen eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen spielen. Als Nachweis dienten u.a. die oben erwähnten IL-17 vermittelten autoimmunen Mausmodellen (CIA und EAE). Es wird au- ßerdem angenommen, dass IL-17+ gd T-Zellen die Entzündung bei der Coxsackie-B1 induzierten Myokarditis begünstigen. Eine Behandlung mit anti-IL-17-Antikörpern milderte im entsprechenden Mausmodell die Krankheitsschwere und verbesserte das Überleben der Tiere³⁸. Neben ihrer Rolle bei den klassischen Autoimmunerkrankungen vermitteln Il-17 produzierende gd T-Zellen aber auch die Inflammation während einer Infektion und unterstützen eine adäquate Immunantwort des Organismus. Beispielsweise bei der exogen-allergischen Alveo- litis persistieren Bakterien bei Abwesenheit von Il-17 produzierenden gd T-Zellen länger und es entwickelt sich eine deutlich stärkere Entzündung und später auch Fibrose der Lunge³⁸.

1.3.4. Il-17 produzierende gd T-Zellen in der Gallengangatresie als Therapiean- satz

Da das Zytokin IL-17 als Entzündungsstoff im BA-Mausmodell in kranken Tieren verstärkt nachweisbar ist, wobei gd T-Zellen und nicht Th-17-Zellen als Produzenten von IL-17 identifiziert worden sind, stellen gd T-Zellen in der Gallengangatresie möglicherweise die entschei- denden Zellen der fehlregulierten Immunantwort und einen wichtigen Faktor bzgl. der Pa- thogenese dar.

In Vorarbeiten konnte unsere Gruppe zeigen, dass eine Antikörper basierte Anti-IL-17- Therapie den Krankheitsverlauf der experimentellen Gallengangatresie verbessert⁵². Günsti- ger und sicherer als eine Antikörpertherapie ist eine pharmakologische Hemmung der IL-17 Produktion mit Präparaten, die bereits bei anderen Erkrankungen klinischen Einsatz gefunden haben. Eine hierfür in Frage kommende Stoffgruppe sind Retinoide.

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Sowohl natürliche als auch synthetische Retinoide wurden und werden ebenfalls in verschiedenen autoimmunen Krankheitsmodellen getestet. Kwok et al. untersuchten die Aus- wirkungen von ATRA auf die Entwicklung der rheumatoiden Arthritis und die pathophysiolo- gischen Mechanismen, die hinter der ATRA-Wirkung stehen⁶¹. Als Ergebnis konnten die For- scher feststellen, dass eine intraperitoneale Injektion von ATRA den Krankheitsverlauf der Tiere verbesserte und die Inzidenz der Arthritis verminderte. Die Anzahl der IL-17 produzierenden T-Zellen zeigte sich deutlich reduziert, wobei die regulatorischen T-Zellen bei den ATRA-behandelten Mäusen zunahmen⁶¹.

Im Tiermodell der Vaskulitis reduzierte eine tägliche Gabe von 1mg/kg bzw. 4mg/kg AM80 deutlich die Ansammlung von inflammatorischen Zellen in der Aorta und den Koronararte- rien und somit die histologischen Merkmale der Vaskulitis. Mit einer prophylaktischen, nicht aber mit einer therapeutischen Gabe von AM80 gelang es den Vaskulitis-Score dosisabhän- gig zu verbessern. Auf Zellebene konnte die verstärkte Migration von neutrophilen Gra- nulozyten und ihre Elastasefreisetzung im Modell der Vaskulitis durch den Einsatz von AM80 vermindert werden⁶².

Auch in der experimentellen, autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), einem Mausmodell der Multiplen Sklerose, waren Retinoide wirksam. Nach oraler Behandlung mit AM80 verzögerte sich das Auftreten der Symptome bei behandelten Mäusen deutlich und die Krankheits- schwere war im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant geringer. Weiterhin wurde gezeigt, dass die IL-17-Produktion von bereits differenzierten und zur IL-17-Sekretion stimulierten Th17-Zellen durch AM80 reduziert werden kann⁶³.

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18 2. Fragestellung

Die Gallengangatresie als Erkrankung des Neugeborenen ist hinsichtlich ihrer Ursachen und ihrer Pathogenese noch nicht abschließend erforscht, wobei sich jedoch deutliche Hinweise auf eine autoimmun-entzündliche Komponente bei der Entstehung der Krankheit finden¹⁴. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass als initiale Träger der Immunreaktion der Gallengangatresie IL-17 produzierende gd T-Zellen fungieren⁵². Unklar war, ob Retinoide die IL-17 Produktion von gd T-Zellen beeinflussen und in der experimentellen Gallengang- atresie einen therapeutischen Effekt haben können.

Das Ziel der Arbeit ist daher, zunächst ein in vitro System für gd T-Zellen zu entwickeln in dem diese IL-17 produzieren und hieran eine Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen AM80 und der IL-17-Produktion zu ermitteln. Anschließend gilt es die gewonnenen Erkenntnisse in vivo am Tiermodell anzuwenden um translational ggf. neue Therapien der Gallengangatresie zu schaffen.

Es leiten sich folgende Fragestellungen ab:

1. Was sind die optimalen Kulturbedingungen in Hinblick auf Stimulationszeit und Zugabe von Zytokinen um gd T-Zellen in vitro zur IL-17 Produktion anzuregen?

2. Kann AM80 die IL-17 Produktion der gd T-Zellen in der Zellkultur vermindern und wenn ja, gibt es eine Beziehung zwischen eingesetzter AM80-Dosis und Konzentration des Zy- tokins IL-17?

3. Hat AM80 einen Einfluss auf die Effektorfunktion geprimter Lymphozyten, die bereits im Tiermodell der BA die murine Leber infiltrierten?

4. Verbessert die Anwendung des Retinoids AM80 im Tiermodell der Gallengangatresie den Krankheitsverlauf der Tiere bzw. kann die Inzidenz der Erkrankung gesenkt werden?

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19 3. Material und Methoden

Die für die unterschiedlichen Methoden verwendeten Materialien wie z.B. Medien, Enzyme und Puffer werden in dem Abschnitt aufgeführt, in dem die jeweilige Methode beschrieben wird. Eine detaillierte Auflistung aller verwendeten Geräte, Reagenzien, Verbrauchsmateria- len, Antikörper, Zytokine und Primer-Sequenzen folgt im Anhang.

3.1.Versuchstiere

3.1.1. Versuchstierhaltung

Alle tierexperimentellen Studien dieser Arbeit wurden gemäß dem deutschen Tierschutzge- setz und der Europäischen Richtlinie 2010/63/EU durchgeführt. Die Gesundheitsüberwa- chung der Tiere wurde nach FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Association) Richtlinien durchgeführt. Alle tierexperimentellen Studien wurden vom Nds.

Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) genehmigt (Tierver- suchsantrag #12/0785 und #16/2164 + §4 2014/53). Die Tierhaltung erfolgte in den klimati- sierten Räumen des Zentralen Tierlaboratorium der MHH mit einem Lichtzyklus von 14:10 Stunden (hell:dunkel). Futter und Wasser standen ad libitum zur Verfügung.

Für das Tiermodell der experimentellen Gallengangatresie wurden adulte Tiere des Maus- stamms Balb/cAnNCrl im Alter von 6-8 Wochen von den Charles River Laboratories (Sulzfeld, Deutschland) bezogen. Die Tiere wurden im S2-Genlabor unter IVC-Bedingungen (individual- ly ventilated cages) gehalten. Bei Erreichen der Geschlechtsreife wurden sie in eine 2:1 Ver- paarung gesetzt (jeweils zwei Weibchen zu einem Männchen). Diese Verpaarung wurde nach einer Woche beendet. Trächtige Weibchen erhielten für die Aufzucht der Jungtiere einen eigenen Käfig. Männliche Tiere im Alter von 9 – 15 Wochen wurden ferner zur Gewinnung von Leukozyten genutzt. Jungtiere bis zu einem Alter von 14 Tagen wurden bei Versuchsen- de oder Erreichen der Abbruchkriterien (s. ergänzende Abbildung 1) dekapitiert. Dabei wurden Tiere der Kategorie 4 stets engmaschiger, d.h. 2-mal täglich kontrolliert und bei einem Übergang zu Kategorie 3 umgehend schmerzfrei euthanasiert. Die Tötung von älteren Tieren erfolgte durch zervikale Dislokation. Meine Mitarbeit an den tierexperimentellen Versuchen beschränkte sich auf den Zeitraum bis 07/2015 (TVA #12/0785), die nachfolgenden Experi- mente wurden durch Dr. Gertrud Vieten und Stephanie Dippel durchgeführt.

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Ergänzende Tabelle: Genehmigter Score der in vivo Versuche (#12/0785 und

#16/2164). Mäuse ab einem Punktwert von 3 wurden schmerzfrei euthanasiert.

Für alle in vitro Versuche wurden fünf bis sieben Wochen alte C57BL/6J Mäuse verwendet, die entweder der eigenen Zucht entstammten oder im Tierhaus bzw. bei Charles River be- stellt wurden. Diese Mäuse wurden im S1-Genlabor des zentralen Tierlabors der Medizini- schen Hochschule Hannover mit sterilisiertem Futter in einer sog. Barrierehaltung gehalten.

Die Tiere wurden in dem dafür vorgesehenen Raum des Labors von mir oder anderen Wis- senschaftlern mit Versuchstierkunde-Zertifikat zunächst durch cervikale Dislokation getötet.

Nach dem Einsprühen mit Ethanol (70%) wurden die Tiere auf einer Styroporplatte für die Präparation und Entnahme von Milz und Lymphknoten vorbereitet. Für einige durchflusszy- tometrische Untersuchungen wurden spezielle TCRgd reporter Mäusen von der AG um Im- mo Prinz (Immunologie, MHH) bezogen. Da die gd T-Zellen dieser speziellen Mäuse eine intrinsische grüne Fluoreszenz besitzen, lassen sie sich durchflusszytometrisch einfacher dar- stellen. Die Haltung der Tiere erfolgt ausschließlich durch die Mitarbeiter der AG Prinz.

3.2.In Vivo Versuche: Wirkung von AM80 im Tiermodell der Gallengangatresie Für alle in vivo Versuche wurde das etablierte und in der Einleitung beschriebene RRV- Mausmodell für die Gallengangatresie verwendet. In einer ersten in vivo Versuchsreihe wurden die BALB/c Neonaten innerhalb von 24 Stunden nach ihrer Geburt intraperitoneal mit

Punktwert Qualität Merkmale

6 Sehr aktiv Kräftig, neugierig, schnelle Bewegungen, Gewichtszu- nahme oder stabiles Gewicht, kein öliges Fell, kein Ikterus

5 Aktiv Neugierig, schnell, vereinzelte Aktivitätspausen, Ge- wichtszunahme oder stabiles Gewicht, kein öliges Fell, kein Ikterus

4 Eingeschränkt

aktiv

Reagiert auf Zuwendung, häufige Aktivitätspausen, stabiles Gewicht oder Gewichtsabnahme, leicht öliges Fell, sichtbarer Ikterus

3 Ruhig Desinteressiert an der Umwelt, seltene Aktivität, schläfrig, herabges. Nahrungsauf- und -annahme, Ge- wichtsabnahme, öliges Fell, sichtbarer Ikterus 2 Lethargisch Keine Aktivität, Verharren, keine Nahrungsauf- und

annahme, Gewichtsabnahme, stark öliges Fell, deutli- cher Ikterus

1 Moribund Keine Aktivität, Gewichtsabnahme, Atemschwierigkei- ten, Tod zu erwarten, stark öliges Fell, deutlicher Ikte- rus

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50 µl Rhesus Rotavirus infiziert. Durch eine intraperitoneale Virusapplikation innerhalb der ersten 24 Lebensstunden nach der Geburt entwickeln 80% der infizierten Tiere klinische Zei- chen der Gallengangatresie. Der verwendete Rotavirusstamm MMU18006 wurde ursprüng- lich von ATCC (American Type Culture Collection (Manassas, VA)) erworben und in der per- manenten embryonalen Rhesusaffennierenzelllinie MA104 angezüchtet und vermehrt. Der Titer der gewonnenen Virussuspension wurde nach Lindenbach und Kollegen⁶⁴ festgestellt.

Das Virus wurde aliquotiert und bei -80°C gelagert. Es wurde immer der gesamte Wurf eines Käfigs infiziert, wobei nur solche Würfe mit vier bis acht Jungtieren in den Versuch eingeschlossen wurden. Die infizierten Würfe wurden dann in eine Kontroll- und eine Behand- lungsgruppe eingeteilt und dementsprechend durch Tätowierung markiert. Die Tatsache, dass Kontroll- und Behandlungsgruppe zu demselben Wurf gehören, schließt aus, dass mög- liche Unterschiede im Überleben der Tiere aus Faktoren, wie zum Beispiel der unterschiedlichen Fürsorge der Mutter, resultieren. Der weitere Versuchsablauf gestaltete sich so, dass der Behandlungsgruppe ab dem ersten Lebenstag jeden zweiten Tag das Retinoid AM80 in der Dosis 1 µg (Volumen 50 µl) i.p. injiziert wurde. Die Kontrollgruppe erhielt stattdessen nur die Trägersubstanz CMC, in der das Retinoid gelöst wurde. Entsprechend des TVA erfolgte das Monitoring ein- bis mehrmals täglich. Dazu wurden die Tiere nach den klinischen Zei- chen der Gallengangatresie (Allgemeinzustand, Gewichtsverlauf, Ikterus und öliges Fell) be- gutachtet (s.Beobachtungsbogen, Kapitel 9.2.9.). Die Erfassung wurde bis zum Erreichen der Abbruchkriterien durchgeführt bzw. bis zum Tod aller erkrankten Tiere. Sowohl die überle- benden Jungtiere ohne Zeichen der Gallengangatresie als auch die Mutter wurden am Ende des Versuchs euthanasiert.

3.3.In Vivo Versuche: Behandlung BA-posi tiver Tiere mit AM80, Vergleich von Überlebens-und Gewichtskurven behandelter und unbehandelter Tiere Zweite Versuchsreihe nach Überarbeitung des Mausmodells:

Der Versuchsaufbau wurde insofern überarbeitet, als dass die intraperitoneale Infektion der BALB/c Neonaten nun mit einer Viruskonzentration von 2x10² PFU (Virusinoculum: 10µl RRV Stammlösung + 20µl PBS) erfolgte. Die Tiere wurden weiterhin innerhalb von 24 Stunden nach ihrer Geburt infiziert. Alle Tiere eines Wurfs wurden infiziert, wobei nur solche Würfe mit vier bis acht Tieren in den Versuch eingeschlossen wurden. Im Zuge der Injektion wurden die Tiere per Tätowierung einzeln markiert. Die Würfe wurden in dieser Versuchsreihe nicht aufgeteilt, sondern ein ganzer Wurf wurde als Behandlungs- bzw. Kontrollgruppe verwendet,

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da sich im Rahmen der ersten in vivo Versuchsreihe gezeigt hatte, dass die Ergebnisse verschiedener Würfe durchaus vergleichbar sind und die mütterliche Fürsorge nicht derart variiert, dass dies Überleben der Tiere stark beeinflusst würde.

Der Behandlungsgruppe wurde wie schon in der ersten Reihe der in vivo Versuche ab dem ersten Lebenstag 50 µl des Retinoids AM80 i.p. injiziert. Dabei enthielt eine Gabe AM80 1 µg der Substanz. Da das Körpergewicht der Tiere während eines Versuchs von ca. einem Gramm am Tag der Geburt bis zum Tod auf ca. sechs Gramm ansteigt, wurde den Tieren also bei jeder Gabe ungefähr 0,18-1,0 mg/kg AM80 injiziert. Diese Dosis hatte sich im Verlaufe der ersten in vivo Versuchsreihe als die erfolgversprechendste herausgestellt. Die Behandlung erfolgte ab dem ersten Lebenstag jeden zweiten Tag, wobei die klinische Begutachtung der Tiere erneut täglich erfolgte. Die Kontrollgruppe erhielt statt des Retinoids jeden zweiten Tag 50 µl PBS.

In dieser zweiten Versuchsreihe wurden jeweils vier Behandlungs- und vier Kontroll-Würfe zur Erstellung von Gewichtsverläufen und Überlebenskurven verwendet. Die weiteren Würfe wurden zur Untersuchung verschiedener Parameter herangezogen. Am 14. Lebenstag wurden sowohl behandelte als auch unbehandelte Mäuse per Dekapitation euthanasiert. Allen Tieren wurde Blut zur Gewinnung von Serum entnommen. Diese Serumproben wurden auf die Leberwerte GOT, GPT und Bilirubin hin untersucht. Desweiteren wurden den Tieren die Leber entnommen. Jeweils ein Leberlappen wurde zur histologischen Untersuchung in Iso- pentan aufgenommen und anschließend bei -80 °C gelagert. Eine weitere Leberprobe jedes Tieres wurde benutzt um sie später per quantitativer PCR zu untersuchen. Hierfür wurden die Proben in der Substanz RNA later ebenfalls bei -80 °C eingefroren.

Das übrige Lebergewebe wurde am Tag der Präparation für eine Untersuchung per Durch- flusszytometrie aufbereitet. Dafür wurden zunächst die intrahepatischen Leukozyten mit Hilfe eines Percoll-Gradienten gewonnen und anschließend mit Fluochrom-gekoppelten An- tikörpern gefärbt. Der Ablauf der Zellisolierung mittels Percoll-Gradient und der Oberflä- chenfärbung für die Durchflusszytometrie ist den entsprechenden Abschnitten (3.8.4. und 3.9.2.) des Methodenteils zu entnehmen. Es wurde sowohl eine T-Zell- Phänotypisierungsfärbung als auch eine Färbung von myeloiden Zellen durchgeführt.

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24 3.4.Serum-Chemie

Das gewonnene Blut wurde bei 800 x g für 10 Minuten zentrifugiert und das Serum in 1,5ml Eppendorftubes abpipettiert und bis zur Analyse wurde das Serum bei -80°C aufbewahrt. Bei zu geringem Serumvolumen wurden Tiere gleicher Gruppen gepoolt. Nach Verdünnung des Serums im Verhältnis 1:2 wurden die Messungen von Bilirubin, Laktatdehydrogenase (LDH), Alanin transaminase (ALT = GPT) und Aspartat transaminase (AST = GOT) mit einem AU 400 Olympus Analyzer (Olympus, Tokio, Japan) der Arbeitsgruppe von Prof. Faikah Güler, Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen der MHH durchgeführt (wie in Rong et al beschrieben).

3.5.Histologie

Zum Nachweis der entzündungsbedingten Veränderungen in den Lebern der infizierten Tiere wurden am Ende des Beobachtungszeitraumes einige Lebern nach Präparation nicht der Durchflusszytometrie zugeführt, sondern für eine feingewebliche Untersuchung verwendet.

Hierfür erfolgte nach Präparation eine Aufnahme in flüssigem Stickstoff. Die Organe wurden bis zur histologischen Aufbereitung bei -80 °C gelagert.

Die histologische Aufarbeitung wurde von der Arbeitsgruppe von Prof. Faikah Güler, Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen der MHH durchgeführt. Die in 4%igem Isopen- tan/Paraformaldehyd tiefgefrorenen Leberproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und in Sörensen-Puffer überführt.

3.6.Immunhistologie

Die immunhistologischen Untersuchungen wurden von der Arbeitsgruppe von Prof. Faikah Güler, Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen der MHH durchgeführt.

Für die immunhistologischen Untersuchungen wurden 1,5 µm dicke Parafffinschnitte ange- fertigt. Nach Entparaffinierung der Leberproben in einer absteigenden Alkoholreihe und an- schließender Rehydratisierung erfolgte die Inkubation mit den jeweiligen Antikörpern. Als Antikörper wurden GR-1 und F4/80 eingesetzt.

Für die Immunfluoreszenz-Färbung wurden Kryoschnitte mit einer Dicke von 2-4μm verwendet. Nach Rehydratisierung der Proben erfolgte die Applikation und anschließende Inkubati- on mit dem Primärantikörper über Nacht. Am Folgetag wurde der Sekundärantikörper auf

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die Schnitte aufgetragen. Nach Inkubationszeit und Waschschritten folgte das Eindecken der Schnitte mit Aquapolymount und DAPI.

3.7.Zellkultur

3.7.1. Allgemeine Zellkulturbedingungen

Zur Kultivierung der eingesetzten Zellkulturplatten wurden CO2 Inkubatoren (95% Luftfeuch- tigkeit, 5% CO2 und 37°C) verwendet. Alle Arbeiten mit den Zellkulturen wurden aseptisch in Sterilwerkbänken vorgenommen. Die Ergebnisse der Zellkulturversuche wurden in zwei Wiederholungsversuchen bestätigt.

3.7.2. Zellzahlbestimmung

Zur Bestimmung der Zellzahlen wurde eine Neubauer Zählkammer eingesetzt. Je nach zu erwartender Zellzahl wurde die Zellsuspension aus den entsprechenden Kulturplatten in einem Verhältnis von 1:10 bzw. in einem Verhältnis von 1:100 mit Trypanblau (Invitrogen Molecular probes, Eugene, USA) verdünnt. 10 µl der Färbelösung wurden auf die Kammer gegeben, woraufhin anschließend die Auszählung der vier Felder der Neubauer Zählkammer und die Bildung des Mittelwertes erfolgte. Die Gesamtzellzahl ergibt sich aus dem Mittelwert der gezählten Zellen multipliziert mit dem Kammerfaktor (10⁴), dem Verdünnungsfaktor der Färbung (10 bzw. 100) und dem Gesamtvolumen der Zellsuspension.

Es ergibt sich: Zellen x Verdünnungsfaktor (10 oder 100) x Kammerfaktor 10⁴ = Zellzahl/ml Zellzahl/ml x Volumen (mL) = Gesamtzellzahl

3.7.3. Puffer und Medien

Komplettes Medium für Zellkultur:

RPMI 1640 + GlutaMAXTM-I 500 ml Gibco, Grand Island, USA

FCS Lot. No. CPL0252 50 ml Thermo Scientific HyClone, Erembodegem, B Penicillin/Streptomycin 2,5 ml Biochrom, Berlin, D

Beta-Mercaptoethanol 0,5 ml Gibco, Grand Island, USA Ammonium-Chlorid-Kalium Lyse Puffer:

NH4CL 8,3 g

KHCO3 1,0 g

EDTA 0,1 mM

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26 Destilliertes Wasser 1 l

pH 7,2 - 7,4

PBS Gibco, Grand Island, USA

(Phosphat gepufferte Salzlösung)

FACS Puffer: PBS + 1 % BSA

MACS Puffer: PBS + 0.5 % BSA + 2 mM EDTA

3.8.Zellgewinnung und -aufbereitung

3.8.1. Isolation von gd T-Zellen Zellen aus Lymphknoten und Milz

Nach cervikaler Dislokation des Versuchstiers wurden sowohl die Milz als auch die inguina- len, cervikalen, axillären, mesenterialen und paraaortalen Lymphknoten (LK) entfernt und in einem 15 ml Falcon bzw. einer Petrischale mit kaltem PBS aufgenommen. Nach vorherigem Zerkleinern mit einem Skalpell wurden Milz und Lymphknoten durch ein 70 µm Zellsieb ge- rieben. Anschließend erfolgte ausführliches Spülen mit PBS und ein fünfminütiger Zentrifu- gationsschritt bei 300 x g. Das Pellet mit den LK-Zellen wurde nach Dekantieren des Über- stands in 5 ml PBS resuspendiert, das Milzpellet hingegen musste noch einer zweiminütigen Erythrozytenlyse unterzogen werden. Nach einem weiteren Waschschritt konnte auch diese Zellen in 5 ml PBS aufgenommen und mit den Lymphknoten-Zellen zusammengeführt werden.

Daraufhin wurden die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer wie oben beschrieben ausge- zählt, wobei die Zellausbeute pro Versuchstier zwischen 0,43 x 10⁸und 3,07 x 10⁸ Zellen lag.

3.8.2. Isolation von leberinfiltrierenden Leukozyten

Für diesen Teil der Versuche wurden Mäuse verwendet, die zuvor mit dem Rhesus Rotavirus infiziert worden waren. Das bedeutet, dass in den Tieren bereits eine Immunreaktion statt- gefunden hat und die zu untersuchenden Leukozyten schon aktiviert (geprimet) wurden, was sich auf die Bedingungen der Zellkultur auswirkt. Im Vergleich zu den in vitro Versuchen mit juvenilen C57BL/6J Mäusen wurden die Zellen der erkrankten Balb-c Neonaten nicht aus Milz und Lymphknoten gewonnen, da die Immunzellen nach ihrer Aktivierung aus den Lymphknoten in die Peripherie des Organismus auswandern. Stattdessen wurden den symp- tomatischen Tieren nach Dekapitation die Lebern entnommen und in kaltem PBS gelagert.

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Nach Homogenisierung der Lebern mit Hilfe eines Spritzenstempels und eines Zellsiebs erfolgte anschließend an einen Erythrozytenlyse-Schritt die Aufbereitung der hämatopoeti- schen Zellen mittels eines Percoll-Gradienten (s. entsprechender Abschnitt). Nach dem fina- len Zentrifugationsschritt konnten die mononukleären Zellen abgesaugt und in ein 15 ml Falcon überführt werden.

Zur Zellzählung wurde ebenfalls eine Neubauer-Zählkammer verwendet, wobei die Zellzah- len in den sechs ex vivo Experimenten bei 0,13 x 10⁶bis 3,12 x 10⁶ Leukozyten pro Leber la- gen.

3.8.3. MACS-Verfahren

3.8.3.1. Material und Reagenzien

TCR gd+- Isolation Kit , mouse Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, D 3.8.3.2. Durchführung

Nach der Homogenisierung von Lymphknoten und Milz wurden die gd T-Zellen aus der Zell- suspension mit Hilfe des TCRgd+ Isolation Kit gemäß Herstellerprotokoll separiert. Der Ablauf ist dabei so gestaltet, dass zunächst alle Nicht-T-Zellen mit einem Antikörper, der mit einem magnetischen Bead gekoppelt ist, markiert und dadurch in einer ersten magnetischen Säule zurückgehalten wurden. Alle T-Zellen fließen durch die Säule hindurch und werden aufge- fangen. In einem zweiten Schritt werden alle gd T-Zellen per Antikörper markiert, in einer zweiten Säule festgehalten und können anschließend mit einem Stempel herausgedrückt werden.

Die gd T-Zellzahl wird mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt, wobei die Zellen in einer 1:10 Verdünnung gezählt werden. In den Versuchen erhielten wir Zellzahlen zwischen 5,3 x 10⁵ und 9,9 x 10⁵Zellen pro Maus (Milz und Lymphknoten). Nach Erfassung der Zellzahl und einem Waschschritt konnten die Zellen so in Medium aufgenommen werden, dass sich in 200 µl Medium jeweils 1-2x 10⁵ Zellen befanden, die anschließend in einer 96-well Kultur- platte mit flachem Boden ausgesät wurden.

Die Zellseparation per MACS-Verfahren wurde nur für die in vitro Versuche angewendet. Für die Zellkulturen mit pathologischen leberinfiltrierenden gd T-Zellen wurden Zellsuspensionen genutzt, die alle Leber-Leukozyten enthielten. Die gd T-Zellen wurden dann spezifisch stimu- liert um zu gewährleisten, dass die beobachteten Effekte nur ihnen und nicht anderen Leu- kozyten zugeschrieben werden können.

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abrupt bremsen darf, sondern langsam auslaufen muss, um eine Beibehaltung der Phasen- trennung zu gewährleisten. Die Leukozyten konnten aus der Interphase abgesaugt und in ein neues Reaktionsgefäß überführt werden. Je nach Versuch wurden sie dann einer Zellfärbung für die Durchflusszytometrie zugeführt oder in Kulturmedium aufgenommen.

3.9.Überprüfung der Reinheit der gd T-Zell-Kultur mittels Durchflusszytometrie

3.9.1. Material und Reagenzien

FACSCanto II Flowcytometer BD Bioscience, San Jose, USA

3.9.2. Durchführung der Reinheitskontrolle

Das Verfahren der Durchflusszytometrie wurde angewendet um die Reinheit der positiv se- lektierten gd T-Zell-Fraktion zu überprüfen. Dafür wurden nach Abschluss der magnetischen Separation ca. 5x10^5 Zellen aus der gd T-Zell-Fraktion entnommen und in 1,5 ml FACS- Tubes überführt. Nach zweimaligem Waschen mit 200 µl FACS-Puffer bei 250 x g wurden die Zellen zunächst in PBS mit einem fluoreszierenden Antikörper, der an aminreaktive Gruppen auf toten Zellen bindet, gemäß Herstellerprotokoll gefärbt (Fixable dead/live kit, eBio) und für 30 Minuten im Kühlschrank inkubiert. Dieser Antikörper färbt tote Zellen an (Fixable dead live kit: Viability dye) und erlaubt daher eine Differenzierung zwischen toten und le- benden Zellen.

Nach weiteren Waschschritten wurde die T-Zell-Phänotypisierungsfärbung 1 (siehe Tabelle) der Zelloberfläche vorgenommen, wobei ein Teil der Zellen als ungefärbte Kontrolle diente.

Die Oberfläche der T-Zellen wurde auf die Expression verschiedener Marker hin untersucht.

Da das Ziel der Färbung war, den Anteil der gd T-Zellen in der Kultur zu bestimmen, wurden Marker eingesetzt, die zunächst Leukozyten von allen übrigen Zellen und anschließend T- Zellen von den anderen Immunzellen unterscheiden (CD45 und CD3e). Im Anschluss wurde innerhalb der T-Zellen zwischen ab T-Zellen (TCRab) und gd T-Zellen (TCRgd) differenziert.

Zur Detektion wurden Fluorochrom-gekoppelte Antikörper, die an die entsprechenden Ober- flächenmarker binden, eingesetzt. Sie sind der unten stehenden Tabelle zu entnehmen. Die- se erste Phänotypisierungsfärbung diente zur Reinheitskontrolle der Kulturansätze. Der Her- steller des TCR gd+- Isolation Kit liefert in diesem Kit schon einen Antikörper mit, der der Detektion der gd T-Zellen in der Durchflusszytometrie dienen soll (a-Biotin-APC). Im Verlaufe des magnetischen Separationsprozesses waren die gd T-Zellen zunächst indirekt mit einem Anti-TCRgd-Biotin-Antikörper markiert worden. An das Molekül Biotin soll auch der im Kit

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enthaltene Fluochrom-gekoppelte Antikörper binden und so die gd T-Zellen im Durchflusszy- tometer erkennbar machen. Da dieser Antikörper allerdings nicht einwandfrei funktionierte, setzten wir einen vom Kit unabhängigen TCRgd-Antikörper ein (TCRgd-PE) und konnten so die gd T-Zellen eindeutig markieren.

Nach der Zellfärbung wurden die Proben zweimal mit 200 µl FACS-Puffer gewaschen, zentrifugiert und nach dem letzten Waschschritt in 100 µl FACS-Puffer resuspendiert.

Erfolgte die Analyse der Proben am gleichen Tag wurde auf die Fixierung der Zellen verzich- tet. War dies nicht der Fall, wurden die Zellen im Anschluss an die Färbung 30 Minuten mit 2

% PFA inkubiert, daraufhin gewaschen und in 200 µl FACS-Puffer aufgenommen und für ma- ximal 72h unter Lichtschutz bei 4°C bis zum Einlesen der Zellen gelagert.

Die Analyse der gd T-Zellen nach MACS Isolation zeigte in allen Experimenten eine Reinheit von 92% oder mehr.

FITC PE PerCP- Cy5.5

PE-Cy7 APC eF780 eF450 eF506

Phänotypisierun- gen T-Zell Phänotypi-

sierung 1

TCRab TCRgd CD3e a-

Biotin

CD45 Fixable viability Dye

1:600 1:100 1:200 1:10 1:600 1:1000

T-Zell Phänotypi- sierung 2

CD8a TCRgd CD3e CD25 TCRb CD4 CD45 live/dead

1:600 1:100 1:200 1:200 1:600 1:600 1:600 1:1000 Tabelle 2: Färbeprotokoll T-Zell-Phänotypisierung 1

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32 3.11. Apoptose-und Nekrose-Bestimmung

Um die Viabilität der isolierten Zellen in der Kultur zu bestimmen und zu überprüfen, ob sich das synthetische Retinoid AM80 negativ auf das Überleben der Zellen auswirkt, wird der ApoLive-Glo Multiplex Assay der Firma Promega eingesetzt.

Hierbei werden zwei Chemikalien kombiniert, um zum einen die Aktivität der Protease lebendiger Zellen und zum anderen die Aktivierung der Caspase 3 und 7, welche ein Biomarker für den programmierten Zelltod ist, zu ermitteln. So ist es möglich mit einem Assay gleich- zeitig Viabilität und Apoptose der Zellen zu messen.

Die Protease lebendiger Zellen, setzt das im Assay verwendete Substrat Glycyl-phenylalanyl- amino fluorocumarin (GF-AFC), welches die Zellmembran passieren kann, um und generiert dadurch ein Fluoreszenz-Signal. Dieses Signal ist proportional zur Zahl lebendiger Zellen in der Kultur und kann mit einem Mikroplattenleser detektiert werden.

Das im Caspase-Glo3/7-Reagenz enthaltene Substrat der Caspase 3/7 wird nach Zugabe zur Zellkultur von dieser umgesetzt. Dadurch wird ein Substrat der Luciferase, das Aminolucife- rin, frei, welches wiederum von der Luciferase umgesetzt wird. Aus dieser Reaktion resultiert die Generierung eines Lumineszenz-Signals, das proportional zur Caspase-Aktivität in der vorliegenden Zellkultur ist.

Durchführung:

Vor dem eigentlichen Versuchsbeginn werden die Reagenzien nach Herstellerangaben her- gestellt.

Um eine Aussage über die Lebendigkeit bzw. den Zelltod der Zellen in der zu untersuchenden Kultur treffen zu können, müssen verschiedene Kontrollen mitgeführt werden. Zum einen werden drei Wells der Kulturplatte ausschließlich mit Medium befüllt und dienen somit als negative Kontrolle ohne Zellen. Zum anderen werden Zellen verwendet, die nur in Medi- um gegeben aber ansonsten nicht weiter behandelt wurden. Sie werden als Kontrolle mit unbehandelten Zellen bezeichnet. Außerdem wird eine Positivkontrolle für die Apoptose angelegt, indem drei Wells der Zellkulturplatte für sechs Stunden mit 10µM Staurosporin inkubiert werden. Dieser Stoff verhindert die Bindung von ATP an die Proteinkinase, was letztendlich zum Zelltod führt.