D OSISABHÄNGIGE S UPPRESSION DER IL-17 P RODUKTION VON gd T-Z ELLEN DURCH R ETINOIDE

Für unsere pharmakologischen Studien verwendeten wir den synthetischen Retinoid-Rezeptor-a-Agonisten AM80, der sich gegenüber anderen Retinoiden wie z.B. All-trans-retinoic-acid (ATRA) durch eine ausgesprochen hohe Rezeptorspezifität und deutlich überle-gene pharmakologische Eigenschaften in Bezug auf Resistenz gegenüber Hitze, Licht und Oxidation auszeichnet. Weiterhin ist AM80 unter dem Handelsnamen Tamibarotene zur Be-handlung der ATRA-refraktären akuten myeloischen Leukämie im Menschen zugelassen. In niedriger Dosierung kann AM80 die Differenzierung von Th17-Zellen effektiver modulieren als ATRA, gleichzeitig wird durch seinen Einsatz die Expression des Transkriptionsfaktor RORgt effektiv herunterreguliert⁶³.

Unsere Daten zeigen, dass AM80 nicht nur auf die Differenzierung von CD4+ TH17-Zellen supprimierend wirkt, sondern auch gd T-Zellen signifikant beeinflusst. Bei Co-Inkubation mit AM80 unter den oben diskutierten Kulturbedingungen kam es zuverlässig zu einer dosisab-hängigen Reduktion sowohl des in die Überstände sezernierten IL-17 (Abb. 9 und 10) als auch der mRNA-Expression (Abb. 12). Der Master-Transkriptionsfaktor RORgt+ wurde nach Co-Inkubation mit AM80 vermindert exprimiert (Abb. 12).

Schon eine sehr geringe Menge des Retinoids AM80 führte nahezu zu einer Halbierung des IL-17-Gehalts in den Kulturüberständen (Abb. 9). Bei dieser geringen Retinoid-Konzentration von 0,1 nM war nicht damit zu rechnen, dass die Substanz eine generelle Immunsuppression oder Toxizität aufweist, sondern spezifische Effekte erzielt. Auffällig war, dass nach einer Inkubationszeit von 24h auf die zu diesem Zeitpunkt sehr geringen Mengen IL-17 im Über-stand kein Effekt zu erkennen war. In den oben genannten durchflusszytometrischen Expe-rimenten konnte zu diesem Zeitpunkt Il-17 intrazellulär in gd T-Zellen nachgewiesen werden.

Eine Ko-Inkubation der Zellen mit AM80 führte zu einer Halbierung des intrazellulären IL-17 Gehaltes (Abb. 14). IL-17 ist, wie zuvor beschrieben, methodisch bedingt intrazellulär nur zu frühen Zeitpunkten nachweisbar.

5.3.1. Dosisabhängige Reduktion von IL-17A, IL-17F, IFN-g sowie reziproke In-duktion von IL-4 in gd T Zellen durch AM80

Die Ergebnisse des ELISA-Verfahrens wurden durch den Cytometric Bead Array (CBA) bestä-tigt. 1 nM AM80 führte zu einer Reduktion der 17A Konzentration von 5000 pg/ml. Die

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17F Konzentration wurde durch die Zugabe dieser Menge AM80 halbiert. Der CBA Assay zeigt bei einer Erhöhung der Retinoid-Konzentration auf 100 nM keinen weiteren Effekt.

Im Gegensatz zu seinem Effekt auf proinflammatorische Zytokine führte die Zugabe von AM80 zu einem kontinuierlichen Anstieg des Zytokins IL-4 (Abb. 10). IL-4 ist ein antiinflamm-atorisches Zytokin, welches in vivo von verschiedenen Zellen des angeborenen und adapti-ven Immunsystems, v.a. Th2-Zellen, produziert wird⁷⁵. Im Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis korrelierte die IL-4 Produktion mit einem verbesserten kli-nischen Bild der Erkrankung. Einer der vermuteten Mechanismen ist, dass IL-4 produzieren-de T-Zellen im ZNS das Nervengewebe über eine Aktivierung produzieren-der Mikroglia vor Stoffen wie TNF-a und Stickoxid schützen können⁷⁶.

Während der Erstellung dieser Dissertation wurden zwei Arbeiten publiziert, die ebenfalls zeigten, dass Retinoide grundsätzlich auf gd T-Zellen wirken können Mielke et al. konnten im Rahmen eines Kolitismodells nachweisen, dass Retinsäure die in vitro Produktion von IL-22 und von IFNg durch gd T-Zellen signifikant verstärken kann⁷⁷. Im Gegensatz dazu, wurde die IL-22 Produktion von CD4+ T-Zellen durch die Retinsäure nicht beeinflusst. In der gleichen Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Anwendung von Retinsäure die intestinale Entzün-dungsreaktion in vivo abschwächt und gleichzeitig die Anzahl von IL-22 produzierenden gd T-Zellen im Kolon erhöht⁷⁷. Mittels Promotoranalysen ließ sich feststellen, dass RA-Rezeptoren an bestimmte RARg-Bindungsmuster im IL-22 Promotor der gd T-Zellen binden. Das bedeu-tet, dass die Retinsäure die IL-22 Produktion direkt und unabhängig von Signalen des T-Zellrezeptors über die Bindung von RAR Transkriptionsfaktoren fördert⁷⁷. Auch im Modell der experimentellen autoimmunen Uveitis zeigte sich wie oben beschrieben ein deutlicher Effekt des Retinoids ATRA auf die gd T-Zellen. Nicht nur ihre Anzahl wurde durch die Behand-lung vermindert, sondern auch ihre IL-17 Produktion supprimiert⁷⁸.

5.3.2. Reduktion der il17 und RORgt mRNA in der gd T-Zell Kultur durch AM80 Auch auf genetischer Ebene bzw. auf Ebene der Transkriptionsfaktoren konnte gezeigt wer-den, dass die Expression von RORgt durch den RAR-Agonisten signifikant reduziert wird.

RORgt wird von Th17-Zellen aber auch anderen IL-17 produzierenden Zellen exprimiert und gilt als führender Regulator der Th17 Entwicklung³⁹. Auch das Gen für das Zytokin IL-17 wird zwar nicht streng dosisabhängig aber doch signifikant durch die Zugabe des Retinoids in sei-ner Expression supprimiert. Sowohl mit den Überstandsanalysen als auch mit der qPCR

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sen sich allerdings keine quantitative Aussage über Einzelzellen treffen. Es kann daher nicht differenziert werden, ob tatsächlich die Anzahl der IL-17 produzierenden gd T-Zellen verrin-gert wird oder sie lediglich an der IL-17 Produktion gehemmt werden bzw. die gleiche Anzahl an Zellen mit verringerter IL-17 und RORgt Expression vorliegt. Daher strebten wir einen Nachweis auf Einzelzellbasis mittels Durchflusszytometrie und einer intrazellulären IL-17-Färbung an.

5.3.3. Reduktion der Anzahl IL-17-produzierender gd T-Zellen nach Behandlung mit AM80

In mehreren frustranen Versuchen gelang jedoch am ehesten aufgrund der Internalisierung des Rezeptors nach Ligandenbindung⁷⁴ keine Anfärbung der gd T-Zellen nach Stimulation in vitro. Daher nutzen wir schlussendlich TCRgd reporter Mäuse, bei denen die gd T Zellen un-abhängig von den Oberflächenrezeptoren intrinsisch ein GFP-Signal abgeben. Hier zeigte sich, dass der Anteil der IL-17+ gd T Zellen nach Retinoid-Zugabe deutlich verringert war (Abb. 14).

Dass die isolierten gd T-Zellen nicht einfach durch das Retinoid abgetötet werden und des-halb ihre Zytokinproduktion sinkt, konnte mit Hilfe der Apoptose-Testung ausgeschlossen werden (Abb. 11). Unabhängig von der AM80-Konzentration zeigten die Zellen eine den Kon-trollen vergleichbare Viabilität und sogar eher eine geringere Caspase-Aktivität, weshalb einer erhöhter Zelltod auszuschließen ist. Zusammenfassend schlussfolgern wir, dass Retino-ide in unserem Zellkultursystem die IL-17 Produktion von gd T Zellen hemmen.

5.3.4. Wirkung von AM80 auf Leukozyten erkrankter Tiere aus dem BA-Tiermodell (ex vivo)

Zur weiteren Prüfung der immunmodulatorischen Effekte von AM80 wurden gd T-Zellen aus erkrankten Mäusen isoliert und in Anwesenheit von AM80 restimuliert.

Dass Retinoide auf die IL-17 Produktion von gd T-Zellen, die gesunden Tieren entnommen wurden, einen supprimierenden Effekt haben, konnte anhand der obigen Ergebnisse mehr-fach belegt werden. Da aber davon auszugehen ist, dass eine Stimulationskultur nicht die gleichen Bedingungen erfüllt, die im Körper eines erkrankten Tieres vorherrschen, wurde zusätzlich überprüft, wie sich gd T-Zellen aus RRV-infizierten Tieren verhalten. Auffällig war, dass die aus kranken Tieren isolierten Leukozyten in der Kultur weiterhin einen Stimulus durch IL-23 benötigten, obwohl sie schon im Körper der Tiere zur IL-17 Produktion angeregt

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wurden (Abb. 15). Im Gegensatz zum Zellkulturansatz mit gd T-Zellen aus gesunden Tieren, benötigten die T-Zellen der erkrankten Tiere hingegen keine zusätzliche Stimulation durch den Antikörper CD28 in der Kultur (Abb. 15). Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass für die Stimulation naiver T-Zellen grundsätzlich auch ein kostimulierendes Signal nötig ist, welches z.B. über die Interaktion mit CD28 erreicht wird. Die gd T-Zellen aus kranken Tieren sind al-lerdings antigen-erfahren und/oder vorstimuliert und somit genügt die Re-Stimulation einzig über den TCR. Die Zugabe des Retinoids zu den ex vivo gd T-Zellen erzielte einen ähnlichen Effekt wie bei den ungeprimten gd T-Zellen. Eine Koinkubation mit AM80 führte in allen An-sätzen zu einer deutlichen Reduktion des IL-17 Gehaltes (Abb. 15). Kritisch anzumerken ist, dass auf Grund der geringen Zellzahlen keine MACS Isolation vorgenommen werden konnte und somit die Kultur in diesem Fall nicht aus reinen isolierten gd T-Zellen bestand, sondern aus den gesamten Leukozyten der entzündeten Lebern. Eine spezifische Stimulation wurde durch Einsatz eines Antikörpers angestrebt, der sich ausschließlich gegen den TCR der gd T-Zellen richtet. In den Ansätzen, in denen dieser verwendet wurde, findet sich eine deutlich geringere IL-17 Menge (Daten nicht gezeigt), weshalb angenommen werden kann, dass im Falle der mit antiCD3 stimulierten Zellen auch andere T-Zellen zur IL-17 Produktion beigetra-gen haben. Da auch hier die Zugabe von AM80 zu einer Reduktion des IL-17 Gehaltes führte, hätte das Retinoid hier nicht nur auf die gd T-Zellen gewirkt, sondern ebenfalls auf die ande-ren IL-17 Produzenten. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten jedoch eindeutig nach-weisen, dass in der experimentellen Gallengangatresie ausschließlich gd T-Zellen für die IL-17-Produktion verantwortlich sind und abT-Zellen keine Rolle spielen⁵². Dass es trotzdem nach der antiCD3-Stimulation zu einer stärkeren IL-17-Produktion gekommen ist, kann da-rauf zurückgeführt werden, dass bei geprimten gd T-Zellen der gd T-Zell-Rezeptor durch die Aktivierung der Zellen herunterreguliert wurde⁷². Dies wird auch in den FACS-Analysen deut-lich, wo eine Färbung der gdTCR+ Zellen nach Stimulation in der Zellkultur nicht gelingt. Das Oberflächenprotein CD3 wird weniger stark herunterreguliert, sodass eine unspezifischere antiCD3-Stimulation zu einer stärkeren IL-17-Produktion führt.

Weiterhin gilt es einschränkend anzuführen, dass die gd T-Zellen aus gesunden Tieren einem anderen Mausstamm entnommen wurden, als die Zellen aus kranken Tieren. Die Etablierung des BA-Mausmodells erfolgte mit BALB/c-Mäusen. Aus Gründen der Praktikabilität und Ver-fügbarkeit der Tiere wurden für die in vitro Versuche allerdings Black6-Mäuse verwendet.

Wir halten es für unwahrscheinlich, dass es zwischen den beiden Mausstämmen

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gende funktionelle Unterschiede bei den Mechanismen der IL-17 Produktion durch gd T Zel-len gibt, eine vergleichende in vitro Untersuchung der Wirkung von AM80 auf gd T-ZelZel-len aus BALB/c- und Black6-Mäusen steht jedoch noch aus.