Die Mikrozirkulation in der Niere ist äußert komplex. Im Bereich der Nierenrinde und des Nierenmarks befindet sich ein dichtes Netz peritubulärer Kapillaren, die von efferenten Arteriolen gespeist werden (Abb. 2A)13,14. In der Niere besteht ein Sauerstoffgradient vom Kortex zum äußeren und inneren Mark. Der Sauerstoffpartialdruck im Bereich des Kortex beträgt 40-60 mmHg und reduziert sich im äußeren Marks auf 10-20 mmHg (Abb. 2B).
Dies veranschaulicht, dass das äußere Mark als erstes durch Sauerstoffmangel (Hypoxie) z.B. bei Blutdruckabfällen geschädigt wird, hier ist die Sauerstoffreserve am geringsten13.
Abbildung 2: Aufbau Nephron und Sauerstoffgradient
(A) Aufbau eines gesunden Nephrons mit dem Cortex, dem äußeren Mark und dem inneren Mark (B) Sauerstoffgradient zwischen Cortex und Nierenmark13.
Der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) ist ein wichtiger Grund für das Auftreten eines AKI. Es kommt zu einem Missverhältnis zwischen Gewebe-Oxygenierung und Sauerstoffbedarf. Das führt zu einem Polaritätsverlust der Tubulusepithelzellen und später zu Nekrose und Apoptose sowie zum Abschilfern abgestorbener Zellen in das Tubuluslumen, was dann zu einer mechanischen Obstruktion und zum Fortschreiten des AKI beitragen kann.
A B
5 In Folge des IRI kommt es zum Verlust von peritubulären Kapillaren und im weiteren Verlauf zu Mikrozirkulationsstörungen mit verminderter Perfusion und Sauerstoffversorgung. Die Minderdurchblutung der Niere führt zum Untergang von Tubulusepithelzellen, Apoptose und Nekrose, des Weiteren tritt eine akute Entzündungsreaktion auf. Die Nierenfunktion wird durch diese Faktoren weiter eingeschränkt. Das akute und chronische Nierenversagen haben ähnliche Pathomechanismen. Fehlregulierte Apoptose, abnormale Zellantwort, übersteigerte Immunantwort, sowie Hochregulation pro-inflammatorischer Signale und progredienter Kapillarverlust führen im Verlauf zum chronischen Nierenversagen mit fortschreitender Fibrose12.
Während der Entzündungsreaktion kommt es zur Aktivierung und Hochregulation von Adhäsionsmolekülen wie ICAM, VCAM und Selektinen und dem Einwandern von Leukozyten. Zell-Zell-Kontakte werden geschädigt und es bilden sich lokale Ödeme aus, die die Mikrozirkulation weiter einschränken. Im Gefäßsystem können außerdem Mikrothromben auftreten (Abb. 3)13.
7 Entzündungsmechanismen beim Ischämie-Reperfusionsschaden
1.3.1
Der Ischämie Reperfusionsschaden führt zu strukturellen Veränderungen im Gewebe mit Zelluntergang und Hochregulation von pro-inflammatorischen Faktoren wie Chemoattractants und Adäsionsmoleküle. Dies induziert die Einwanderung von Leukozyten im Rahmen der Immunantwort (Abb. 4)13.
Das angeborene (innate) Immunsystem wird innerhalb von Minuten aktiviert und bildet die erste frühe Phase der Immunantwort. Diese Antwort erfolgt nicht-antigen-spezifisch. Es kommt zur Einwanderung von neutrophilen Leukozyten, Monozyten/Makrophagen, dendritischen Zellen und natürlichen Killerzellen. Im weiteren Verlauf wandern auch T- Lymphozyten ein und die erworbene (adaptive) Immunantwort wird aktiviert15. Die Makrophagen produzieren auch Chemokine und anti-inflammatorische Zytokine wie IL-10 und TGFβ, die zum späteren Reparaturprozess beitragen16.
9
1.4 T-Zell Populationen als Modulatoren der Immunantwort
Die T-Zellen sind ein wesentlicher Bestandteil der Immunantwort beim IRI der Niere17-19. T-Zellen reifen im Thymus, es gibt verschiedene T-Zell-Populationen, dazu gehören die CD4+ T-Helferzellen und die CD8+ zytotoxischen T-Zellen20.
Die CD4+ T-Helferzellen differenzieren weiter in TH1, TH2 und TH17-Zellen (Abb. 5).
TH1 Helferzellen sind an der zellvermittelten Immunität beteiligt. Sie produzieren IL-2 und INF-γ. Die TH2 Helferzellen sind Teil der humoralen Immunantwort gegen Parasiten und produzieren IL-4, IL-5 und IL-13. Ein weiterer T-Zell-Subtyp sind die TH17-Zellen, welche zur Bekämpfung von Infektionen dienen und an verschiedenen Autoimmunerkrankungen beteiligt sind. Sie produzieren neben IL-21, IL-22, IL-23, TNFα, IL-6 und GM-CSF auch IL-1721-23.
Abbildung 5: CD4-Subtypen
Naive CD4+ Zellen differenzieren sich in verschiedene Subtypen. Dazu gehören Th17-Zellen. Durch den Einfluss von verschieden Zytokinen differenzieren Th17-Zellen weiter zum Beispiel in IL-17A produzierende Th17-Zellen. Nicht alle Th17-Zellen scheinen pathogen zu sein24.
Die Zytokine IL-6, TGFβ, IL-21 und IL-23 sowie der STAT3 Signalweg führen zur Differenzierung von TH-Zellen in TH17-Zellen. Dazu sind zwei Transkriptionsfaktoren, der retinoic acid related orphan receptor γ-t (ROR-γt) und der RA related (ROR-α), wichtig25,26. IL-6 und TGFβ sind ebenfalls beim IRI hochreguliert25. Außerdem sind CD4+ regulatorische T-Zellen (Treg) an der Differenzierung zu TH17-Zellen beteiligt. Dabei spielen IL- 6 sowie IL-1 und IL-23 eine wichtige Rolle. Die Differenzierung wird kontrolliert durch IL-1β und IL-2. IL-1β ist nicht nur auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert sondern auch auf γδ T-Zellen21. IL-23 wird von aktivierten dendritischen Zellen produziert und kann durch Bindung an den IL-23R auf T-Zellen die Produktion von
10 IL-17A induzieren22. Es gibt Hinweise darauf, dass nicht alle TH17-Zellen pathogen sind und Entzündung induzieren. Der Signalweg über TH17 Differenzierung und IL-17 Produktion durch TGFβ und IL-6 scheint nicht pathogen zu sein. Demgegenüber zeigt die IL-23/IL-17 Achse zur Differenzierung der TH17 Zellen pathogene Eigenschaften24. CD4+ T-Zellen scheinen den stärksten Einfluss auf die T-Zell-Antwort beim IRI zu haben.
Sie sind die Hauptproduzenten von IL-17A in der Niere21. Studien haben allerdings gezeigt, dass es neben den CD4+ T-Zellen noch weitere IL17-A produzierende Zellen gibt.
Hierzu zählen unter anderem die γδ T-Zellen (Abb. 6)18.
T-Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche einen T-Zell-Rezeptor (TCR). Hier unterscheidet man die T-Zellen mit der αβ-Kette, die für T-Helferzellen und zytotoxische T-Zellen charakteristisch sind und die T-Zellen mit der γδ-Kette19.
Abbildung 6: IL-17A Signalweg und Bedeutung in der Immunantwort
Naive T-Vorläuferzellen differenzieren zu TH17-Zellen. Diese werden durch TGFβ, IL-6, IL-21, IL-1β und IL-23 stimuliert und führen zur Bildung von Zytokinen wie IL-17A, welches außerdem von γδ T-Zellen, αβ T -Zellen und natürlichen Killerzellen gebildet wird21.
γδ T-Zellen 1.4.1
Die γδ-T-Zellen stellen eine kleine Subgruppe der T-Zellen dar und bestehen aus einer γ und einer δ Kette. Die genaue Rolle der γδ T-Zellen ist noch nicht hinreichend aufgeklärt.
Sie präsentieren keine MHC-Moleküle und produzieren keine Antikörper, stattdessen wird ihnen eine wichtige Rolle in der Immunantwort innerhalb der ersten 72 Stunden nach dem
11 schädigenden Ereignis zugeschrieben19. Eine Funktion scheint die Produktion von Zytokinen wie IL-17A und IL-17F zu sein. In einigen Fällen sind die γδ-T-Zellen dominanter in der IL-17A Produktion als die CD4+ T-Zellen. So scheinen die γδ-T-Zellen bei bakteriellen Infektionen die Hauptgruppe von IL-17 produzierenden Zellen zu sein22. In der Peripherie sind die γδ-T-Zellen als Effektor-Gedächtniszellen vorhanden. Dadurch wird IL-17 schnell produziert und es kommt zur Immunantwort bevor CD4+ T-Zellen zu TH17 Zellen differenziert sind. In der späteren Phase der Immunantwort ab Tag 6 stehen CD4+ Th17 Zellen zur Verfügung und sind an der IL-17A Produktion beteiligt27.
IL-21 und TGFβ vermitteln die Differenzierung von γδ T-Zellen. Bereits in gesunden Nieren scheinen γδ T-Zellen im Gewebe vorhanden zu sein und könnten zu der schnellen Immunantwort beitragen22,27. Die γδ-T-Zellen scheinen eine Rolle als Vermittler zwischen angeborener Immunantwort und den CD4+ T-Zellen zu spielen19. Daher könnten sie ein attraktiver Angriffspunkt für Therapien sein.
Interleukin 17A 1.4.2
IL17-A ist ein pro-inflammatorisches Zytokin, welches von aktivierten T-Zellen produziert wird23. Einer der pro-inflammatorischen Effekte ist die Rekrutierung von Monozyten und Neutrophile an den Ort der Entzündung28. Naive T-Zellen werden durch das immunregulatorische Zytokin TGFβ und dem pro-inflammatorischen Zytokin IL-6 stimuliert, um IL-17 zu bilden.
Die IL17- Familie besteht aus 6 Isoformen: IL17-A bis IL17-F. IL17-A liegt als Dimer vor23. Es ist auch bekannt als zytotoxisch T-Lymphozyt assoziiertes Antigen 8 und ist ein Glykoprotein, das aus 155 Aminosäuren besteht29. Produziert wird IL-17A durch verschiedene Zelltypen während der Immunantwort. Hierzu gehören die γδ T-Zellen, natürliche Killerzellen, neutrophile und eosinophile Leukozyten sowie TH17-Zellen.
IL-17A führt zur Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-8, G-CSF) durch Fibroblasten. Dadurch werden die Neutrophilen aktiviert und es kommt zur Expansion der myeloiden Zellreihen30. Außerdem stimuliert IL-17A eine Vielzahl von Zellen pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1β, IL-6 und TGF β freizusetzen und wirkt mit anderen Zytokinen wie IL-1β, IL-6, IFNγ und TNF α zusammen, um eine pro-inflammatorische Antwort auszulösen. Durch die Kombination aus Stimulation von Neutrophilen und Mobilisation von T-Lymphozyten ist IL-17A sowohl Teil der angeborenen als auch der erworbenen Immunantwort31-33.
12 Der Rezeptor für IL-17A ist der Interleukin 17 Rezeptor (IL-17R). Die IL-17 Rezeptorfamilie hat 5 Untereinheiten, die als IL-17A Rezeptor A bis E bezeichnet werden.
IL-17A bindet an einen Komplex aus zwei IL-17RA Ketten und eine IL-17RC Untereinheit. Dies führt zur Aktivierung von TRAF6 und dadurch zur Aktivierung von NF-κB und MAP-Kinasen als Mediatoren der Inflammationskaskade33.
IL-17A ist an der Pathogenese verschiedener Erkrankungen beteiligt, dazu gehören chronische Entzündungen und Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, inflammatorische Darmerkrankungen, systemischer Lupus erythematodes, Glomerulonephritiden und Psoriasis. Des Weiteren wurde IL-17A in der Pathogenese von Leberfibrose, Leberzell-Karzinomen und Lungenentzündungen charakterisiert26,33-36.
13
1.5 Zielsetzung dieser Arbeit
Bisher gibt es keine etablierte Therapie zur Verhinderung des akuten Nierenversagens. Da es gerade im Kontext mit großen Operationen häufig auftritt, ist die Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen zur Vermeidung und besseren Ausheilung des AKI und des IRI wichtig.
Aufgrund der Pathophysiologie von IL-17A und auch der Rolle von T-Zellen in der Produktion von IL-17 war es Ziel dieser Arbeit, den Einfluss einer IL-17A Defizienz oder Hemmung und auch einer γδ T-Zell Defizienz im Mausmodell des AKI zu untersuchen.
Als Modell wurde ein akuter renaler IRI induziert, der unbehandelt innerhalb von drei Wochen zu einem chronischen Nierenversagen führt. Es handelt sich um ein IRI-CKD Modell37,welches in der Arbeitsgruppe bereits mittels funktionellem MRT gut
charakterisiert wurde38.
Im Rahmen der Studie wurden die einzelnen Phasen des IRI an Tag 1, 7 und 21 untersucht.
Dies sind die Zeitpunkte, wo zunächst die myeloiden Zellen infiltrieren und ein deutlicher akuter Gewebeschaden auftritt (Tag 1), die Entzündungsreaktion sich unter Beteiligung der T-Zellen ausbreitet (Tag 7) und schließlich die chronische Phase mit vermehrter
Makrophagen-Infiltration und Fibrosierung (Tag 21) das chronische Nierenversagen charakterisiert. Zur Analyse wurden histologische und immunhistochemische Färbungen, qPCR, sowie Durchflußzytometrie zur Charakterisierung der Leukozyten-Subpopulationen durchgeführt.
Ergänzend zu den Untersuchungen an den IL-17A defizienten Mäusen wurde auch eine Therapiestudie mit einem IL-17A blockierenden Antikörper untersucht.
14
2 Material & Methoden 2.1 Material
Mäuse 2.1.1
Für die Versuche wurden folgende Mausstämme verwendet:
Wildtyp Mäuse, Stammbezeichnung: BALB/cAnNCrl (Charles River, Sulzfeld, Deutschland)
IL17A-/- Mäuse, Stammbezeichnung: BALB/c-Il17atm1Ywi (Zentrales Tierlaboratorium, Medizinische Hochschule Hannover)
γδ T-Zell-/- Mäuse, Stammbezeichnung: CBy.129P2(B6)-Tcrdtm1Mom/SzJ (Zentrales Tierlaboratorium, Medizinische Hochschule Hannover)
Wildtyp Mäuse, Stammbezeichnung: C57BL/6JHanZtm (B6, Zentrales Tierlaboratorium, Medizinische Hochschule Hannover)
In allen Experimenten wurden männliche Mäuse im Alter von 11-15 Wochen mit einem Gewicht zwischen 23-28 g verwendet. Die Tiere wurden im Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) gezüchtet (Leiter: Prof. André Bleich). Gemäß Tierschutzgesetz waren alle Tierversuche vor Beginn der Studie vom Landesamt für Lebensmittelsicherheit (LAVES;
Aktenzeichen: 33.9-42502-04-12/0916 und 33.14-42502-04-12/0916-Völker) genehmigt worden. Die Tiere wurden artgerecht bei konstantem Lichtzyklus 14/10 Tag/Nacht-Rhythmus mit freiem Zugang zu Wasser und Futter (Altromin 1324 Standard) im Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten.
Monitoring der Mäuse 2.1.2
Alle Versuchstiere wurden täglich kontrolliert und mittels eines Belastungscores (s.
Tabelle) charakterisiert. Bei einem Score von 3 und kleiner erfolgte die unmittelbare Beendigung des Versuches. Als Abbruchkriterium für die Versuche galt das Auftreten von Ödemen, das Auftreten neurologischer Störungen, das Verweigern der Nahrungsaufnahme und Passivität der Tiere. Bei Verhaltensauffälligkeiten der Tiere oder struppiger Erscheinung wurde das Kreatinin vorzeitig gemessen, ein Kreatinin von >300 µmol/l war ebenfalls als Abbruchkriterium definiert.
15 Belastungsscores
Score Qualität Merkmale
6 Sehr aktiv Kräftig, neugierig, schnelle Bewegungen
5 Aktiv Neugierig, schnelle, vereinzelte Aktivitätspausen 4 Eingeschränkt aktiv Reagiert auf Zuwendung, häufige Aktivitätspausen
3 Ruhig Desinteressiert an der Umwelt, selten Aktivität, schläfrig, herabgesetzte Nahrungsaufnahme
2 Lethargisch Keine Aktivitäten, verharren, keine Nahrungsaufnahme 1 Moribund Keine Aktivität, Atemschwierigkeiten, Tod zu erwarten
Material für die Operationen 2.1.3
Material Hersteller
Wärmetisch C10-B3 Haake, Karlsruhe, Deutschland
Chirurgisches Mikroskop M690 LEICA Service, Bensheim, Deutschland Anästhesieeinheit Univentor 400 TSE systems, Bad Homburg, Deutschland
Spritzenpumpe TSE systems, Bad Homburg, Deutschland
Nadelhalter für Bauchwandnähte BM54 Aesculap, Tuttlingen, Deutschland Chirurgische Pinzette BD537 Aesculap, Tuttlingen, Deutschland
Schere BC545 Aesculap, Tuttlingen, Deutschland
Mikropinzette BD329 Aesculap, Tuttlingen, Deutschland Nichttraumatische Gefäßklemme FE690K Aesculap, Tuttlingen, Deutschland Nahtmaterial Ethilon 4-0 PS-3 EH7761H Ethicon, USA
Nahtmaterial Prolene 7-0 BV-1 8701H-S Ethicon, USA
Isofluran Baxter, Unterschleißheim, Deutschland
Butorphanol Chemos GmbH, Regenstauf, Deutschland
PBS 10% Gibco by Life Technologies Nr.:14200-067
Butterfly Nadel 27 G Dispomed Witt oHG, Gelnhausen, Deutschland
Paraformaldehyd (PFA) 2%, 4% Sigma Aldrich Xylol Ersatz, SUB-X Clearing Agent Nr.:
3803672EF
Leica Paraffin, Surgipath Paraplast Tissue
Embedding Medium Nr.: 39601006
Leica
Deckgläser 24x50mm Menzel Gläser, Thermo Scientific Poly-L-Lysine Solution 0,1% Sigma-Aldrich
16 Färbungen
2.1.5
PAS Färbung
Material Hersteller
Roti-Histol (Roth No.: 6640.1) Carl Roth, Deutschland
Periodicsäure (Merck No.: 1.00524.0025) Merck, Darmstadt, Deutschland Schiff's Reagenz (Merck No.:
1.09033.0500)
Merck, Darmstadt, Deutschland Hematoxylin (Fluka No.: 03971) SIGMA Aldrich
Roti-Histokitt, synthet (Roth No.: 6638.1) Carl Roth, Deutschland
Sirius Rot Färbung
Material Hersteller
Roti-Histol (Roth No.: 6640.1) Carl Roth, Deutschland PMA (Phosphormolybdic acid in aqua)
dest.)
Sirius red Direct Red 80 Pulver SIGMA Aldrich Picrid acid solution 1,3% SIGMA Aldrich Masson Trichrom Färbung
Material Hersteller
Wolframphosphorsäure (Roth No.: 2635.2) Carl Roth, Deutschland Orange G (Roth No. 0318.2) Carl Roth, Deutschland Xyloidin-Ponceau (Sigma No.: P2395-25G) SIGMA Aldrich
Anilinblau (Roth No.: 4002.1) Carl Roth, Deutschland Hämatoxylin (Roth No.: 3816.3) Carl Roth, Deutschland Eisen-III-chlorid (Roth No.: 5192.1) Carl Roth, Deutschland Azophloxin (Sigma No.: 11640-25G) SIGMA Aldrich
Säurefuchsin (Roth No.: T128.1) Carl Roth, Deutschland Bouins Solution (Sigma No.:HT10132-11) SIGMA Aldrich
Immunhistochemie 2.1.6
Material Hersteller
Roti-Histol (Roth No.: 6640.1) Carl Roth, Deutschland Trypsin (1mg LOT:
17
F4/80 Biolegend 122602 Monoclonal,
rat anti mouse
Monozyten/
Makrophagen
1:200 Fibronectin abcam ab 23750 Polyclonal,
rabbit anti mouse
Bindegewebe 1:200
CD31 (PECAM-1) Dianova DIA-310 Monoclonal, rat anti-mouse
Ki-67 abcam Ab16667 Monoclonal,
rabbit anti-mouse
Proliferation 1:100
Kollagen IV Biozol 1340-01 Goat Anti- Type IV
sekundäre Antikörper Firma Produktnummer Verdünnung Alexa Fluor 555 goat anti-rat IgG Invitrogen A21434 1:500
Alexa Fluor 555 donkey anti rabbit (IgG H+L)
Alexa Fluor 555 donkey anti mouse IgG (H+L)
Life
technologie
A31570 1:500
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)
Kollagenase2 (Lot 42K13638) Cellsystems
Nylonmash 70µm
RBC Lyse Puffer (Red blood cell Lyse Puffer, 420301)
Biolegend, San Diego
18 Trypan blau
FCS 0,5%
PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate, D00108292) Merck, Deutschland
Ionomycin (407952-1MG) Merck, Deutschland
Brefeldin A (00-4506-51) ebioscience, Heidelberg
Saponin Puffer 0,5%
Compensation beads
Viability Dye eF506 Affymetrix eBioscience
FcR Block
Antikörper Firma Clone Verdünnung
FITC CD49b Affymetrix eBioscience DX5 1:100
PE Ly6-C Biolegend, San Diego HK1.4 1:600
CD11c PerCP-Cy5.5 Affymetrix eBioscience N418 1:400
PE-Cy7 Ly6-G Biolegend, San Diego 1A8 1:600
APC F4/80 Affymetrix eBioscience BM8 1:100
CD11b APCeF780 Affymetrix eBioscience M1/70 1:600
CD8a FITC Affymetrix eBioscience 53-6.7 1:600
CD19 PE 1:100
CD3e PerCP-Cy5.5 Affymetrix eBioscience 145-2C11 1:200
CD25 PE-Cy7 1:200
TCRβ APC Affymetrix eBioscience H57-597 1:600
CD4 eF780 1:600
CD45 eF450 Affymetrix eBioscience 30-F11 1:600
TCRγδ PE Affymetrix eBioscience GL3 1:200
IFNγ PE-Cy7 eBioscience, Heidelberg XMG1.2 1:200 IL17A eF450 Biolegend, San Diego TC11-18H10.1 1:20
19 Quantiative PCR
2.1.8
Material Hersteller
RNAlater solution (L/N 1412062) Ambion
RNASE Away (Lot. 13390468) Molecular Bio Products 2-Mercapto-Ethanol (Charge R106 A1108) AppliChem
QIA shredder (Lot. 151024331) Qiagen RNeasy Mini Kit: (Lot. 151022048)
DEPC-Wasser (RNase freies Wasser) Ambion Prime Script RT Reagent Kit (RR037B):
Prime Script RT Enzyme Mix 1 Oligo dt Primer
Random Hexamers
Clontech/ Takara
SYBR®Premix ExTaqTM II (RR820W) Clontech/ Takara 96well plate cover (600238) Biozym
Primer Firma Produktnummer
TNF α QIAGEN Mm_Tnf_1_SG QuantiTect Primer Assay QT00104006 IL-6 QIAGEN Mm_Il6_1_SG QuantiTect Primer Assa QT00098875 MCP-1 QIAGEN Mm_Ccl2_1_SG QuantiTect Primer
Assay
QT00167832 Kollagen
1A1
QIAGEN Mm_Col1a1_1_SG QuantiTect Primer Assay
QT00162204
Fibronectin QIAGEN Mm_Fn1_1_SG QuantiTect Primer Assay QT00135758
IL17A QIAGEN Mm_IL17A_SG QuantiTect Primer Assay QT00103278 PAI-1 BioTez forward: ATG TTT AGT GCA ACC CTG GC
reverse: CTG CTC TTG GTC CGA AAG AC CTGF BioTez forward: AGC TGA CCT GGA GGA AAA CA
reverse: GAC AGG CTT GGC GAT TTT AG
20 Geräte
2.1.9
Name Hersteller
Einbettautomat Leica (TP1020) Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland
Einbettstation (Leica EG1160) Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland
Rotationsmikrotom Firma Leica, RM 2245;
1,5 µm Schnittdicke
Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland
Leica LM DB Leica Microsystems GmbH, Wetzlar,
Deutschland
Mikroskop Keyence
Light Cycler 480 II Roche AG, Basel, Schweiz
PTC-200 Peltier Thermal Cycler MJ Research
Bio-Photometer Eppendorf
Gentle Macs Dissociator Miltenyi Biotec, San Diego
FACSCantoII BD biosiences
Therapeutischer IL-17 Antikörper 2.1.10
Der anti-IL-17A Antikörper (MM17F3) für die Hemmversuche wurde uns freundlicherweise von Prof. Immo Prinz, Institut für Immunologie, Medizinische Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
21
2.2 Methoden
Hypoxisches akutes Nierenversagens (AKI) durch Ischämie-2.2.1
Reperfusionsschaden
Die Operationen wurden in Vollnarkose mit Isofluran (3-5% Induktion, 1-2% Erhaltung) durchgeführt. Die Tiere erhielten vor OP Butorphanol (1mg/ kg s.c.) zur Analgesie. Es erfolgte eine mediane Laparotomie. Anschließend wurde der rechte Nierengefäßstiel mit einer nicht traumatischen Gefäßklemme für 45min abgeklemmt (Abb. 7)39. Nach Entfernung der Klemme kam es zur Reperfusion und die Durchblutung wurde visuell kontrolliert. Während des Abklemmens wurde die Niere aufgrund der Stase des Blutes dunkel. Nach Reperfusion blasste die Niere wieder ab. Das Abdomen wurde in zwei Schichten verschlossen und die Maus überwacht bis sie wieder vollständig aus der Narkose erwacht war.
Abbildung 7: Einseitiges Abklemmen des renalen Gefäßstiels für 45 Minuten
Organ-Asservierung und Fixation 2.2.2
Nach Erreichen der Endpunkte an Tag 1, 7 und 21 erfolgte die Euthanasie in tiefer Isoflurannarkose durch Perfusion einer eiskalten PBS Lösung über den linken Ventrikel, was in Narkose einen Herzstillstand auslöst. Beide Nieren wurden entnommen und fixiert.
Die kontralateral nicht geklippte Niere diente als gesunde Kontrolle. In Vorversuchen konnten wir zeigen, dass die kontralaterale Niere ähnliche Eigenschaften wie die Nieren bei sham-operierten Tieren aufweist. Im Rahmen des Tierschutzes stellt die Nutzung der Eigenniere ein deutliche Einsparung an Tierversuchen dar (RRR Prinzip).
Je nach geplanten Analysen wurde das Gewebe unterteilt und folgendermaßen fixiert.
Für Paraffin-Schnitte erfolgte die Fixation in 4% PFA (Paraformaldehyd)
Zur FACS-Analyse wurde das Gewebestück zerkleinert und in Gentle Macs Tubes mit 4 ml DMEM und 500 U/ml Kollagenase aufgenommen.
Für die mRNA Isolation wurde Gewebe in RNAlater bei -20°C gelagert
22
Für Kryoschnitte wurde das Gewebe in Isopentan auf Trockeneis bei -40°C eingefroren und anschließend bei -80°C gelagert.
Für die Proteinbiochemie wurde ein Gewebestück in Flüssigstickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert.
Außerdem erfolgte zu verschiedenen Zeitpunkten eine Blutentnahme mit einer Glaskapillare aus dem retrobulbären Venenplexus. Das Blut wurde bei 4°C 10 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert, das Serum abpipettiert und bis zur weiteren Analyse bei -80°C eingefroren.
Paraffin-Schnitte 2.2.3
Die Fixierung der Organe erfolgte direkt nach Entnahme in 4% PFA. Formalin reagiert mit basischen Aminosäuren und führt zur Bildung quervernetzender Hydroxymethylenbrücken. Es reagiert nur wenig mit zytoplasmatischen Proteinen, so dass die Struktur erhalten bleibt und ist dadurch für die meisten immunhistochemischen Färbungen gut geeignet40. Nach 24 h PFA Fixierung bei 4°C wurde das Gewebe dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die Entwässerung des Gewebes in einer aufsteigenden Alkoholreihe. 30 min in 30%iger Ethanol-Lösung und dann 30min in 50%iger Ethanol-Lösung. Die folgenden Schritte der Entwässerung erfolgten mit einem Einbettautomaten mittels aufsteigender Alkoholreihe.
3 h 70%ige Ethanol-Lösung
1 h 80%ige Ethanol-Lösung
2 x 1 h 90%ige Ethanol-Lösung
2 x 1 h 100%ige Ethanol-Lösung
1,5 h 100%ige Ethanol-Lösung
1 h Xylol Ersatz
2 x 1,5 h Xylol Ersatz
2 x 2 h Paraffin
Im Anschluss wurden die Präparate mit Hilfe einer Einbettstation mit Paraffin ausgegossen. Mit einem Mikrotom konnten Schnitte in einer Schnittdicke von ca. 2µm angefertigt werden und auf Objektträger aufgezogen werden. Die Objektträger wurden zur besseren Haltbarkeit vorher mit Poly-L-Lysin beschichtet. Anschließend wurden die Objektträger im 37°C Wärmeschrank getrocknet.
23 Histologie
2.2.4
PAS-Färbung (Perjod-Schiffsäure-Färbung)
Mit der PAS-Färbung werden insbesondere kohlenhydrathaltige Komponenten wie zum Beispiel Glykoproteine und Glykogen angefärbt. Dadurch ist die Nierenmorphologie gut erkennbar. Der Bürstensaum ist leuchtend rosa angefärbt, Zellkerne erscheinen blau und das Zytosplasma blassrosa. Vor der Färbung erfolgt zunächst die Entparaffinierung und Rehydrierung der Schnitte über eine aufsteigende Alkoholreihe.
Entparaffinierung:
10 min unter fließendem Leitungswasser spülen
10-20 sec mit Hematoxylin färben
10 min unter fließendem Leitungswasser bläuen
Entwässerung mit der aufsteigenden Alkoholreihe und Eindecken:
2 x kurz 96% Ethanol-Lösung
3 x 2 min 100%ige Ethanol Lösung
3 x 2 min Histoclear
Eindecken mit Histokitt Auswertung:
Zur Auswertung des Gewebeschadens wurde ein semiquantitativer AKI Score verwendet.
Zeichen des AKI sind Verlust des Bürstensaums, Weitstellung der Tubuli, Abflachung des
Zeichen des AKI sind Verlust des Bürstensaums, Weitstellung der Tubuli, Abflachung des