Aus der Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen der Medizinischen Hochschule Hannover
IL- 17A und γδ T -Zellen beim experimentellen
akuten Nierenversagen (AKI)
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Nicole Völker
aus Löningen
Hannover 2019
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns
Betreuer/in der Arbeit: Prof.´in Dr. med. Faikah Güler
1. Referent/in: Prof. Dr. med. Andreas Leffler 2. Referent/in: Prof. Dr. med. Danny Jonigk
Tag der mündlichen Prüfung: 22.02.2021
Prüfungsausschuss
Vorsitz: Prof. Dr. med. Arnold Ganser
1. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Anibh Das 2. Prüfer/in: PD Dr. med. Henrike Lenzen
i
1.1 Akutes Nierenversagen ... 1
1.2 Übergang von akutem zum chronischen Nierenversagen ... 2
1.3 Pathophysiologie des akuten Nierenversagens ... 4
Entzündungsmechanismen beim Ischämie-Reperfusionsschaden ... 7
1.3.1 1.4 T-Zell Populationen als Modulatoren der Immunantwort ... 9
γδ T-Zellen ... 10
1.4.1 Interleukin 17A ... 11
1.4.2 1.5 Zielsetzung dieser Arbeit ... 13
2 Material & Methoden ... 14
2.1 Material ... 14
Mäuse ... 14
2.1.1 Monitoring der Mäuse ... 14
2.1.2 Material für die Operationen ... 15
2.1.3 Einbettung und Fixation von Geweben ... 15
2.1.4 Färbungen ... 16
2.1.5 Immunhistochemie ... 16
2.1.6 Durchflußzytometrie ... 17
2.1.7 Quantiative PCR ... 19
2.1.8 Geräte ... 20
2.1.9 Therapeutischer IL-17 Antikörper ... 20
2.1.10 2.2 Methoden ... 21
Hypoxisches akutes Nierenversagens (AKI) durch Ischämie- 2.2.1 Reperfusionsschaden ... 21
Organ-Asservierung und Fixation ... 21
2.2.2 Paraffin-Schnitte... 22
2.2.3 Histologie ... 23
2.2.4 Quantitative PCR... 28
2.2.5 Durchflußzytometrie zur Charakterisierung der Leukozyten... 29
2.2.6 Behandlung mit einem therapeutischen IL-17A Antikörper ... 33
2.2.7 Statistik ... 34
2.2.8 3 Ergebnisse ... 35
3.1 Akutes Nierenversagen bei IL-17A defizienten Tieren ... 35
Effekt einer IL-17ADefizienz auf das AKI ... 35
3.1.1 IL-17A-/- verhindert nicht das AKI nach IRI ... 36 3.1.2
ii
IL-17A-/- schützt nicht vor Fibrose ... 42
3.1.4 Proinflammatorische Zytokine ... 48
3.1.5 Antikörperbehandlung mit einem IL-17A Antikörper ... 50
3.1.6 Einfluß von γδ T-Zellrezeptor Defizienz auf den IRI Schaden... 53
3.1.7 4 Diskussion ... 56
5 Zusammenfassung ... 62
6 Literaturverzeichnis ... 64
7 Abbildungsverzeichnis ... 69
8 Abkürzungsverzeichnis ... 70
9 Publikationen ... 72
10Kongresse ... 72
11Lebenslauf ... 74
12Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 7 + 8... 76
13Danksagung ... 77
1
1 Einleitung
1.1 Akutes Nierenversagen
Das akute Nierenversagen (acute kidney injury, AKI) bezeichnet den plötzlichen Verlust der Nierenfunktion. Es umfasst das gesamte Syndrom der Nierenschädigung, von der leichten Funktionseinschränkung bis zur Dialysenotwendigkeit, unabhängig von der Ätiologie und Pathologie1. Das AKI kann mit einer Reduktion bis zum vollständigen Verlust der exkretorischen Nierenfunktion einhergehen und es kann auch zu einer verminderten Urinausscheidung (Oligurie oder Anurie) führen. Klinische Zeichen sind Überwässerung, Urämie mit Anstieg von Kreatinin und Harnstoff, Abfall der glomerulären Filtrationsrate (GFR), sowie Störungen des Säure-Basen-Haushalt und des Elektrolythaushalt. Dies kann neben Ödemen auch zu lebensbedrohlichen Herz- Rhythmusstörungen führen2. Das AKI wird in verschiedene Schweregrade unterteilt nach
„Kidney Disease Improving Global Outcome“ (KDIGO). Dabei werden 3 Stadien unterschieden. Die Einteilung erfolgt anhand des Serum-Kreatinins bezogen auf den Ausgangswert oder den Anstieg und die Urinmenge pro Zeit. Im Stadium 1 beträgt der Anstieg des Serum-Kreatinin das 1,5-1,9-fache des Ausgangswert innerhalb von 7 Tagen oder einen Anstieg von mehr als 0,3 mg/dl innerhalb der ersten 48 Stunden. Die Urinmenge beträgt weniger als 0,5ml/kg/h für 6-12 Stunden. Ein Anstieg des Serum- Kreatinin um das 2,0-2,9-fache vom Ausgangswert bzw. eine Urinmenge von weniger als 0,5 ml/kg/h über mehr als 12 h entspricht dem Stadium 2. Das schwerste Stadium des akuten Nierenversagens ist das Stadium 3. Hier kommt es zu einem 3-fachen Anstieg des Serum-Kreatinin gegenüber des Ausgangswertes bzw. einer Urinmenge von weniger als 0,3 ml/kg/h über >24 h oder einer Anurie über mehr als 12 h3.
Die Gründe für ein AKI sind vielfältig. Dabei unterscheidet man zwischen prärenalen Ursachen wie zum Beispiel kardialen Erkrankungen, sowie Exsikkose, Blutungen und Blutdruckabfall, die zu einer verminderten Perfusion der Niere führen können. Des Weiteren gibt es diverse renale Erkrankungen wie Glomerulonephritis, interstitielle Nephritis (u.a. als Folge von Medikamenten wie nichtsteroidale Antiphlogistika oder einige Antibiotika) und akute Tubulusnekrosen z.B. durch nephrotoxische Kontrastmittel, die zu einem intrarenalen AKI beitragen können. Postrenale Ursachen wären Abflusshindernisse wie Nierensteine, Prostatahypertrophie bei älteren Männern oder
2 Reflux-Nephropathien4,5. Die Inzidenz des AKI nimmt weltweit kontinuierlich zu. Dabei gibt es große Unterschiede zwischen Entwicklungsländern und Industriestaaten. In den Industriestaaten sind vorrangig ältere Patienten betroffen, die ein AKI als Folge großer kardialer oder kardiovaskulärer Eingriffe erleiden oder im Kontext von Sepsis, wo bis zu 60% der Patienten auf der Intensivstation ein AKI entwickeln6. Weitere Gründe für ein AKI sind bildgebende Verfahren mit Verwendung nephrotoxischer Kontrastmittel z.B. im Rahmen von Herzkatheteruntersuchungen7. Das AKI ist verantwortlich für einen Anstieg der Morbidität und Mortalität. 2 Millionen Menschen weltweit versterben jedes Jahr am AKI. Je nach Schwere des AKI besteht ein erhöhtes Risiko eine zunehmende Fibrose der Niere zu entwickeln und an einem chronischen Nierenversagen (chronic kidney disease, CKD) zu erkranken4,8-10. In Entwicklungsländern sind vielfach jüngere Menschen aufgrund mangelnder hygienischer Voraussetzungen und begrenztem Zugang zu medizinischer Versorgung (Infektionen als Folge von Entbindungen, z.B. Kindbettfieber, Durchfallerkrankungen mit Exsikkose und konsekutivem Nierenversagen und fäkal oral übertragene Lebensmittelvergiftungen, z.B. Shigatoxin induziertes Hämolytisches Urämisches Syndrom)11 betroffen.
1.2 Übergang von akutem zum chronischen Nierenversagen
Chronisches Nierenversagen ist definiert als ein persistierendes Nierenversagen über 90 Tage und länger. Die Risikofaktoren für akutes und chronisches Nierenversagen sind zum Teil gleich. Dazu gehören hohes Alter, Diabetes mellitus, metabolisches Syndrom, Hypertonie und genetische Faktoren. Dabei ist der Übergang zwischen akutem und chronischem Nierenversagen häufig ein Kontinuum. Je nach Stadium kann es zu unterschiedlichen Verläufen des akuten Nierenversagens kommen (Abb. 1). Beim milden AKI kann sich die Nierenfunktion wieder normalisieren oder aber es kommt zur Defektheilung mit chronischem Nierenfunktionsverlust unterschiedlichen Ausmaß. Der irreversible Verlust der Nierenfunktion wird als terminale Niereninsuffizienz (end stage renal disease, ESRD) bezeichnet7,9.
Das AKI tritt innerhalb von 48 Stunden auf. Wenn sich der Nierenfunktionsverlust über einen längeren Zeitraum entwickelt wird er auch als akute Nierenerkrankung (acute kidney disease, AKD) bezeichnet. Dabei kommt es zu anhaltendem Nierenversagen mit einer eGFR <60 ml/min/1,73m2, GFR >35%, einem Serum-Kreatinin-Anstieg von >50% oder einem Nierenschaden <3 Monate. Das AKD beschreibt einen akuten oder subakuten
3 Nierenschaden oder den Verlust der Nierenfunktion für die Dauer zwischen 7 und 90 Tagen9.
Abbildung 1: Verlaufsformen des AKI
Das reversible AKI (lila Linie) zeichnet sich nach einem initialen schnellen Nierenfunktionsverlust mit einer raschen Normalisierung der Nierenwerte aus. Es kann jedoch auch zu einer Defektheilung kommen (rote Linie) bei der nach einem akuten Funktionsverlust eine reduzierte Nierenfunktion auch im Langzeitverlauf zurück bleibt. Es kann bei repetitiver Schädigung (blaue Linie) zu einer dauerhaften Schädigung mit Verlust der Nierenfunktion kommen. Ein schweres AKI kann direkt in ein chronisches Nierenversagen bis hin zur Dialysepflichtigkeit übergehen (grüne Linie). Das subakute Nierenversagen (gelbe Linie) kann schleichend zu einer Verschlechterung der Nierenfunktion führen und fortschreiten zum AKD ohne vorher die Definition des AKI erfüllt zu haben9.
Das AKI ist ein Risikofaktor für das Auftreten eines CKD und ebenso stellt die vorbestehende chronische Niereninsuffizienz einen Risikofaktor für ein akut auf chronisches Nierenversagen und somit AKI dar. Das CKD ist assoziiert mit kardiovaskulären Ereignissen und erhöhter Mortalität9,12. Deswegen gilt es ein AKI frühzeitig zu erkennen und weitere nierenschädigende Ereignisse zu verhindern (Absetzen nephrotoxischer Medikamente, Einsparung von Kontrastmitteln), um den Übergang in ein CKD zu verhindern.
4
1.3 Pathophysiologie des akuten Nierenversagens
Die Mikrozirkulation in der Niere ist äußert komplex. Im Bereich der Nierenrinde und des Nierenmarks befindet sich ein dichtes Netz peritubulärer Kapillaren, die von efferenten Arteriolen gespeist werden (Abb. 2A)13,14. In der Niere besteht ein Sauerstoffgradient vom Kortex zum äußeren und inneren Mark. Der Sauerstoffpartialdruck im Bereich des Kortex beträgt 40-60 mmHg und reduziert sich im äußeren Marks auf 10-20 mmHg (Abb. 2B).
Dies veranschaulicht, dass das äußere Mark als erstes durch Sauerstoffmangel (Hypoxie) z.B. bei Blutdruckabfällen geschädigt wird, hier ist die Sauerstoffreserve am geringsten13.
Abbildung 2: Aufbau Nephron und Sauerstoffgradient
(A) Aufbau eines gesunden Nephrons mit dem Cortex, dem äußeren Mark und dem inneren Mark (B) Sauerstoffgradient zwischen Cortex und Nierenmark13.
Der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) ist ein wichtiger Grund für das Auftreten eines AKI. Es kommt zu einem Missverhältnis zwischen Gewebe-Oxygenierung und Sauerstoffbedarf. Das führt zu einem Polaritätsverlust der Tubulusepithelzellen und später zu Nekrose und Apoptose sowie zum Abschilfern abgestorbener Zellen in das Tubuluslumen, was dann zu einer mechanischen Obstruktion und zum Fortschreiten des AKI beitragen kann.
A B
5 In Folge des IRI kommt es zum Verlust von peritubulären Kapillaren und im weiteren Verlauf zu Mikrozirkulationsstörungen mit verminderter Perfusion und Sauerstoffversorgung. Die Minderdurchblutung der Niere führt zum Untergang von Tubulusepithelzellen, Apoptose und Nekrose, des Weiteren tritt eine akute Entzündungsreaktion auf. Die Nierenfunktion wird durch diese Faktoren weiter eingeschränkt. Das akute und chronische Nierenversagen haben ähnliche Pathomechanismen. Fehlregulierte Apoptose, abnormale Zellantwort, übersteigerte Immunantwort, sowie Hochregulation pro-inflammatorischer Signale und progredienter Kapillarverlust führen im Verlauf zum chronischen Nierenversagen mit fortschreitender Fibrose12.
Während der Entzündungsreaktion kommt es zur Aktivierung und Hochregulation von Adhäsionsmolekülen wie ICAM, VCAM und Selektinen und dem Einwandern von Leukozyten. Zell-Zell-Kontakte werden geschädigt und es bilden sich lokale Ödeme aus, die die Mikrozirkulation weiter einschränken. Im Gefäßsystem können außerdem Mikrothromben auftreten (Abb. 3)13.
7 Entzündungsmechanismen beim Ischämie-Reperfusionsschaden
1.3.1
Der Ischämie Reperfusionsschaden führt zu strukturellen Veränderungen im Gewebe mit Zelluntergang und Hochregulation von pro-inflammatorischen Faktoren wie Chemoattractants und Adäsionsmoleküle. Dies induziert die Einwanderung von Leukozyten im Rahmen der Immunantwort (Abb. 4)13.
Das angeborene (innate) Immunsystem wird innerhalb von Minuten aktiviert und bildet die erste frühe Phase der Immunantwort. Diese Antwort erfolgt nicht-antigen-spezifisch. Es kommt zur Einwanderung von neutrophilen Leukozyten, Monozyten/Makrophagen, dendritischen Zellen und natürlichen Killerzellen. Im weiteren Verlauf wandern auch T- Lymphozyten ein und die erworbene (adaptive) Immunantwort wird aktiviert15. Die Makrophagen produzieren auch Chemokine und anti-inflammatorische Zytokine wie IL-10 und TGFβ, die zum späteren Reparaturprozess beitragen16.
9
1.4 T-Zell Populationen als Modulatoren der Immunantwort
Die T-Zellen sind ein wesentlicher Bestandteil der Immunantwort beim IRI der Niere17-19. T-Zellen reifen im Thymus, es gibt verschiedene T-Zell-Populationen, dazu gehören die CD4+ T-Helferzellen und die CD8+ zytotoxischen T-Zellen20.
Die CD4+ T-Helferzellen differenzieren weiter in TH1, TH2 und TH17-Zellen (Abb. 5).
TH1 Helferzellen sind an der zellvermittelten Immunität beteiligt. Sie produzieren IL-2 und INF-γ. Die TH2 Helferzellen sind Teil der humoralen Immunantwort gegen Parasiten und produzieren IL-4, IL-5 und IL-13. Ein weiterer T-Zell-Subtyp sind die TH17-Zellen, welche zur Bekämpfung von Infektionen dienen und an verschiedenen Autoimmunerkrankungen beteiligt sind. Sie produzieren neben IL-21, IL-22, IL-23, TNFα, IL-6 und GM-CSF auch IL-1721-23.
Abbildung 5: CD4-Subtypen
Naive CD4+ Zellen differenzieren sich in verschiedene Subtypen. Dazu gehören Th17-Zellen. Durch den Einfluss von verschieden Zytokinen differenzieren Th17-Zellen weiter zum Beispiel in IL-17A produzierende Th17-Zellen. Nicht alle Th17-Zellen scheinen pathogen zu sein24.
Die Zytokine IL-6, TGFβ, IL-21 und IL-23 sowie der STAT3 Signalweg führen zur Differenzierung von TH-Zellen in TH17-Zellen. Dazu sind zwei Transkriptionsfaktoren, der retinoic acid related orphan receptor γ-t (ROR-γt) und der RA related (ROR-α), wichtig25,26. IL-6 und TGFβ sind ebenfalls beim IRI hochreguliert25. Außerdem sind CD4+ regulatorische T-Zellen (Treg) an der Differenzierung zu TH17-Zellen beteiligt. Dabei spielen IL- 6 sowie IL-1 und IL-23 eine wichtige Rolle. Die Differenzierung wird kontrolliert durch IL-1β und IL-2. IL-1β ist nicht nur auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert sondern auch auf γδ T-Zellen21. IL-23 wird von aktivierten dendritischen Zellen produziert und kann durch Bindung an den IL-23R auf T-Zellen die Produktion von
10 IL-17A induzieren22. Es gibt Hinweise darauf, dass nicht alle TH17-Zellen pathogen sind und Entzündung induzieren. Der Signalweg über TH17 Differenzierung und IL-17 Produktion durch TGFβ und IL-6 scheint nicht pathogen zu sein. Demgegenüber zeigt die IL-23/IL-17 Achse zur Differenzierung der TH17 Zellen pathogene Eigenschaften24. CD4+ T-Zellen scheinen den stärksten Einfluss auf die T-Zell-Antwort beim IRI zu haben.
Sie sind die Hauptproduzenten von IL-17A in der Niere21. Studien haben allerdings gezeigt, dass es neben den CD4+ T-Zellen noch weitere IL17-A produzierende Zellen gibt.
Hierzu zählen unter anderem die γδ T-Zellen (Abb. 6)18.
T-Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche einen T-Zell-Rezeptor (TCR). Hier unterscheidet man die T-Zellen mit der αβ-Kette, die für T-Helferzellen und zytotoxische T-Zellen charakteristisch sind und die T-Zellen mit der γδ-Kette19.
Abbildung 6: IL-17A Signalweg und Bedeutung in der Immunantwort
Naive T-Vorläuferzellen differenzieren zu TH17-Zellen. Diese werden durch TGFβ, IL-6, IL-21, IL-1β und IL-23 stimuliert und führen zur Bildung von Zytokinen wie IL-17A, welches außerdem von γδ T-Zellen, αβ T- Zellen und natürlichen Killerzellen gebildet wird21.
γδ T-Zellen 1.4.1
Die γδ-T-Zellen stellen eine kleine Subgruppe der T-Zellen dar und bestehen aus einer γ und einer δ Kette. Die genaue Rolle der γδ T-Zellen ist noch nicht hinreichend aufgeklärt.
Sie präsentieren keine MHC-Moleküle und produzieren keine Antikörper, stattdessen wird ihnen eine wichtige Rolle in der Immunantwort innerhalb der ersten 72 Stunden nach dem
11 schädigenden Ereignis zugeschrieben19. Eine Funktion scheint die Produktion von Zytokinen wie IL-17A und IL-17F zu sein. In einigen Fällen sind die γδ-T-Zellen dominanter in der IL-17A Produktion als die CD4+ T-Zellen. So scheinen die γδ-T-Zellen bei bakteriellen Infektionen die Hauptgruppe von IL-17 produzierenden Zellen zu sein22. In der Peripherie sind die γδ-T-Zellen als Effektor-Gedächtniszellen vorhanden. Dadurch wird IL-17 schnell produziert und es kommt zur Immunantwort bevor CD4+ T-Zellen zu TH17 Zellen differenziert sind. In der späteren Phase der Immunantwort ab Tag 6 stehen CD4+ Th17 Zellen zur Verfügung und sind an der IL-17A Produktion beteiligt27.
IL-21 und TGFβ vermitteln die Differenzierung von γδ T-Zellen. Bereits in gesunden Nieren scheinen γδ T-Zellen im Gewebe vorhanden zu sein und könnten zu der schnellen Immunantwort beitragen22,27. Die γδ-T-Zellen scheinen eine Rolle als Vermittler zwischen angeborener Immunantwort und den CD4+ T-Zellen zu spielen19. Daher könnten sie ein attraktiver Angriffspunkt für Therapien sein.
Interleukin 17A 1.4.2
IL17-A ist ein pro-inflammatorisches Zytokin, welches von aktivierten T-Zellen produziert wird23. Einer der pro-inflammatorischen Effekte ist die Rekrutierung von Monozyten und Neutrophile an den Ort der Entzündung28. Naive T-Zellen werden durch das immunregulatorische Zytokin TGFβ und dem pro-inflammatorischen Zytokin IL-6 stimuliert, um IL-17 zu bilden.
Die IL17- Familie besteht aus 6 Isoformen: IL17-A bis IL17-F. IL17-A liegt als Dimer vor23. Es ist auch bekannt als zytotoxisch T-Lymphozyt assoziiertes Antigen 8 und ist ein Glykoprotein, das aus 155 Aminosäuren besteht29. Produziert wird IL-17A durch verschiedene Zelltypen während der Immunantwort. Hierzu gehören die γδ T-Zellen, natürliche Killerzellen, neutrophile und eosinophile Leukozyten sowie TH17-Zellen.
IL-17A führt zur Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-8, G-CSF) durch Fibroblasten. Dadurch werden die Neutrophilen aktiviert und es kommt zur Expansion der myeloiden Zellreihen30. Außerdem stimuliert IL-17A eine Vielzahl von Zellen pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1β, IL-6 und TGF β freizusetzen und wirkt mit anderen Zytokinen wie IL-1β, IL-6, IFNγ und TNF α zusammen, um eine pro- inflammatorische Antwort auszulösen. Durch die Kombination aus Stimulation von Neutrophilen und Mobilisation von T-Lymphozyten ist IL-17A sowohl Teil der angeborenen als auch der erworbenen Immunantwort31-33.
12 Der Rezeptor für IL-17A ist der Interleukin 17 Rezeptor (IL-17R). Die IL-17 Rezeptorfamilie hat 5 Untereinheiten, die als IL-17A Rezeptor A bis E bezeichnet werden.
IL-17A bindet an einen Komplex aus zwei IL-17RA Ketten und eine IL-17RC Untereinheit. Dies führt zur Aktivierung von TRAF6 und dadurch zur Aktivierung von NF-κB und MAP-Kinasen als Mediatoren der Inflammationskaskade33.
IL-17A ist an der Pathogenese verschiedener Erkrankungen beteiligt, dazu gehören chronische Entzündungen und Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, inflammatorische Darmerkrankungen, systemischer Lupus erythematodes, Glomerulonephritiden und Psoriasis. Des Weiteren wurde IL-17A in der Pathogenese von Leberfibrose, Leberzell-Karzinomen und Lungenentzündungen charakterisiert26,33-36.
13
1.5 Zielsetzung dieser Arbeit
Bisher gibt es keine etablierte Therapie zur Verhinderung des akuten Nierenversagens. Da es gerade im Kontext mit großen Operationen häufig auftritt, ist die Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen zur Vermeidung und besseren Ausheilung des AKI und des IRI wichtig.
Aufgrund der Pathophysiologie von IL-17A und auch der Rolle von T-Zellen in der Produktion von IL-17 war es Ziel dieser Arbeit, den Einfluss einer IL-17A Defizienz oder Hemmung und auch einer γδ T-Zell Defizienz im Mausmodell des AKI zu untersuchen.
Als Modell wurde ein akuter renaler IRI induziert, der unbehandelt innerhalb von drei Wochen zu einem chronischen Nierenversagen führt. Es handelt sich um ein IRI-CKD Modell37,welches in der Arbeitsgruppe bereits mittels funktionellem MRT gut
charakterisiert wurde38.
Im Rahmen der Studie wurden die einzelnen Phasen des IRI an Tag 1, 7 und 21 untersucht.
Dies sind die Zeitpunkte, wo zunächst die myeloiden Zellen infiltrieren und ein deutlicher akuter Gewebeschaden auftritt (Tag 1), die Entzündungsreaktion sich unter Beteiligung der T-Zellen ausbreitet (Tag 7) und schließlich die chronische Phase mit vermehrter
Makrophagen-Infiltration und Fibrosierung (Tag 21) das chronische Nierenversagen charakterisiert. Zur Analyse wurden histologische und immunhistochemische Färbungen, qPCR, sowie Durchflußzytometrie zur Charakterisierung der Leukozyten-Subpopulationen durchgeführt.
Ergänzend zu den Untersuchungen an den IL-17A defizienten Mäusen wurde auch eine Therapiestudie mit einem IL-17A blockierenden Antikörper untersucht.
14
2 Material & Methoden 2.1 Material
Mäuse 2.1.1
Für die Versuche wurden folgende Mausstämme verwendet:
Wildtyp Mäuse, Stammbezeichnung: BALB/cAnNCrl (Charles River, Sulzfeld, Deutschland)
IL17A-/- Mäuse, Stammbezeichnung: BALB/c-Il17atm1Ywi (Zentrales Tierlaboratorium, Medizinische Hochschule Hannover)
γδ T-Zell-/- Mäuse, Stammbezeichnung: CBy.129P2(B6)-Tcrdtm1Mom/SzJ (Zentrales Tierlaboratorium, Medizinische Hochschule Hannover)
Wildtyp Mäuse, Stammbezeichnung: C57BL/6JHanZtm (B6, Zentrales Tierlaboratorium, Medizinische Hochschule Hannover)
In allen Experimenten wurden männliche Mäuse im Alter von 11-15 Wochen mit einem Gewicht zwischen 23-28 g verwendet. Die Tiere wurden im Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) gezüchtet (Leiter: Prof. André Bleich). Gemäß Tierschutzgesetz waren alle Tierversuche vor Beginn der Studie vom Landesamt für Lebensmittelsicherheit (LAVES;
Aktenzeichen: 33.9-42502-04-12/0916 und 33.14-42502-04-12/0916-Völker) genehmigt worden. Die Tiere wurden artgerecht bei konstantem Lichtzyklus 14/10 Tag/Nacht- Rhythmus mit freiem Zugang zu Wasser und Futter (Altromin 1324 Standard) im Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten.
Monitoring der Mäuse 2.1.2
Alle Versuchstiere wurden täglich kontrolliert und mittels eines Belastungscores (s.
Tabelle) charakterisiert. Bei einem Score von 3 und kleiner erfolgte die unmittelbare Beendigung des Versuches. Als Abbruchkriterium für die Versuche galt das Auftreten von Ödemen, das Auftreten neurologischer Störungen, das Verweigern der Nahrungsaufnahme und Passivität der Tiere. Bei Verhaltensauffälligkeiten der Tiere oder struppiger Erscheinung wurde das Kreatinin vorzeitig gemessen, ein Kreatinin von >300 µmol/l war ebenfalls als Abbruchkriterium definiert.
15 Belastungsscores
Score Qualität Merkmale
6 Sehr aktiv Kräftig, neugierig, schnelle Bewegungen
5 Aktiv Neugierig, schnelle, vereinzelte Aktivitätspausen 4 Eingeschränkt aktiv Reagiert auf Zuwendung, häufige Aktivitätspausen
3 Ruhig Desinteressiert an der Umwelt, selten Aktivität, schläfrig, herabgesetzte Nahrungsaufnahme
2 Lethargisch Keine Aktivitäten, verharren, keine Nahrungsaufnahme 1 Moribund Keine Aktivität, Atemschwierigkeiten, Tod zu erwarten
Material für die Operationen 2.1.3
Material Hersteller
Wärmetisch C10-B3 Haake, Karlsruhe, Deutschland
Chirurgisches Mikroskop M690 LEICA Service, Bensheim, Deutschland Anästhesieeinheit Univentor 400 TSE systems, Bad Homburg, Deutschland
Spritzenpumpe TSE systems, Bad Homburg, Deutschland
Nadelhalter für Bauchwandnähte BM54 Aesculap, Tuttlingen, Deutschland Chirurgische Pinzette BD537 Aesculap, Tuttlingen, Deutschland
Schere BC545 Aesculap, Tuttlingen, Deutschland
Mikropinzette BD329 Aesculap, Tuttlingen, Deutschland Nichttraumatische Gefäßklemme FE690K Aesculap, Tuttlingen, Deutschland Nahtmaterial Ethilon 4-0 PS-3 EH7761H Ethicon, USA
Nahtmaterial Prolene 7-0 BV-1 8701H-S Ethicon, USA
Isofluran Baxter, Unterschleißheim, Deutschland
Butorphanol Chemos GmbH, Regenstauf, Deutschland
PBS 10% Gibco by Life Technologies Nr.:14200-067
Butterfly Nadel 27 G Dispomed Witt oHG, Gelnhausen, Deutschland
Einmal-Kapillarpipetten , Natrium- heparinisiert, minicaps
Hirschmann Laborgeräte, Germany
Einbettung und Fixation von Geweben 2.1.4
Material Hersteller
Paraformaldehyd (PFA) 2%, 4% Sigma Aldrich Xylol Ersatz, SUB-X Clearing Agent Nr.:
3803672EF
Leica Paraffin, Surgipath Paraplast Tissue
Embedding Medium Nr.: 39601006
Leica
Deckgläser 24x50mm Menzel Gläser, Thermo Scientific Poly-L-Lysine Solution 0,1% Sigma-Aldrich
16 Färbungen
2.1.5
PAS Färbung
Material Hersteller
Roti-Histol (Roth No.: 6640.1) Carl Roth, Deutschland
Periodicsäure (Merck No.: 1.00524.0025) Merck, Darmstadt, Deutschland Schiff's Reagenz (Merck No.:
1.09033.0500)
Merck, Darmstadt, Deutschland Hematoxylin (Fluka No.: 03971) SIGMA Aldrich
Roti-Histokitt, synthet (Roth No.: 6638.1) Carl Roth, Deutschland
Sirius Rot Färbung
Material Hersteller
Roti-Histol (Roth No.: 6640.1) Carl Roth, Deutschland PMA (Phosphormolybdic acid in aqua)
dest.)
Sirius red Direct Red 80 Pulver SIGMA Aldrich Picrid acid solution 1,3% SIGMA Aldrich Masson Trichrom Färbung
Material Hersteller
Wolframphosphorsäure (Roth No.: 2635.2) Carl Roth, Deutschland Orange G (Roth No. 0318.2) Carl Roth, Deutschland Xyloidin-Ponceau (Sigma No.: P2395-25G) SIGMA Aldrich
Anilinblau (Roth No.: 4002.1) Carl Roth, Deutschland Hämatoxylin (Roth No.: 3816.3) Carl Roth, Deutschland Eisen-III-chlorid (Roth No.: 5192.1) Carl Roth, Deutschland Azophloxin (Sigma No.: 11640-25G) SIGMA Aldrich
Säurefuchsin (Roth No.: T128.1) Carl Roth, Deutschland Bouins Solution (Sigma No.:HT10132-11) SIGMA Aldrich
Immunhistochemie 2.1.6
Material Hersteller
Roti-Histol (Roth No.: 6640.1) Carl Roth, Deutschland Trypsin (1mg LOT:
SLBF8326V)
SIGMA Chemical Company
Normal Donkey Serum Dianova
Eindeckmittel: Aqua Poly / Mount polysciences LOT:667495, Cat:18606
Polysciences, Inc.
17 Primäre
Antikörper
Firma Produkt- nummer
Spezies Target Verdün- nung
F4/80 Biolegend 122602 Monoclonal,
rat anti mouse
Monozyten/
Makrophagen
1:200 Fibronectin abcam ab 23750 Polyclonal,
rabbit anti mouse
Bindegewebe 1:200
CD31 (PECAM-1) Dianova DIA-310 Monoclonal, rat anti-mouse
Kapillaren 1:200 KIM-1 (TIM-1) R&D
systems
MAB1750 Monoclonal, mouse IgG2B
Epithelschaden 1:10 NGAL Dianova ABS 043-29 Monoclonal,
rat anti mouse
Epithelschaden Neutrophile
1:1000
Ki-67 abcam Ab16667 Monoclonal,
rabbit anti- mouse
Proliferation 1:100
Kollagen IV Biozol 1340-01 Goat Anti- Type IV Collagen
Bindegewebe 1:50
Kollagen III Polyclonal,
rabbit anti mouse
Bindegewebe 1:100
Gr-1 AbD
serotec
RB6-8C5 Monoclonal, Rat anti-mouse
Neutrophile 1:200
sekundäre Antikörper Firma Produktnummer Verdünnung Alexa Fluor 555 goat anti-rat IgG Invitrogen A21434 1:500
Alexa Fluor 555 donkey anti rabbit (IgG H+L)
Life
technologie
Lot: 1189904 1:500 Alexa Fluor 555 donkey anti goat
IgG (H+L)
Life
technologie
A21432 1:500
Alexa Fluor 555 donkey anti mouse IgG (H+L)
Life
technologie
A31570 1:500
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)
Invitrogen 51811A 1:500
Durchflußzytometrie 2.1.7
Material Hersteller
PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (10x) Nr.:14200-067)
Gibco by Life Technologies DMEM (Dulbeccos modified eagle medium)
Kollagenase2 (Lot 42K13638) Cellsystems
Nylonmash 70µm
RBC Lyse Puffer (Red blood cell Lyse Puffer, 420301)
Biolegend, San Diego
18 Trypan blau
FCS 0,5%
PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate, D00108292) Merck, Deutschland
Ionomycin (407952-1MG) Merck, Deutschland
Brefeldin A (00-4506-51) ebioscience, Heidelberg
Saponin Puffer 0,5%
Compensation beads
Viability Dye eF506 Affymetrix eBioscience
FcR Block
Antikörper Firma Clone Verdünnung
FITC CD49b Affymetrix eBioscience DX5 1:100
PE Ly6-C Biolegend, San Diego HK1.4 1:600
CD11c PerCP-Cy5.5 Affymetrix eBioscience N418 1:400
PE-Cy7 Ly6-G Biolegend, San Diego 1A8 1:600
APC F4/80 Affymetrix eBioscience BM8 1:100
CD11b APCeF780 Affymetrix eBioscience M1/70 1:600
CD8a FITC Affymetrix eBioscience 53-6.7 1:600
CD19 PE 1:100
CD3e PerCP-Cy5.5 Affymetrix eBioscience 145-2C11 1:200
CD25 PE-Cy7 1:200
TCRβ APC Affymetrix eBioscience H57-597 1:600
CD4 eF780 1:600
CD45 eF450 Affymetrix eBioscience 30-F11 1:600
TCRγδ PE Affymetrix eBioscience GL3 1:200
IFNγ PE-Cy7 eBioscience, Heidelberg XMG1.2 1:200 IL17A eF450 Biolegend, San Diego TC11-18H10.1 1:20
19 Quantiative PCR
2.1.8
Material Hersteller
RNAlater solution (L/N 1412062) Ambion
RNASE Away (Lot. 13390468) Molecular Bio Products 2-Mercapto-Ethanol (Charge R106 A1108) AppliChem
QIA shredder (Lot. 151024331) Qiagen RNeasy Mini Kit: (Lot. 151022048)
RLT Puffer RW-1 Puffer RPE-Puffer
Qiagen
RNase-Free DNase Set (79254):
DNase RDD-Puffer
Qiagen
DEPC-Wasser (RNase freies Wasser) Ambion Prime Script RT Reagent Kit (RR037B):
Prime Script RT Enzyme Mix 1 Oligo dt Primer
Random Hexamers
Clontech/ Takara
SYBR®Premix ExTaqTM II (RR820W) Clontech/ Takara 96well plate cover (600238) Biozym
Primer Firma Produktnummer
TNF α QIAGEN Mm_Tnf_1_SG QuantiTect Primer Assay QT00104006 IL-6 QIAGEN Mm_Il6_1_SG QuantiTect Primer Assa QT00098875 MCP-1 QIAGEN Mm_Ccl2_1_SG QuantiTect Primer
Assay
QT00167832 Kollagen
1A1
QIAGEN Mm_Col1a1_1_SG QuantiTect Primer Assay
QT00162204
Fibronectin QIAGEN Mm_Fn1_1_SG QuantiTect Primer Assay QT00135758
IL17A QIAGEN Mm_IL17A_SG QuantiTect Primer Assay QT00103278 PAI-1 BioTez forward: ATG TTT AGT GCA ACC CTG GC
reverse: CTG CTC TTG GTC CGA AAG AC CTGF BioTez forward: AGC TGA CCT GGA GGA AAA CA
reverse: GAC AGG CTT GGC GAT TTT AG
20 Geräte
2.1.9
Name Hersteller
Einbettautomat Leica (TP1020) Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland
Einbettstation (Leica EG1160) Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland
Rotationsmikrotom Firma Leica, RM 2245;
1,5 µm Schnittdicke
Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland
Leica LM DB Leica Microsystems GmbH, Wetzlar,
Deutschland
Mikroskop Keyence
Light Cycler 480 II Roche AG, Basel, Schweiz
PTC-200 Peltier Thermal Cycler MJ Research
Bio-Photometer Eppendorf
Gentle Macs Dissociator Miltenyi Biotec, San Diego
FACSCantoII BD biosiences
Therapeutischer IL-17 Antikörper 2.1.10
Der anti-IL-17A Antikörper (MM17F3) für die Hemmversuche wurde uns freundlicherweise von Prof. Immo Prinz, Institut für Immunologie, Medizinische Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
21
2.2 Methoden
Hypoxisches akutes Nierenversagens (AKI) durch Ischämie- 2.2.1
Reperfusionsschaden
Die Operationen wurden in Vollnarkose mit Isofluran (3-5% Induktion, 1-2% Erhaltung) durchgeführt. Die Tiere erhielten vor OP Butorphanol (1mg/ kg s.c.) zur Analgesie. Es erfolgte eine mediane Laparotomie. Anschließend wurde der rechte Nierengefäßstiel mit einer nicht traumatischen Gefäßklemme für 45min abgeklemmt (Abb. 7)39. Nach Entfernung der Klemme kam es zur Reperfusion und die Durchblutung wurde visuell kontrolliert. Während des Abklemmens wurde die Niere aufgrund der Stase des Blutes dunkel. Nach Reperfusion blasste die Niere wieder ab. Das Abdomen wurde in zwei Schichten verschlossen und die Maus überwacht bis sie wieder vollständig aus der Narkose erwacht war.
Abbildung 7: Einseitiges Abklemmen des renalen Gefäßstiels für 45 Minuten
Organ-Asservierung und Fixation 2.2.2
Nach Erreichen der Endpunkte an Tag 1, 7 und 21 erfolgte die Euthanasie in tiefer Isoflurannarkose durch Perfusion einer eiskalten PBS Lösung über den linken Ventrikel, was in Narkose einen Herzstillstand auslöst. Beide Nieren wurden entnommen und fixiert.
Die kontralateral nicht geklippte Niere diente als gesunde Kontrolle. In Vorversuchen konnten wir zeigen, dass die kontralaterale Niere ähnliche Eigenschaften wie die Nieren bei sham-operierten Tieren aufweist. Im Rahmen des Tierschutzes stellt die Nutzung der Eigenniere ein deutliche Einsparung an Tierversuchen dar (RRR Prinzip).
Je nach geplanten Analysen wurde das Gewebe unterteilt und folgendermaßen fixiert.
Für Paraffin-Schnitte erfolgte die Fixation in 4% PFA (Paraformaldehyd)
Zur FACS-Analyse wurde das Gewebestück zerkleinert und in Gentle Macs Tubes mit 4 ml DMEM und 500 U/ml Kollagenase aufgenommen.
Für die mRNA Isolation wurde Gewebe in RNAlater bei -20°C gelagert
22
Für Kryoschnitte wurde das Gewebe in Isopentan auf Trockeneis bei -40°C eingefroren und anschließend bei -80°C gelagert.
Für die Proteinbiochemie wurde ein Gewebestück in Flüssigstickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert.
Außerdem erfolgte zu verschiedenen Zeitpunkten eine Blutentnahme mit einer Glaskapillare aus dem retrobulbären Venenplexus. Das Blut wurde bei 4°C 10 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert, das Serum abpipettiert und bis zur weiteren Analyse bei -80°C eingefroren.
Paraffin-Schnitte 2.2.3
Die Fixierung der Organe erfolgte direkt nach Entnahme in 4% PFA. Formalin reagiert mit basischen Aminosäuren und führt zur Bildung quervernetzender Hydroxymethylenbrücken. Es reagiert nur wenig mit zytoplasmatischen Proteinen, so dass die Struktur erhalten bleibt und ist dadurch für die meisten immunhistochemischen Färbungen gut geeignet40. Nach 24 h PFA Fixierung bei 4°C wurde das Gewebe dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die Entwässerung des Gewebes in einer aufsteigenden Alkoholreihe. 30 min in 30%iger Ethanol-Lösung und dann 30min in 50%iger Ethanol-Lösung. Die folgenden Schritte der Entwässerung erfolgten mit einem Einbettautomaten mittels aufsteigender Alkoholreihe.
3 h 70%ige Ethanol-Lösung
1 h 80%ige Ethanol-Lösung
2 x 1 h 90%ige Ethanol-Lösung
2 x 1 h 100%ige Ethanol-Lösung
1,5 h 100%ige Ethanol-Lösung
1 h Xylol Ersatz
2 x 1,5 h Xylol Ersatz
2 x 2 h Paraffin
Im Anschluss wurden die Präparate mit Hilfe einer Einbettstation mit Paraffin ausgegossen. Mit einem Mikrotom konnten Schnitte in einer Schnittdicke von ca. 2µm angefertigt werden und auf Objektträger aufgezogen werden. Die Objektträger wurden zur besseren Haltbarkeit vorher mit Poly-L-Lysin beschichtet. Anschließend wurden die Objektträger im 37°C Wärmeschrank getrocknet.
23 Histologie
2.2.4
PAS-Färbung (Perjod-Schiffsäure-Färbung)
Mit der PAS-Färbung werden insbesondere kohlenhydrathaltige Komponenten wie zum Beispiel Glykoproteine und Glykogen angefärbt. Dadurch ist die Nierenmorphologie gut erkennbar. Der Bürstensaum ist leuchtend rosa angefärbt, Zellkerne erscheinen blau und das Zytosplasma blassrosa. Vor der Färbung erfolgt zunächst die Entparaffinierung und Rehydrierung der Schnitte über eine aufsteigende Alkoholreihe.
Entparaffinierung:
3 x 5 min. Histoclear Rehydratation:
3 x 3 min 100% Alkohol
2 x 2 min 96% Alkohol
1 x 1 min 70% Alkohol
1 x 1 min 50% Alkohol
Kurz in Aqua dest PAS Färbung:
10 min Perjodsäure
3 x 5 min Spülen mit Aqua dest.
20 min Schiff´s Reagenz
3 x 2min in Sulfitwasser (12ml 10%ige Na2O3-Lösung, 10ml 1N HCL, 200ml Aqua dest.) differenzieren
10 min unter fließendem Leitungswasser spülen
10-20 sec mit Hematoxylin färben
10 min unter fließendem Leitungswasser bläuen
Entwässerung mit der aufsteigenden Alkoholreihe und Eindecken:
2 x kurz 96% Ethanol-Lösung
3 x 2 min 100%ige Ethanol Lösung
3 x 2 min Histoclear
Eindecken mit Histokitt Auswertung:
Zur Auswertung des Gewebeschadens wurde ein semiquantitativer AKI Score verwendet.
Zeichen des AKI sind Verlust des Bürstensaums, Weitstellung der Tubuli, Abflachung des Tubulusepithels, Abschilferung der Tubulusepithelzellen und tubuläre Obstruktion.
AKI Scores:
0 = lokales AKI mit < 5 % betroffener Tubuli
1 = mildes AKI mit 5 -25 %
2 = moderates AKI mit 25-50 %
3 = schweres AKI mit 50-75 %
4 = sehr schweres AKI > 75 %
24 Sirius Rot Färbung
Mit der Sirius Rot Färbung werden Kollagenfasern angefärbt. Sirius Rot interkaliert in Kollagenfasern der Typen I und III und kann als Marker für die interstitielle Fibrose verwendet werden.
Färbeprotokoll nach Entparaffinierung und Rehydratation:
Kurz in Aqua dest
10 min Leitungswasser
5 min Aqua dest.
5 min 0,2% PMA (Phosphomolydän säure)
90 min 0,1% Sirius red in saturated picric acid (Direct red 80, SIGMA Aldrich und Pikrinsäure Lösung 1.3% in H2O, SIGMA)
Kurz 0,01 N HCl
45 sec 70% Ethanol
Entwässerung mit der aufsteigenden Alkoholreihe und Eindecken der Schnitte (s.o.) Auswertung:
Anschließend wurden die Schnitte am Lichtmikroskop histologisch ausgewertet. Die Quantifizierung der Fibrose erfolgte mit Hilfe der ImageJ Software. Es wurden Übersichtsaufnahmen der Präparate angefertigt und die auszuwertende Fläche definiert.
Dafür wurden die großen Gefäße herausgeschnitten, da Sirius rot perivaskulär deutlich vermehrt ist. In diesem Projekt wurde darauf fokussiert die interstitielle Fibrose zu quantifizieren. Bewertet wurde der prozentuale Flächenanteil an Sirius rot positivem Gewebe.
Masson Trichrom Färbung
Die Masson Trichrom Färbung zeigt den chronischen Nierenschaden mit interstitieller Fibrose und Tubulusatrophie. Fasern stellen sich in dieser Färbung blau dar.
Entparaffinierung und Rehydration:
Kurz in Aqua dest
1 min Bouin´s Solution in der Mikrowelle
15 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen
Mit Leitungswasser spülen
2 min Weigert: Weigert A und B filtrieren und zu gleichen Teilen mischen
- Weigert A: 10g Hamatoxylin in 600ml 96% Alkohol, rühren, filtrieren, weitere 400ml 96% Alkohol hinzugeben
- Weigert B: 11,6g Eisen-III-chlorid in 990ml Aqua dest., 10ml 25%ige HCl, rühren
15 min bläuen unter Leitungswasser
30 sec. Masson - 176ml Aqua dest.
25 - 0,35ml Eisessig
- 15ml Ponceau: 1g Xylidin Ponceau in 100ml Aqua dest. unter Rühren aufkochen lassen, abkülen lassen und filtrieren, 1ml Eisessig hinzugeben - 5ml Säurefuchsin: 1g in 100ml Aqua dest. aufkochen lassen, abkühlen lassen
und filtrieren, 1ml Eisessig hinzugeben
- 4ml Azophloxin: 0,5g Azophloxin in 100ml Aqua dest. lösen, 200µl Eisessig zugeben und unter rühren lösen
- Alles der Reihenfolge nach mischen und in eine Küvette füllen
30 sec. 1%ige Essigsäure
30 sec. PWO
- 20g Wolframphosphorsäure in 200ml Aqua dest. lösen und 1h rühren - 8g Orange G in 180ml Aqua dest. lösen und 1h rühren
30 sec. 1%ige Essigsäure
8 min. Anilinblau
15 sec. 1%ige Essigsäure
Entwässerung mit der aufsteigenden Alkoholreihe und Eindecken der Schnitte (s.o.) Auswertung:
Anschließend wurden die Schnitte am Lichtmikroskop histologisch ausgewertet.
Die Auswertung der Fibrose erfolgte semiquantitativ in einer 200fachen Vergrößerung.
Dabei wurde der Score für tubulo-interstitielle Fibrose und Tubulusatrophie (IFTA) angewendet. Dieser Score ist ähnlich dem AKI Score.
0 = < 5 % Fibrose pro Fläche
1 = 5 -25 % Fibrose pro Fläche
2 = 25-50 % Fibrose pro Fläche
3 = 50-75 % Fibrose pro Fläche
4 = > 75 % Fibrose pro Fläche
Immunhistochemie
Die immunhistochemische Färbung dient zur Detektion einzelner Proteine durch Antikörper-Protein Bindung.
In dieser Arbeit wurde die indirekte Immunfluoreszenzfärbung verwendet. Bei dieser Methode bindet ein unmarkierter Primärantikörper an das Antigen. Zur Detektion wurden fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper verwendet.
Protokoll der immunhistochemischen Färbung:
Entparaffinierung:
3 x 5 min Histoclear Rehydratation:
3 x 3 min 100% Alkohol
26
2 x 2 min 96% Alkohol
1 x 1 min 70% Alkohol
1 x 1 min 50% Alkohol
Kurz in Aqua dest.
Demaskierung:
Die Demaskierung kann unterschiedlich erfolgen. Entweder wird Trypsin oder ein Wasserbad mit Citratpuffer verwendet.
Demaskierung mit Trypsin40:
Proteolytische Andauung des Gewebes durch Trypsin um Antigenstrukturen freizulegen
1 Tablette Trypsin
15 min in feuchter Kammer bei 37°C
3 x waschen in PBS Demaskierung mit Citratpuffer:
Schnitte in mikrowellengeeignete Plastik- oder Glasgefäße stellen, die mit 10 mM Citratpuffer, pH 6 gefüllt sind.
Citratpuffer:
1 g Citronensäure-Monohydrat (Merck 1.00244.0500)
500 ml Aqua dest.
Mit 5 M Natronlauge auf pH 6 bringen.
Gefäß in das Mikrowellengerät stellen und bei 750 Watt inkubieren.
Präparate in Citratpuffer sprudelnd kochen. Es ist wichtig, dass die Schnitte während des Kochvorgangs mit Flüssigkeit bedeckt sind und nicht austrocknen.
8 min bei 750 Watt
2 min auf Stufe „keep warm“
8 min bei 750 Watt
Schnitte ca. 20 - 30 min in einem Eisbad auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Waschen in PBS Blockieren mit Donkeyserum:
Donkeyserum blockiert unspezifische Signale um eine Hintergrundfärbung zu minimieren.
30 min 10% Donkeyserum
3 x waschen in PBS Antikörper:
1 h mit primärem Antikörper in der spezifischen Verdünnung (s. Tabelle) inkubieren
3 x waschen in PBS
1 h mit passendem Sekundär-Antikörper (s. Tabelle) inkubieren
3x waschen in PBS
27 DAPI 1:1000 auf den Objektträger auftragen. DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol) bildet einen Komplex mit doppelsträngiger DNA und färbt die Zellkerne blau fluoreszierend mit einem Emissionsmaximum: 359 nm.
Das Eindecken der Objektträger erfolgte mit speziellem Eindeckmedium. In einigen Eindeckmedien ist DAPI bereits enthalten.
Die hier verwendeten Antikörper haben ein Emissionsmaximum von 555 nm und detektieren im roten Bereich. Die Eigenfluoreszenz der Nierentubuli ist im grünen Kanal sichtbar (Emission bei ca. 488 nm).
Primärer Antikörper Verdünnung Sekundärer Antikörper
F4/80 1:200 Alexa Fluor 555 goat anti-rat IgG
Fibronectin 1:200 Alexa Fluor 555 donkey anti rabbit (IgG H+L)
CD31 1:200 Alexa Fluor 555 goat anti-rat IgG
KIM-1 1:10 Alexa Fluor 555 donkey anti mouse IgG (H+L) KI-67 1:100 Alexa Fluor 555 donkey anti rabbit (IgG H+L) Kollagen III 1:100 Alexa Fluor 555 donkey anti rabbit (IgG H+L) Kollagen IV 1:50 Alexa Fluor 555 donkey anti goat IgG (H+L)
NGAL 1:1000 Alexa Fluor 555 goat anti-rat IgG
Auswertung:
Die Auswertung der einzelnen Färbungen erfolgte semiquantitativ bei einer 200-fachen Vergrößerung mit Beurteilung der Schädigung der Nierenmorphologie, der F4/80 positiven Makrophagen, bzw. GR-1 positiven Neutrophilen pro Gesichtsfeld. Faserfärbungen wurden mit Fibronectin sowie Kollagen IV gemacht. Für die Quantifizierung der interstitiellen Fibrose wurden wieder Flächenanteile beurteilt.
0= <5% betroffener Fläche
1= <25% betroffener Fläche
2= <50% betroffener Fläche
3= <75% betroffener Fläche
4= >75% betroffener Fläche
Bei einigen Färbungen erfolgte die Auswertung mit Hilfe der Quantifizierung mit der ImageJ Software. So wurde der Verlust an peritubulären Kapillaren mit Hilfe von CD31 Färbungen beurteilt. Es wurden 4 Bilder pro Präparat vom Kortex angefertigt und anschließend mit Hilfe von ImageJ ausgewertet. Der jeweilige Mittelwert für ein einzelnes Gewebe wurde zum Vergleich zwischen den Nieren herangezogen.
28 Quantitative PCR
2.2.5
Nach Organentnahme wurde das Gewebe in RNAlater Lösung bei -20°C gelagert.
RNAlater solution stabilisiert die RNA. Anschließend erfolgte das Umschreiben in cDNA, die dann für die quantitative PCR verwendet wurde. Nierengewebe an Tag 1, 7 und 21 wurde mittels qPCR analysiert.
Homogenisieren des Gewebes mit dem Quiagen-Kit - Röhrchen auftauen
- Nierenstückchen in 1,5 ml Eppis mit 350 µl RLT-Puffer und Mercapto-Ethanol (1ml RLT-Buffer und 10µl 2-Mercapto-Ethanol) geben und das Gewebe pottern.
- Lagerung bei -80°C möglich
Homogenisierte Probe auf lila „Qiashredder“-Säule aus Qiagen-Kit geben.
Probe 3 min bei 10.000rpm zentrifugieren
Säule verwerfen und 1 Volumen 70% Ethanol (350µl) und das Eluat auf MiniSäulen geben und 15 sec bei 10.000rpm zentrifugieren
Wässrige Phase (700µl) in rosa Säulen aus RNAeasy kit überführen
15 sec bei 10000rpm zentrifugieren, Eluat verwerfen. Säule weiterverwenden
DNAse Verdau:
- 350 µl RW-1 Buffer auf Säule geben, 15 sec. bei 10.000 rpm zentrifugieren, Eluat verwerfen, Säule weiterverwenden
- 80 µl Mastermix aus DNAse und Puffer (10 µl DNAse + 70 µl RDD-Puffer) 15 min auf Säule inkubieren lassen
- 350 µl RW-1 Puffer auf Säule geben, 15 sec. bei 10.000 rpm zentrifugieren, Eluat verwerfen
- 500 µl RPE Puffer auf Säule geben, 15 sec. bei 10.000 rpm zentrifugieren, Eluat verwerfen, Säule weiterverwenden
- 500 µl RPE Puffer auf Säule geben, 2min bei 10.000 rpm zentrifugieren, Eluat verwerfen, Säule weiterverwenden
Säule auf autoklavierte 1,5 ml Eppis setzen
30 µl RNase freies Wasser auf die Membran geben, 1 min warten, 1 min bei 10.000 rpm zentrifugieren
Konzentrationsbestimmung mit Eppendorf-Bio-Photometer
- Probe 1:25 mit DEPC-Wasser verdünnen (3 µl Probe + 72 µl DEPC Wasser) und bei 260 nm messen
Proben können bei -80C eingefroren werden
mRNA in cDNA umschreiben Für die qPCR wird cDNA verwendet.
cDNA-Synthese:
- 1 µg RNA mit DEPC-Wasser auf 10 µl auffüllen - 3,5 µl Primer hinzugeben
o 2 µl 5x Prime Script Buffer (for Realtime) o 0,5 µl Prime Script RT Enzyme Mix I o 0,5 µl Oligo dt Primer (50 µM) o 0,5 µl Random Hexamers (100 µm)
29 - Probe in den Thermal Cycler geben und Programm „Prime SCR“ wählen
- Lagerung der cDNA bei -20°C möglich Real-time quantitative PCR
Real-time quantitative PCR mit TaqMan Takara Ansatz o 10 µl Takara
o 3 µl DEPC-Wasser o 2 µl Primer
- 15 µl Ansatz und 5 µl cDNA pro Well pipettieren, Triplets werden verwendet sowie Kalibrator und Nullprobe
- Nach dem Pipettieren Platte 5 min bei 1200 rpm zentrifugieren - qPCR mit dem Light Cycler
Als Housekeeper und nicht reguliertes Gen wurde β-Aktin zur Normalisierung verwendet.
Primer für pro-inflammatorische Gene: TNFα, IL6, MCP-1, IL17A und für pro-fibrotische Gene: Kollagen1α1, CTGF, Fibronectin wurden verwendet.
Durchflußzytometrie zur Charakterisierung der Leukozyten 2.2.6
Die Charakterisierung der Leukozyten-Subpopulationen im Rahmen der IRI induzierten Entzündung erfolgte am Tag 1 und 7 mittels Durchflusszytometrie (FACS Analyse).
70% des Nierengewebes wurde entnommen und zerkleinert. Das Gewebe wurde in Gentle Macs Röhrchen mit 4 ml DMEM und 500 U/ml Kollagenase2 gegeben und 20 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurden die Nierenstücke mit dem Gentle Macs Dissociator mit Programm B01 in C Tubes homogenisiert. Danach wurden die Tubes noch einmal für 20 min im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurden die Proben mit 6 ml PBS durch ein 70 µm Nylongewebe (mesh) filtriert um den Zelldetritus zu entfernen. Dann erfolgte eine 7 minütige Zentrifugation bei 400 G. Dieser Vorgang wurde insgesamt dreimal wiederholt. Anschließend wurden die Zellen in 10 ml PBS gelöst. Nach dem Waschen wurden die Zellen in RBC Lyse Puffer resuspendiert und 1 min inkubiert.
Die Erythrozytenlyse wurde durch Zugabe von 20 ml PBS und 3 min Zentrifugation bei 1250 rpm gestoppt. Dann erfolgte die Zellzahlbestimmung durch Anfärbung der Zellen mit Trypan blau (1:10 mit PBS verdünnt). Die Auszählung der Zellen erfolgte in der Neubauer Zählkammer. Die Zellen wurden in zwei Fraktionen aufgeteilt. Die kleinere Fraktion mit mindestens 4x105 Zellen wurde für die Oberflächenfärbung verwendet und die große Fraktion mit mindestens 106 Zellen wurde für die intrazelluläre Färbung benötigt. Die Oberflächenfärbung erfolgte mit einer Lebend / Tod Färbung 1:1000 mit PBS. Die Zellen wurden in 250 µl resuspendiert und für 30 min bei 4°C im Dunkeln
30 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in 1 ml FACS Puffer (PBS+0,5% FCS) gewaschen und 3 min bei 1250 rpm zentrifugiert. Daraufhin wurden die Zellen 20 min in der jeweiligen Antikörper-Lösung mit FACS Puffer bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Die Antikörper Kombinationen sind in einem myeloiden Zell Panel und einem T-Zell Panel kombiniert worden:
[M] Myeloides Zell-Panel FITC PE PerCP-
Cy5.5
PE-Cy7 APC eF780 eF450 eF506 FcR Block CD49b Ly6-C CD11c Ly6-G F4/80 CD11b CD45 Viability
Dye
1:100 1:600 1:400 1:600 1:100 1:600 1:600 1:1000 1:100
[T] T-Zell Panel
FITC PE PerCP- Cy5.5
PE-Cy7 APC eF780 eF450 eF506 FcR Block CD8a CD19 CD3e CD25 TCRb CD4 CD45 Viability
Dye
1:600 1:100 1:200 1:200 1:600 1:600 1:600 1:1000 1:100
Nach der Inkubation wurden die Zellen mit FACS Puffer gewaschen um nicht spezifische Bindungen der Antikörper an den Fc Rezeptoren der Zellen zu reduzieren.
Die große Fraktion mit 106 Zellen wurde für die intrazelluläre IL17A Färbung mit PMA und Ionomycin 1:1000 re-stimuliert. Die Inkubationszeit betrug 6 h. Nach 2 h wurde Bredfeldin A 1:1000 hinzugefügt, um den Golgiapparat zu blockieren und die Freisetzung der Proteine durch den Golgiapparat zu stoppen. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Zellen mit 1ml FACS Puffer gewaschen und 3 min mit 1250 rpm zentrifugiert. Die Lebend / Tod Färbung erfolgte wie oben. Anschließend wurden die Zellen in 2% PFA für 30 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Gewaschen wurden die Zellen mit 0,5% Saponin Puffer in PBS und bei 1250 rpm für 3 min zentrifugiert. 100 µl Antikörperlösung wurden hinzugefügt. Für die intrazelluläre Färbung wurden die Zellen für 30 min in der Antikörperlösung laut Panel bei 4°C im Dunkeln belassen.
31 IC Panel
FITC PE PerCP- Cy5.5
PE-Cy7 APC eF780 eF450 eF506 FcR Block CD8a TCRgd CD3e IFNg TCRb CD45 IL17A Viability
Dye
1:600 1:200 1:200 1:200 1:600 1:600 1:20 1:1000 1:100
Nach dem Waschen mit FACS Puffer wurden die Zellen in 500 µl FACS Puffer resuspendiert und mit dem FACS Canto II analysiert. Als Kontrolle dienten Milz-
Leukozyten. Dafür wurde das Gewebe 30 min bei 95°C auf einem Heizblock gekocht und anschließend auf Eis abgekühlt. Die Lebend / Tot Färbung erfolgte wie oben beschrieben.
Zur späteren Kompensation wurde 1 µl vom jeweiligen Antikörper zu 20 µl compensation beads gegeben. Die Datenauswertung erfolgte mit der Kaluza Software 1.3 der Firma Beckmann Coulter, Krefeld. Es wurden jeweils 50.000 Zellen analysiert.
Gating-Strategie für die FACS-Analyse
Nach dem Verdau des Nierengewebes und der Zellisolation wurden die Zellen
entsprechend ihres Streuungsverhaltens sortiert. Für das Gating der lebenden Leukozyten (CD45+) wurde die Lebend / Tod Färbung genutzt. Anschließend wurden CD11b+
myeloide Zellen differenziert in Ly6-G+ (Neutrophile), CD11c+ (dendritische Zellen) und CD49b+ (natürliche Killerzellen, NK-Zellen). Dann wurde ein Gate gesetzt, welches alle anderen Zellen außer Neutrophile, dendritische Zellen und NK-Zellen enthielt. Diese Zellen wurden weiter differenziert in CD11b+ (myeloide Zellen) und F4/80+ (Monozyten/
Makrophagen). Die aktivierten Makrophagen wurden durch Ly6-C+ Expression aus der Population von CD11b+ / F4/80+ Zellen beurteilt (Abb. 8).
34 entsprechend den in der Literatur verwendeten Dosierungsintervallen41-43. Die Dosis betrug 0,432 mg/ 25 g Körpergewicht. Der Antikörper wurde uns freundlicher weise von Prof.
Immo Prinz vom Institut für Immunologie der MHH zur Verfügung gestellt.
Statistik 2.2.8
Die statistische Auswertung erfolgte mit der Graph Pad prism Software (Version 5.0c). Die Auswertung erfolgte mittels T-Test für unverbundene Proben beim Vergleich von zwei Gruppen oder mittels one way ANOVA beim Vergleich mehrerer Gruppen. Eine Signifikanz wurde ab einer Fehlerwahrscheinlichkeit von *p < 0,05 angenommen. Die Daten sind mit Mittelwert und Standardfehler (MW ± SEM) angegeben.
35
3 Ergebnisse
3.1 Akutes Nierenversagen bei IL-17A defizienten Tieren
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Einfluss von IL-17A in Bezug auf das akute Nierenversagen untersucht. Durch einseitiges Abklemmen der Nierengefäße für 45 Minuten wurde ein akutes AKI und spätere Nierenfibrose induziert. Verglichen wurden IL-17A defiziente Tiere und Wildtyp-Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag 1, 7, 21).
Um Unterschiede in Bezug auf die frühe Inflammation zu beurteilen, wurde ein Teil der Analysen am Tag 1 durchgeführt, um den AKI Score und die Neutrophilen-Inflammation zu untersuchen. An Tag 7 wurden die Ausbreitung der Entzündungsreaktion und die Makrophagen-Aktivierung untersucht. Des Weiteren wurde die Ausbildung der Nierenfibrose nach 3 Wochen analysiert. Zusätzlich wurde ein neutralisierender anti-IL-17A Antikörper bei WT-Mäusen vor und nach Induktion des IRI injiziert. Zur Beurteilung wurden Histologie, qPCR und FACS Analysen durchgeführt.
Effekt einer IL-17ADefizienz auf das AKI 3.1.1
Bei IL-17A defizienten Mäusen wurde mittels IRI ein akutes Nierenversagen induziert. Im WT-Modell führt der IR-Schaden zu einer dauerhaften Hochregulation von IL-17A mRNA, was bei IL17A defizienten Tieren blockiert war (Abb. 11). Als Kontrolle diente die nicht geklippte kontralaterale Niere der WT Mäuse.
Die IL-17A mRNA Level waren in den betroffenen WT-IRI Nieren im Vergleich zu den Kontrollen an Tag 21 signifikant hochreguliert (IRI WT: 0.000009055 ± 0.000001834 vs.
Kontrolle: 0.0000002687 ± 0.00000003027, *** p< 0,001). Wie erwartet zeigte sich keine mRNA Expression von IL-17A bei den IL-17A defizienten Tieren.
Abbildung 12: IL-17A mRNA an Tag 21
An Tag 21 zeigte sich keine Hochregulation der IL-17A Expression bei den IL-17A-/- Tieren. Ausschließlich im WT-IRI-Nierengewebe war eine erhöhte Expression von IL-17A nachweisbar. Die Kontrollniere zeigte im Vergleich dazu ebenfalls keine IL- 17A Expression. ***p<0,001
36 IL-17A-/- verhindert nicht das AKI nach IRI
3.1.2
Nach der Induktion eines IRI kommt es zum AKI. Zur Beurteilung des AKI wurde eine PAS-Färbung zu den verschiedenen Zeitpunkten an Tag 1, 7 und 21 als Übersichtsfärbung genutzt. Als Kontrollnieren dienten die jeweiligen nicht geklippten kontralateralen Nieren der Tiere. Bereits an Tag 1 nach IRI zeigte die PAS-Färbung einen schweren Tubulusschaden mit weitgestellten Tubuli, abgeflachtem Tubulusepithel, Verlust des Bürstensaums sowie Zelldetritus in den geschädigten Tubuli. Außerdem zeigten sich eingewanderte Entzündungszellen (Abb. 13 A-C). Erstaunlicherweise zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen IL-17A defizienten und Wildtyp-Tieren (AKI Score:
IRI IL-17A-/-: 4 ± 0 vs. IRI WT: 3,909091 ± 0,3015113). Im Vergleich dazu zeigte sich bereits an Tag 1 ein signifikanter Unterschied zwischen den geschädigten IRI-Nieren und der Kontrollgruppe (Kontrolle: 0,005556 ± 0,02357, *** p<0,001) Die Kontrollnieren zeigten eine intakte Nierenmorphologie mit erhaltenem Bürstensaum. In der semiquantitativen Auswertung ergab sich ein AKI-Score von 4 im Bereich des äußeren Marks, somit waren über 75% der Tubuli vom AKI betroffen. Der Kortex war demgegenüber weniger geschädigt. Hier ergab sich ein Score von 2-3 mit ca. 50-75%
geschädigter Tubuli. Am Tag 7 hatte sich der Schaden deutlich verschlimmert. Der Bürstensaum in den IRI-Gruppen war nicht mehr erhalten (Abb. 13 D-F). Es zeigte sich abgeflachtes Epithel und eine beginnende Nekrose. Davon waren alle IRI-Gruppen gleichermaßen betroffen (AKI-Score: IRI IL-17A-/-: 4,00 ± 0 vs. IRI WT: 3,88 ± 0,354).
Die Kontrollnieren waren nicht geschädigt. Sie zeigten eine normale Nierenmorphologie.
Nach 3 Wochen war es zu einem schwerem AKI mit Fibrose und Nekrosen gekommen (Abb. 13 G-I). Auch zu diesem Zeitpunkt waren die Kontrollnieren signifikant weniger betroffen (Kontrolle: 0,1190 ± 0,2695). Wiederum zeigte sich kein Unterschied zwischen IL-17A-/- und WT-Tieren (AKI Score: IRI IL-17A-/-: 4,00 ± 0 vs. IRI WT: 3,938 ± 0,1768).
Überraschenderweise verursachte der akute IRI ein gleichermaßen stark ausgeprägtes AKI in IL-17A-/- und WT Tieren. Die Defizienz von IL-17A zeigte keinen protektiven Effekt in Bezug auf den Nierenschaden nach IRI.
38 IL-17A-/- und γδ T-Zell-/- verhindert nicht die Ausbreitung der
3.1.3
Entzündungsreaktion nach IRI
Myeloide Zellinfiltration ist eine frühe Reaktion auf den IR-Schaden. Zuerst kommt es zur Einwanderung von neutrophilen Granulozyten, später von Makrophagen und Lymphozyten.
Der Verlauf der Entzündung wurde an den verschiedenen Zeitpunkten an Tag 1, 7 und nach 3 Wochen untersucht. Hierzu diente die indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem Antikörper F4/80, der Monozyten und Makrophagen anfärbt (rotes Signal). Die Autofluoreszenz der Tubuli erscheint leuchtend grün angefärbt.
Einen Tag nach IRI war vor allem im Bereich des äußeren Marks eine Infiltration mit Makrophagen zu sehen. Das Nierengewebe von IL-17A-/- und WT-Tieren zeigte identische
F4/80 positive Zellinfiltration (F4/80 Score: IRI IL-17A-/-: 1,83 ± 0,258 vs.
IRI WT: 1,67 ± 0,258). Ca. 50% des tubulo-intestitiellen Raumes waren betroffen. Die Kontrollnieren zeigten nur wenig F4/80 positive Zellen (Kontrolle: 0,8438 ± 0,3010;
Abbildung 14 J). Innerhalb der ersten 7 Tage stieg die Infiltration der Makrophagen nach IRI auf >75% an (Abb. 14 K) und blieb bis zu Tag 21 (Abb. 14 L) konstant auf diesem hohen Level. Die Ausdehnung der F4/80 positiven Zellen in IL-17A-/- und WT zeigten sowohl an Tag 7 (IRI IL-17A-/-: 4,00 ± 0,000 vs. IRI WT: 4,00 ± 0,000) als auch an Tag 21 (IRI IL-17A-/-: 4,00 ± 0,000 vs. IRI WT: 3,833 ± 0,4082) keinen Unterschied. Die kontralaterale Niere zeigte an Tag 7 (Kontrolle: 0,5294 ± 0,2144) sowie an Tag 21 (Kontrolle: 0,8438 ± 0,3010) nur eine milde F4/80+ Zellinfiltration.
41
(C-E) Repräsentative Blots für Ly6-C /CD11b gating. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den IRI-Gruppen. ***p<0,001
Zusätzlich wurde der Anteil an Neutrophilen an Tag 1 anhand von Ly6-G+ / CD11b+
Zellen analysiert. Der Anteil der Ly6-G+ Zellen an lebenden Leukozyten (LL) war in beiden Experimentgruppen gleich (IRI IL-17A-/-: 68,77 ± 2,226 vs. IRI WT: 62,26 ± 8,152). 60-70% der Zellen waren Ly6-G+. Nur 5% der Zellen in der Kontrollgruppe waren Ly6-G+ (Kontrolle: 4,732 ± 1,523; Abb. 16 A)
Auch an Tag 7 war die Infiltration mit neutrophilen Granulozyten in den IRI Gruppen erhöht (IRI IL-17A-/-: 12,85 ± 5,236 vs. IRI WT: 11,85 ± 2,546). Gegenüber Tag 1 war die Zahl der Neutrophilen allerdings schon wieder rückläufig, der Anteil der neutrophilen Granulozyten lag nur noch zwischen 10-15%. Es zeigte sich kein Unterschied zwischen IL-17A-/- und WT. Die Kontrollgruppe war signifikant weniger betroffen (Kontrolle: 4,749
± 1,843), hatte jedoch auch einen Anteil von 5%.
Abbildung 16: Neutrophilen Infiltation nach IRI an Tag 1 und 7
Die Infiltration von Neutrophilen wurde mittels FACS-Analyse an Tag 1 und 7 analysiert.
(A) Es zeigte sich an Tag 1 kein Unterschied zwischen den IRI-Gruppen. 60-70% der lebenden Leukozyten waren Ly6-G+. In der Kontrollniere waren nur 5% der Zellen Ly6-G+.
(B) Die Zahl der Neutrophilen war an Tag 7 rückläufig. Es zeigte sich ebenfalls kein Unterschied zwischen den IRI-Gruppen. Die Kontrollgruppe war weiterhin signifikant weniger betroffen. ***p<0,001
Des Weiteren wurde auch die Lymphozyteninfiltration an Tag 7 mittels FACS Analyse untersucht. IRI führte auch zu einer Rekrutierung von T-Lymphozyten. Nach IRI kam es zu einer gesteigerten CD3e+ Zellinfiltration gleichermaßen bei IL-17A-/- und WT Tieren (Abb. 17 A-D). Die kontralaterale Niere wies eine niedrige Anzahl von CD3e+ Zellen auf.
Stimulierte γδ-T-Zellen produzieren IL-17A. Da γδ-T-Zellen ein wichtiger Faktor zur IL- 17A Produktion sind, wurden die Zellen ex vivo mit Ionomycin/PMA stimuliert und die