Verwendete Tiere

Die männlichen transgenen Spendertiere für die Kryokonservierung von Spermatozoen wurden im Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ) gezüchtet und im Alter von 10 bis 12 Wochen zur Kryokonservierung eingesetzt. Die transgenen Mäuse wurden von den verschiedenen Abteilungen generiert, gehalten, genutzt und zur Kryokonservierung vorgesehen, so dass die Tiere zum Zeitpunkt der Spermatozoengewinnung keinen einheitlichen Status hatten. Alle Tiere mussten geschlechtsreif sein, aber davon abgesehen variierte das Alter stark. Die Tiere waren teilweise für die Kryokonservierung gezüchtet worden, bei den anderen älteren Spendern handelte es sich um erfolgreiche Zuchttiere. Es wurde darauf geachtet, dass alle verwendeten Spendertiere den Habitus gesunder Tiere hatten.

Die Verantwortung für die Genotypisierung der Mäuse auf ihr Transgen lag bei den einzelnen Abteilungen.

In der vorliegenden Arbeit wurden Proben von 149 Spermatozoenspendern untersucht, welche im Zeitraum von 2004-2009 im DKFZ kryokonserviert wurden (Tab. 2, S.34). Bei den transgenen Mäusen handelte es sich um hohe Rückkreuzungsgenerationen des jeweiligen genetischen Hintergrundes. Hierdurch wird gewährleistet, dass im Vergleich mit Wildtyp-Tieren desselben genetischen Hintergrundes das Transgen der einzige Unterschied im gesamten Genom ist.

Weibliche Tiere für in vitro-Fertilisation (IVF) und Embryotransfer (ET):

Die zur Eizellspende für die IVF verwendeten weiblichen Mäuse wurden im Alter von 4 bis 6 Wochen von kommerziellen Züchtern erworben und nach einer Woche Eingewöhnung in der Tierhaltung superovuliert. Pro kryokonservierter Spermaprobe wurden die Eizellen von 5 Spendertieren für die IVF verwendet, so dass insgesamt 745 Mäuse superovuliert wurden. Es handelte sich um Wildtyp-Tiere des genetischen Hintergrundes der jeweiligen transgenen Mauslinie. Wenn es sich bei den transgenen Mäusen um Hybride handelte, wurde darauf geachtet, dass sie dem genetischen Hintergrund möglichst nahe kamen. Somit war der

genetische Hintergrund von Samen- und Eizellspender weitgehend identisch, so dass zwischen diesen beiden nicht differenziert wurde. Wird im Nachfolgenden vom genetischen Hintergrund gesprochen, bezieht sich dieser auf männliche und weibliche Spendertiere.

Die Ammen für den Embryotransfer waren entweder im Haus gezüchtete CD1 Mäuse oder zugekaufte NMRI Mäuse. Insgesamt wurden 112 weibliche Mäuse für einen Embryotransfer in der vorliegenden Arbeit verwendet. Sie wurden mit vasektomierten männlichen Tieren verpaart und nur sicher VP⁺ (Vaginalpfropf positive) Mäuse wurden für den ET genutzt. Die VP⁺ Mäuse wurden aus den Barrieren (siehe unten) ausgeschleust und vor der Injektion der Narkotika erneut geprüft, so dass nur sicher VP⁺ Mäuse als Ammen eingesetzt wurden. Für den Transfer von zweizelligen Embryonen aus der IVF wurden ausschließlich Ammen am Tag 0,5 p.c. (post coitum) verwendet.

3.1.1 Tierhaltung

Für die Haltung von Mäusen standen unterschiedliche Haltungssysteme im DKFZ zur Verfügung. Die Spermatozoenspender kamen von verschiedenen Arbeitsgruppen, so dass sie auch aus allen Haltungen des DKFZ stammten.

In Barrieren wurden die Mäuse unter SPF (spezifiziert pathogenfreien) Bedingungen gehalten, und es bestand eine strenge Zutrittsbeschränkung auf definierte Personenkreise (Personal und Wissenschaftler). Die Barrieren waren von der Umgebung isoliert. Material wurde über Autoklaven oder Desinfektionsschleusen in die Barrieren eingeschleust, und Personen konnten nur über Zwangsduschen in die Barriere gelangen. In den meisten Barrieren des DKFZ gab es ein offenes Haltungssystem mit Käfigen von Ehret (Typ II, Emmendingen, Deutschland). In zwei Barrieren gab es zusätzlich IVC-Haltungen (individually ventilated cages) von Techniplast (Greenline 1145T, Varese, Italien). In der IVC-Haltung waren die Käfige geschlossen und wurden einzeln belüftet. Da sowohl Zu- als auch Abluft gefiltert wurden, stellte jeder Käfig eine eigene Hygieneeinheit dar. Gearbeitet wurde in den IVC-Stationen in einer sterilen Werkbank (GESELLSCHAFT FÜR VERSUCHSTIERKUNDE;

SOCIETY FOR LABORATORY ANIMAL SCIENCE 2007).

Zugekaufte Tiere wurden in zwei von den Barrieren getrennten IVC-Haltungen untergebracht, welche mit zwei unterschiedlichen Systemen von Ehret (Typ II lang) oder Techniplast (Greenline 1145T) ausgestattet waren. In diesen Räumen wurden die weiblichen Tiere zur Eizellspende sowie die Ammen nach dem Embryotransfer gehalten.

Die weiblichen Tiere wurden in Gruppen von fünf Tieren und männliche Tiere ab der Geschlechtsreife einzeln gehalten. Ammen wurden nach dem Embryotransfer einzeln gehalten. Ihre Käfige waren mit Nistmaterial (autoklavierte Holzfasern) ausgestattet. Die Tiere wurden auf Espenholzschnitzeln (Einstreu LTE-E001, Abedd, Wien, Österreich) gehalten und einmal wöchentlich umgesetzt.

Alle Haltungen waren klimatisiert (22°C und 55% relative Luftfeuchtigkeit) und mit einem Tag-Nacht-Rhythmus, der das Frühjahr imitiert (6:00 Uhr bis 20:00 Uhr Licht;

Lichtintensität: im Tierraum 200 bis 600 lx, im Käfig ca. 40 lx) ausgestattet (GESELLSCHAFT FÜR VERSUCHSTIERKUNDE; SOCIETY FOR LABORATORY ANIMAL SCIENCE 2007).

Den Tieren stand pelletierte Standarddiät (Futter 3437, Kliba-Nafag, Kaiseraugst, Schweiz) und autoklaviertes Wasser ad libitum zur Verfügung. Die Ammen wurden nach dem Embryotransfer mit Zuchtfutter (Futter 3307, Kliba-Nafag, Kaiseraugst, Schweiz) gefüttert, außerdem bekamen sie ca. eine Woche vor dem errechneten Wurftermin autoklavierte Haferflocken als Beschäftigungsfutter.

Der Hygienestatus der einzelnen Haltungen wurde gemäß FELASA-Richtlinien regelmäßig auf alle derzeit relevanten Mauspathogene kontrolliert (NICKLAS et al. 2002). Da die verschiedenen Haltungsbereiche einen unterschiedlichen Hygienestatus hatten, gab es Regelungen, welche Wartezeiten zwischen dem Betreten der einzelnen Tierhaltungen zu beachten waren.

3.1.2. Kryokonservierte Spermatozoen

Die Grundlage für die Validierung der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungsmethode waren die zum Untersuchungszeitpunkt im Deutschen Krebsforschungszentrum bereits kryokonservierten Spermatozoen transgener Mauslinien (Tab. 2, S.34). Diese umfassten 38 transgene Linien auf 9 verschiedenen genetischen Hintergründen. Von diesen Linien wurden pro Tier 14 Spermaproben eingefroren und in flüssigem Stickstoff bei -196 °C gelagert. Die Anzahl der Tiere pro Linie, von welchen Sperma eingefroren wurde ist unterschiedlich und reicht von 2 bis 40 Tiere. Bei den meisten Linien wurden die Spermatozoen von 10 Tieren kryokonserviert. Untersucht wurden insgesamt 149 Spermaproben, wobei durchschnittlich 4 Proben pro Linie verwendet wurden.

Tab. 2: Übersicht über die kryokonservierten Spermatozoen (2004-2009) Einteilung der Gruppen zur erwarteten Fertilität:

1= gute Fertilität: guter genetischer Hintergrund oder „neue JAX-Methode“ (OSTERMEIER et al. 2008)

2= mittlere Fertilität: „alte JAX-Methode“ (SZTEIN et al. 2000)

3= schlechte Fertilität: schwieriger genetischer Hintergrund und „alte JAX-Methode“

4= schlechte Fertilität: negativer Einfluss des Transgens erwartet, „alte JAX-Methode“

* Die Kryokonservierung dieser transgenen Linien war zum Zeitpunkt der Untersuchung noch nicht abgeschlossen.

3.2. Material