Spermaqualität als Beurteilungsparameter für die Fertilität in der in vitro-

Es ist bekannt, dass die Spermaqualität einen entscheidenden Einfluss auf die Fertilität in der IVF hat. Die bisherige Beurteilung der Spermaqualität zur Qualitätskontrolle

Beurteilungsparameter Motilität zeigte keine ausreichende Übereinstimmung mit den erzielten Befruchtungsraten in der IVF (THE JACKSON LABORATORY, 2008). Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die drei Parameter Spermatozoenkonzentration, Motilität und Plasmamembranintegrität sich zur Beurteilung der Spermaqualität eignen.

Korrelation der Spermatozoenkonzentration mit der Fertilität in der IVF:

Da immer mit dem gleichen Volumen Spermatozoensuspension und der gleichen Fläche, welche durch das Deckglas vorgegeben wurde, gearbeitet wurde, konnte aus dem Parameter No./mm² (in TissueQuest^® angegeben, Tab. 7, S.69) die Spermatozoenkonzentration pro ml berechnet werden.

Da eine Spermatozoensuspension von sich aus inhomogen ist, waren Schwankungen der Spermatozoenkonzentration innerhalb einer Probe zu erwarten. Um dies weitestgehend zu vermeiden, wurde die jeweilige Probe durch vorsichtiges Pipettieren sorgfältig gemischt.

Trotz dieser Durchmischung waren die Ergebnisse der Spermatozoenkonzentration bei Wiederholungsmessungen innerhalb einer Probe mit einer Standardabweichung von 0,052×10⁶ bis 0,27×10⁶ Spermatozoen pro ml und einem Variationskoeffizienten von 10,51%

bis 39,49% (Abb. 18, Tab. 9, S.73) und auch zwischen verschiedenen Proben desselben Tieres mit einer Standardabweichung von 0,046×10⁶ bis 0,23×10⁶ Spermatozoen pro ml und einem Variationskoeffizienten von 10,67% bis 37,09% (Abb. 17, Tab. 8, S.72) nicht reproduzierbar.

In der Rangkorrelation nach Spearman war mit p = 0,587 nicht signifikant. Die Spermatozoenkonzentration korrelierte somit in unserem Analyseverfahren nicht mit der Fertilität in der IVF (Abb. 27a, S.82) und eignet sich demnach nicht zur Spermabeurteilung.

Korrelation der Motilität mit der Fertilität in der IVF:

Die Beurteilung der Motilität von Spermien wird bei der künstlichen Besamung von Rindern seit der Mitte des letzten Jahrhunderts erfolgreich eingesetzt (GLOVER 1968). Auch beim Pferd wird die Motilität beurteilt. Hier werden Filtrationstechniken eingesetzt, welche den Anteil motiler Spermien in der Besamungsportion und somit die Fertilität erhöhen (SIEME et al. 2003). Die alleinige Beurteilung der Ejakulatdichte und Spermienmotilität sind auch in der Tierzucht bei der Nutzung künstlicher Besamung nicht immer ausreichend, insbesondere bei subfertilen Tieren und sollten durch fortgeschrittene Verfahren der Fertilitätsdiagnostik ergänzt werden (PETRUNKINA et al. 2008). Für die Kryokonservierung von

ist. Auf Grund der Größe der Tiere müssen die Spermatozoen aus dem Nebenhoden gewonnen werden. Zudem handelt es sich um Inzuchttiere mit einer verringerten Fertilität, welche zusätzlich ein Transgen tragen und somit als subfertile Tiere einzuordnen sind.

Folgerichtig sind die in der Tierzucht im Rahmen der Kryokonservierung erfolgreich eingesetzten Methoden der Motilitätsbeurteilung von Spermien mit für die Qualitätskontrolle von Mausspermatozoen nicht ohne weiteres anwendbar.

Generell liegt die Motilität von kryokonservierten Mausspermien mit maximal 30% in einem sehr niedrigen Bereich. Die Reproduzierbarkeit war sowohl innerhalb verschiedener Proben eines Spendertieres mit einer Standardabweichung von 4,5 bis 13,2 und einem Variationskoeffizienten von 33,6% bis 58,8% (Abb. 19, Tab. 10, S.74) als auch innerhalb einer Probe mit einer Standardabweichung von 0,0 bis 6,8 und einem Variationskoeffizienten von 0,0% bis 50,0% (Abb.20, Tab. 11, S.75) nicht gegeben. Auch die Rangkorrelation nach Spearman zeigte mit p = 0,573 kein signifikantes Ergebnis. Die Motilität, der Anteil orts- und vorwärtsbeweglicher Spermatozoen, war mit der Fertilität in der IVF nicht korreliert (Abb.

27b, S.82), was die Beobachtungen anderer Arbeitsgruppen bestätigt (THE JACKSON LABORATORY, 2008). Die mit der hier verwendeten Methode ermittelte Spermienmotilität ist demnach als Parameter zur Qualitätsbeurteilung kryokonservierter Mausspermatozoen ungeeignet.

Korrelation der Plasmamembranintegrität mit der Fertilität in der IVF:

Der Prozentsatz plasmamembranintakter Spermatozoen zeigte als einziger Parameter der Spermaqualität eine Korrelation mit der Fertilität in der IVF (Abb. 27c, S.82). Die Rangkorrelation nach Spearman war mit p = 0,0001 hoch signifikant.

Es wurden sowohl innerhalb einer Probe mit einer Standardabweichung von 0,3 bis 4,8 und einem Variationskoeffizienten von 0,3% bis 11,4% (Abb. 22, Tab. 13, S.77) als auch in verschiedenen Proben desselben Tieres mit einer Standardabweichung von 1,0 bis 4,1 und einem Variationskoeffizienten von 1,2% bis 6,12% (Abb. 21, Tab. 12, S.76) unabhängig von den Schwankungen der Spermatozoenkonzentration gut reproduzierbare Ergebnisse erzielt.

Somit erlaubt die Plasmamembranintegrität eine prognostische Aussage über die Spermaqualität und die zu erwartende Fertilität in der in vitro-Fertilisation.

Die in vitro-Fertilisation (IVF) ist die am meisten genutzte Technik zur Untersuchung der Spermaqualität von Mäusen. Neben der Spermaqualität müssen auch andere Einflüsse auf die Ergebnisse der IVF wie die Kryokonservierungsmethode, der genetische Hintergrund, das Alter des Spendertieres oder das Transgen selbst berücksichtig werden, da diese ebenfalls die Fertilität in der IVF beeinflussen können. In der vorliegenden Arbeit haben die Faktoren

„genetischer Hintergrund“, „Alter des Spendertieres“ oder „Transgen“ die Fertilität in der IVF signifikant beeinflusst.

Einfluss des genetischen Hintergrundes auf die Fertilität in der IVF:

Die Literaturrecherche zeigte, dass der genetische Hintergrund einen entscheidenden Einfluss auf den Erfolg einer IVF hat (HOPPE 1980, SUZUKI et al. 1996, SZTEIN et al. 2000, WALTERS et al. 2005, OSTERMEIER et al. 2008). In der vorliegenden Arbeit konnte dieser Zusammenhang bestätigt werden. Es zeigte sich mit p < 0,0001 im Kruskal-Wallis-Test ein hoch signifikanter Einfluss des genetischen Hintergrundes auf die Fertilität in der IVF.

Spermatozoen von Mäusen der Linien FVB/N, NMRI und BDF erzielten die besten Befruchtungserfolge (Abb. 24, S.79), während BL/6 als die am häufigsten verwendete Linie zur Generierung transgener Mäuse eine mäßige Fertilität in vitro aufweist.

Im nachfolgenden werden mögliche Ursachen für diesen Zusammenhang diskutiert.

Da die Spermatozoen bei der Kryokonservierung einem erheblichem osmotischem Stress ausgesetzt sind, wird als eine mögliche Ursache des Einflusses des genetischen Hintergrundes auf die Fertilität in der IVF die Widerstandsfähigkeit gegenüber osmotischen Stress diskutiert.

WALTERS et al. (2005) fanden einen Zusammenhang zwischen dem genetischen Hintergrund und der Motilität von Spermien unter osmotischem Stress. Da WALTERS et al.

jedoch keine IVF zur Bestimmung der Fertilität der Spermatozoen durchführten und in der vorliegenden Arbeit die Motilität nicht mit der Fertilität in der IVF korrelierte, lässt sich aus diesen Ergebnissen kein Zusammenhang zwischen der Fähigkeit osmotischen Stress auszuhalten und der Fertilität in der IVF schlussfolgern.

Mehrere Arbeitsgruppen haben gezeigt, dass auch frisch präparierte Spermatozoen, welche keiner Kryokonservierung und somit keinem osmotischen Stress ausgesetzt waren, eine Abhängigkeit der Fertilität in der IVF vom genetischen Hintergrund zeigten (SUZUKI et al.

1996, SZTEIN et al. 2000, OSTERMEIER et al. 2008). Somit scheint die unterschiedliche Toleranz gegenüber osmotischem Stress nicht die Schwankungen zwischen den verschiedenen genetischen Hintergründen in der Fertilität erklären zu können.

Fertilität kommen die Morphologie sowie die Kapazitation in Frage. Schon 1980 zeigte HOPPE, dass sowohl die Morphologie der Spermatozoen als auch die Kapazitation abhängig vom genetischen Hintergrund des Spendertieres waren und somit einen Einfluss auf die Befruchtung in vivo und in vitro hatten (HOPPE 1980). KRZANOWSKA et al. (1995) fanden einen Zusammenhang zwischen der Morphologie des Spermienkopfes und dem Auftreten von Spermiendefekten mit der Fertilität der Spermatozoen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Morphologie der Spermatozoen nicht untersucht und es kann somit keine Aussage zu einem möglichen Zusammenhang von Morphologie und Fertilität getroffen werden. Die Literaturrecherche lässt jedoch die Annahme zu, dass die unterschiedliche Morphologie der Spermatozoen verschiedener genetischer Hintergründe, als ein möglicher Einflussfaktor auf die Fertilität in Betracht gezogen werden kann.

Eine weitere mögliche Ursache des Einflusses des genetischen Hintergrundes auf die Fertilität, könnte neben der Qualität der Spermatozoen auch die Qualität der Oozyten darstellen. KAWASE et al. (2001) zeigten durch Kreuzungen von Oozyten und Spermatozoen verschiedener genetischer Hintergründe bei Anwendung der intrazytoplasmatischen Spermainjektion (ICSI), dass für die geringere Befruchtung- und Entwicklungsrate nach der Implantation eher die Eizellen als die Spermatozoen verantwortlich seien. Diese Beobachtung konnte in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Bei einer Verwendung von BDF-Oozyten anstelle von BL/6-Oozyten wurde eine wesentlich bessere Fertilität mit Spermatozoen derselben transgenen Linie beobachtet. Mit BDF-Oozyten wurde eine Fertilität von über 30%

erreicht, während diese bei BL/6-Oozyten unter 10% lag. Bei einer schlechten Fertilität in der IVF könnte somit auch durch die Nutzung eines anderen als dem gewünschten genetischen Hintergrunds zur Eizellspende eine Verbesserung erreicht werden. Dies würde jedoch zu einer zeit-, arbeits- und tieraufwändigen Rückkreuzung der erhaltenen Tiere auf den gewünschten genetischen Hintergrund führen.

Zusammenfassend kann man sagen, dass noch nicht abschließend geklärt worden ist, auf welche Weise sich der genetische Hintergrund auf die Fertilität in der IVF auswirkt. Jedoch gibt es verschiedene Ansätze die Ursache dieses Zusammenhanges zu erklären. Hierzu zählen die Toleranz der Spermatozoen gegenüber osmotischem Stress, die Morphologie der Spermatozoen, die Kapazitation sowie die Qualität der Oozyten.

Einfluss der Kryokonservierungsmethode auf die Fertilität in der IVF:

In der vorliegenden Arbeit wurden nach zwei verschiedenen Kryokonservierungsmethoden, der „alten“ und der „neuen JAX-Methode“ eingefrorene Spermatozoen für die IVF

der „neuen JAX-Methode“ kryokonserviert worden waren, in der IVF eine bessere Fertilität aufwiesen. Dieser Unterschied ist für den Vergleich aller untersuchten Proben mit p = 0,001 hoch signifikant (Wilcoxon Zwei-Stichproben Test; siehe Abb.23 a, S.78).

Beim dem Vergleich aller untersuchter Proben könnte der genetischen Hintergrundes möglicherweise einen Einfluss auf die Ergebnisse gehabt haben, da die Tiere aus verschiedenen genetischen Hintergründen stammen. Deshalb wurde derselbe Vergleich nur für die Mauslinie BL/6, von der genügend Proben beider Methoden vorlagen, durchgeführt.

Es zeigte sich mit p=0,0002 ebenfalls ein hoch signifikanter Einfluss der Kryokonservierungsmethode auf die Fertilität in der IVF (siehe Abb. 23 b, S.78).

Zusammenfassend kann man daher feststellen, dass unabhängig vom genetischen Hintergrund die nach der „neuen JAX-Methode“ kryokonservierten Spermatozoen im Vergleich mit nach der „alten JAX-Methode“ kryokonservierten Spermatozoen in dieser Arbeit eine hoch signifikant bessere Fertilität in der IVF zeigten.

Im Folgenden werden die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse in der IVF mit den von SZTEIN et al. (200) und OSTERMEIER et al. (2008) publizierten Ergebnissen verglichen.

Die Fertilität in der IVF mit nach der „alten JAX-Methode“ kryokonservierten Spermatozoen transgener Mauslinien (Abb. 24, S.79) entspricht weitgehend den von SZTEIN et al. (2000) beschriebenen Ergebnissen. Nur BDF-Hybride zeigten eine geringere Fertilität. Allerdings war bei den für diese Arbeit verwendeten Hybriden die Rückkreuzungsgeneration unbekannt.

Mit nach der „neuen JAX-Methode“ kryokonservierten Spermatozoen konnte OSTERMEIER et al. (2008) die Fertilität bei fast allen genetischen Hintergründen auf das Niveau bei Verwendung nicht kryokonservierter Spermatozoen (durchschnittlich 50% zweizellige Embryonen) verbessern. Für den genetischen Hintergrund BL/6J wurde eine Befruchtungsrate von 40% zweizelligen Embryonen erreicht. Mit einem Mittelwert von 15,4 % zweizelligen Embryonen (Abb. 23b, S.78) bei dem genetischen Hintergrund BL/6N und einem durchschnittlichen Mittelwert von 20,5% (Abb. 23a, S.78) bei allen genetischen Hintergründen wurde zwar eine Verbesserung der Fertilität, jedoch nicht das von OSTERMEIER et al. (2008) erzielte Niveau erreicht. Im Jackson Laboratory wird ein anderes IVF-Medium, das Cook-Medium, genutzt (THE JACKSON LABORATORY, 2008), welches in der IVF unter hypoxischen Bedingungen inkubiert wird. Das Cook-Medium ist in Europa nicht verfügbar. Da das Medium einen großen Einfluss auf die Fertilität in der IVF hat (DANDEKAR u. GLASS 1987, HO et al. 1995, SCOTT u. WHITTINGHAM 1996,

liegen. Zudem werden im Jackson Laboratory 21 Tage alte Mäuse aus der eigenen Zucht für die Superovulation genutzt, so dass zum einen eine größtmögliche Eizellausbeute erreicht wird und zum anderen der genetische Hintergrund exakt übereinstimmt. Die in dieser Arbeit verwendeten Mäuse waren wegen des Zukaufs von Charles River (Charles River Deutschland, Sulzfeld) 4 bis 6 Wochen alt, so dass die Superovulation zu einem ungünstigeren Zeitpunkt stattfand (NAGY et al. 2003). Zudem wurde zwar auf einen übereinstimmenden genetischen Hintergrund geachtet, eine Genauigkeit wie bei Tieren, die aus der gleichen Zucht stammen, war jedoch nicht zu gewährleisten.

Es wird kontrovers diskutiert, ob der Erfolg der IVF unter hypoxischen Bedingungen verbessert werden kann. Für das Cook-Medium werden hypoxische Bedingungen während der Durchführung der IVF empfohlen, da in vivo bei der Befruchtung auch hypoxische Bedingungen vorliegen. Dadurch sollen bei Verwendung des Cook-Mediums annähernd physiologische Gegebenheiten geschaffen werden. Probemessungen zur Verwendung eines Gasgemisches mit reduziertem Sauerstoffgehalt (90% N2, 5% CO2, 5% O2) haben gezeigt, dass der genutzte spezielle Hypoxie-Brutschrank 45 Minuten benötigt, um den vorgegebenen O2-Gehalt zu erreichen. Durch das mehrfach erforderliche Öffnen des Brutschrankes im Verlauf einer IVF zum Waschen und Umsetzen der Zygoten sind stabile hypoxische Bedingungen somit nicht realisierbar.

Ein weiterer wichtiger Aspekt für die Kryokonservierung von Spermatozoen ist die Einfriergeschwindigkeit. WOODS et al. (2004) kritisieren, dass im Labor häufig einfache Protokolle verwendet werden, welche das Einhalten einer optimalen Einfriergeschwindigkeit und der verwendeten Medien vernachlässigen. Zudem kann die Einfriergeschwindigkeit bei der verwendeten Kühlung im Stickstoffdampf nicht präzise kontrolliert und reguliert werden.

Jedoch wurden bei Probemessungen konstante Einfrierraten mit einem annähernd linearen Verlauf des Temperaturabfalls festgestellt.

Einfluss des Transgens auf die Fertilität in der IVF:

Für die Generierung und die Kryokonservierung von Spermatozoen transgener Mäuse ist es wichtig zu wissen, ob das Transgen selbst einen Effekt auf den Erfolg der IVF haben kann.

Dass ein Einfluss des Transgens auf den Erfolg in der IVF möglich ist, wurde bei dem Vergleich der Gruppen (Gruppeneinteilung der erwarteten Fertilität siehe S.59 und Tab.2, S.34) mit und ohne erwarteten negativen Einfluss des Transgens deutlich, welche nach derselben Methode kryokonserviert wurden (Abb. 25a, S.80). Es zeigte sich mit einem p = 0,043 im Wilcoxon Zwei-Stichprobentest ein signifikanter, negativer Einfluss des Transgens

einzigen genetischen Hintergrundes (BL/6), so bestätigt sich dieser signifikant negative Einfluss des Transgens auf die Fertilität in der IVF mit einem p = 0,031 im Wilcoxon Zwei-Stichprobentest (Abb. 25b, S.80). Somit konnte unabhängig vom genetischen Hintergrund ein signifikanter Einfluss des Transgens auf die Fertilität in der IVF gezeigt werden.

Es ist deshalb bei einer Linie, die bei homozygoter Mutation letal ist, ein schlechtes Zuchtverhalten zeigt oder das Neomycin-Resistenzgen trägt (häufig bei homologen Rekombinanten), mit einer verminderten Fertilität in der IVF zu rechnen.

Daher ist bei allen transgenen Linien eine IVF zur Kontrolle der Befruchtungsfähigkeit in vitro erforderlich, um deren Eignung für die Spermakryokonservierung nachzuweisen.

Alter des Spendertieres:

Das Alter des Samenspenders hat mit p = 0,031 in der Rangkorrelation nach Spearman ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf den Erfolg in der IVF. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Sperma von Mäusen im Alter von ungefähr 100 bis 200 Tagen am besten für die Kryokonservierung geeignet ist (Abb. 26, S.81).

Haltungsbedingte Einflüsse auf die Ergebnisse der IVF:

Für den Befruchtungserfolg der IVF ist nicht nur die Spermaqualität ausschlaggebend, sondern auch die Eizellqualität (NAGY et al. 2003). Diese ist von vielen Faktoren wie z.B.

dem Alter der Spendertiere, dem genetischen Hintergrund, der Superovulation und den Haltungsbedingungen (z.B. Raumklima und Stress im Tierraum) abhängig. Da diesbezüglich wenige Daten zur Verfügung stehen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Anzahl der gewonnenen Embryonen pro VP⁺-Spendertier beurteilt. Für beide Zwecke, die Eizellen- und Embryonengewinnung, wurden dieselben Wildtyp-Mäuse im selben Tierraum nach dem selben Schema superovuliert. Die Embryonenspender wurden mit männlichen Tieren verpaart und auf Vaginalpfropf geprüft, so dass anhand der Embryonenausbeute mögliche äußere Einflüsse, wie z.B. das Raumklima oder die Lärmbelastung, auf die Reproduktivität untersucht werden konnten. SCHWAB und SCHENKEL (2008b) haben gezeigt, dass trotz einer standardisierten Versuchstierhaltung unter „Frühlingsbedingungen“ (14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit) mit konstanter Temperatur ein jahreszeitlicher Rhythmus der Embryonenausbeute über fünf Jahre auftrat. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Luftfeuchtigkeit in Abhängigkeit von der Außentemperatur großen Schwankungen unterliegt und somit die Embryonenproduktion erheblich beeinflusste (DIERCKS et al. 2010).

beeinflusst wurde (DIERCKS et al. 2010). Dies stimmt mit der Beobachtung anderer Arbeitsgruppen überein, welche einen negativen Einfluss von Stress auf das Reproduktionsverhalten von Mäusen feststellten (BREAZILE 1987, MOBERG 1991). Beide Faktoren, der jahreszeitliche Rhythmus und der Baulärm, hatten auch bei der vorliegenden Studie die Fertilität in der IVF beeinträchtigt. Allerdings standen für eine statistische Auswertung nicht genug Daten zur Verfügung.

5.1.4.1. Alternative Techniken zur in vitro-Fertilisation

Als Standardmethode zur Revitalisierung von kryokonservierten Spermatozoen steht die in vitro-Fertilisation zur Verfügung, wie sie in der vorliegenden Arbeit durchgeführt wurde.

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass mit diesem IVF Verfahren transgene Linien bei Verwendung von kryokonserviertem Sperma gegebenenfalls nicht sicher revitalisiert werden können. So wurde für Spermien von Mäusen aus Linien mit dem genetischen Hintergrund BL/6 insbesondere nach Kryokonservierung nach der „alten JAX-Methode“ in der IVF lediglich eine Befruchtungsrate von < 10% erzielt, was als nicht ausreichend zu bewerten ist (Tab. 15, S.85). Für diese Linien ist als Alternative zu dem hier angewandten IVF Verfahren eine „assisted Hatching“ zu erwägen, bei welcher die Zona pellucida der Eizellen durch unterschiedliche Methoden gezielt verdünnt oder minimal eröffnet wird. Die Öffnung der Zona pellucida kann manuell (NAKAGATA et al. 1997), durch Penetration mit Hilfe eines Piezo-Manipulators (KAWASE et al. 2002), durch Verdünnung mit säurehaltige Medien (LANZENDORF et al. 2007) oder durch Perforation über Laserimpulse (LAUFER et al. 1993) erfolgen.

Als weitere Alternative zur IVF kommt die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) in Frage, bei welcher ein Spermienkopf direkt in den Zellkern der Oozyte injiziert wird (KIMURA u. YANAGIMACHI 1995). Demnach wird pro Eizelle nur ein Spermienkopf benötigt, während bei der IVF tausende Spermatozoen zur Verfügung stehen müssen (SZCZYGIEL et al. 2002). Auch für die ICSI wird ein vom genetischen Hintergrund der verwendeten Mauslinien abhängiger Befruchtungserfolg (KAWASE et al. 2001) beschrieben.

Trotz dieser Auswirkungen des genetischen Hintergrundes auf den Befruchtungserfolg sei eine Revitalisierung auch von in der IVF schwierigen Linien mithilfe der ICSI möglich (SZCZYGIEL et al. 2002).

Der Transfer von Spermatozoen in das Infundibulum einer superovulierten und scheinträchtigen Amme stellt ein weiteres Ersatzverfahren zur IVF dar (NAGY et al. 2003).

Der Vorteil besteht darin, dass die Befruchtung und Entwicklung der Embryonen in der physiologischen Umgebung ablaufen können.

Alle genannten alternativen Techniken zur IVF sind sehr aufwändig und aufgrund dessen für die Laborroutine weniger geeignet. Zudem ist über möglicherweise weitere daraus resultierende epigenetische Effekte wenig bekannt.

5.1.5. Embryotransfer

Der Embryotransfer ist der letzte, aber entscheidende Schritt, um eine transgene Mauslinie durch kryokonserviertes Sperma zu revitalisieren. Es handelt sich um eine sensible Technik, welche von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden kann. Dazu gehören:

• Vitalität und Anzahl der transferierten Embryonen

• Konstitution der scheinträchtigen Ammen, z.B. sicherer VP, gute Mutter (Auszuchtlinie), frei von Infektionen (NAGY et al. 2003)

• Stress der Ammen während der Trächtigkeit und nach dem Wurf Ergebnisse des Embryotransfers mit IVF-Embryonen:

Die Transfers von Embryonen aus einer IVF zeigen, dass eine Revitalisierung transgener Linien mit kryokonservierten Spermatozoen möglich ist. Zur Bewertung und Diskussion der Trächtigkeits- und Wurfrate nach einem Transfer von IVF-Embryonen werden diese mit den entsprechenden Daten anderer Herkunft und Einrichtungen verglichen. Zu diesem Vergleich lagen Daten von kryokonservierten Embryonen, mikroinjizierten Embryonen sowie zu Sanierungszwecken verwendeten frischen Embryonen vor (Tab. 16).

1 laut persönlicher Mitteilung von Dr. Geert Michel, Charité Berlin

Tab. 16: Vergleich von Embryotransferresultaten bei Verwendung unterschiedlicher Embryonen anhand der Trächtigkeits- und Wurfrate (%)

DKFZ = Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg KfK = Kernforschungszentrum Karlsruhe

Berlin = Charité Berlin

IVF-Embryonen: zweizellige Embryonen nach IVF mit kryokonservierten Spermatozoen, tlw. auch Wildtyp-Tiere

Revitalisierte Embryonen: kryokonservierte, achtzellige Embryonen

Mikroinjektion: einzellige Zygoten nach Mikroinjektion (Generierung von transgenen Mäusen)

Sanierung: zweizellige, frische Embryonen

DKFZ weniger Würfe bei den IVF-Embryonen. Somit sind die IVF-Embryonen weniger vital als die revitalisierten Embryonen. Die im Vergleich hohen Anteile an Fruchtresorptionen im DKFZ 2009 (IVF-Embryonen und revitalisierte Embryonen DKFZ) zu allen anderen verglichenen Transfers (Mikroinjektion DKFZ und KfK und Sanierung Berlin¹) dürfte im Wesentlichen im Baulärm bzw. in den hierdurch entstehenden Vibrationen begründet sein (siehe Kapitel 5.1.4.

S.97). Es fällt auf, dass in der Sanierungsgruppe (Berlin) die Wurfrate mit frisch gewonnenen zweizelligen Embryonen höher ist als bei allen anderen Gruppen. Die höhere Vitalität dieser Embryonen im Gegensatz zu denen aus allen anderen Gruppen lässt sich dadurch erklären, dass diese frisch gewonnen Embryonen weniger Manipulationen ausgesetzt worden waren.

Das ehemalige Kernforschungszentrum Karlsruhe (KfK) hatte eine sehr kleine und ruhige Tierhaltung im Vergleich zum DKFZ, sodass die relativ hohen Trächtigkeits- und Wurfraten ohne Fruchtverluste auf die günstigen Haltungsbedingungen zurückzuführen sind.

5.1.6. Grenzwerte der Plasmamembranintegrität für die Sicherung transgener Linien mit kryokonservierten Spermatozoen

Zur Berücksichtigung der Einflüsse des genetischen Hintergrunds von Samen- und Eizellspendern und der Kryokonservierungsmethode wurden die untersuchten Proben in Gruppen zusammengefasst und mit Vierfeldertafeln ausgewertet (siehe Tab. 15, S.85).

Um mit Hilfe der Vierfeldertafel Grenzwerte für den Prozentsatz plasmamembranintakter Spermatozoen zu finden, wurden Mindestanforderungen für die IVF sowie die Auswertung

Um mit Hilfe der Vierfeldertafel Grenzwerte für den Prozentsatz plasmamembranintakter Spermatozoen zu finden, wurden Mindestanforderungen für die IVF sowie die Auswertung

Im Dokument Versuchstiersparende Qualitätskontrolle kryokonservierter Spermatozoen von Mausmutanten (Seite 99-0)