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Versuchstiersparende Qualitätskontrolle kryokonservierter Spermatozoen von Mausmutanten

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Academic year: 2022

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Versuchstiersparende Qualitätskontrolle

kryokonservierter Spermatozoen von Mausmutanten

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Ann-Kathrin Diercks

Hamburg

Hannover 2011

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Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Hansjoachim Hackbarth Institut für Tierschutz und Verhalten Tierärztliche Hochschule Hannover Bünteweg 2

30559 Hannover

2. PD Dr. Johannes Schenkel Kryokonservierung

Deutsches Krebsforschungszentrum Im Neuenheimer Feld 280

69120 Heidelberg

Institut für Physiologie und Pathophysiologie

Universität Heidelberg Im Neuenheimer Feld 326 69120 Heidelberg

1. Gutachter: Prof. Dr. Hansjoachim Hackbarth

2. Gutachterin: Prof. Dr. Anne-Rose Günzel-Apel

Tag der mündlichen Prüfung: 27.10.2011

Das dieser Dissertation zugrundeliegende Vorhaben wurde mit Mitteln des Bundesministeriums für Bildung und Forschung unter Förderkennzeichen 0315152 gefördert. Die Verantwortung für den Inhalt dieser Veröffentlichung liegt beim Autor.

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Für

Nicole und Stephanie Diercks

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Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung und Problemstellung ... 1

2. Literatur ... 4

2.1. Transgene Tiere... 4

2.1.1. Nutzen und Besonderheiten transgener Tiere ... 4

2.2. Kryokonservierung... 6

2.2.1. Entwicklung der Kryokonservierung ... 6

2.2.2. Biochemische Prozesse bei der Kryokonservierung ... 8

2.2.3. Kryoprotektiva ... 11

2.2.4. Kryokonservierung von Spermatozoen... 12

2.2.5. Lagerung kryokonservierter Proben... 15

2.3. Revitalisierung (transgener) Linien mit Hilfe kryokonservierter Spermatozoen... 16

2.3.1 Qualitätssicherung kryokonservierter Spermatozoen... 18

2.4. Sexualzyklus der Maus... 19

2.4.1. Scheinträchtigkeit bei der Maus ... 19

2.4.2. Superovulation und Synchronisation des Östrus... 20

2.4.3. Stress in der Versuchstierhaltung... 21

2.5. Alternative Qualitätskontrolle kryokonservierter Spermatozoen... 23

2.6. Physikalische Grundlagen der Fluoreszenzmikroskopie... 24

2.6.1. Lumineszenz und Fluoreszenz ... 24

2.6.2. Fluoreszenzmikroskopie... 26

2.6.3. Fluoreszenzfarbstoffe ... 27

2.7. Computergestützte Analyse von Fluoreszenzaufnahmen ... 29

3. Tiere, Material und Methoden ... 31

3.1. Verwendete Tiere ... 31

3.1.1 Tierhaltung ... 32

3.1.2. Kryokonservierte Spermatozoen ... 33

3.2. Material ... 35

3.2.1. Medien... 35

3.2.2. Tropfenkulturen für die in vitro-Fertilisation... 37

3.2.3. Fluoreszenzfarbstoffe ... 38

(6)

3.2.4. Brutschrank ... 39

3.3. Methoden... 40

3.3.1. Kryokonservierung von Spermatozoen... 40

3.3.2. Revitalisierung transgener Mauslinien aus kryokonservierten Spermatozoen ... 42

3.3.2.1. In vitro-Fertilisation (IVF) ... 43

3.3.2.2. Embryotransfer... 46

3.3.3. Beurteilung der Spermatozoen mittels Fluoreszenzmikroskopie... 49

3.3.3.1. TissueFAXS® und TissueQuest®... 49

3.3.3.2. Etablierung der Färbemethode ... 50

3.3.3.3. Vorbereitung und Aufnahme der Fluoreszenzbilder ... 52

3.3.3.4. Analyse der Fluoreszenzaufnahmen... 53

3.3.3.5. Datenanalyse ... 56

3.3.3.6. Bestimmung und Berechnung der Spermatozoenkonzentration ... 56

3.3.3.7. Videosequenz zur Bestimmung der Motilität... 57

3.3.3.8. Untersuchung verschiedener Einflüsse auf die Fertilität in der IVF ... 58

3.3.4. Statistische Methoden ... 60

4. Ergebnisse ... 63

4.1. Fluoreszenzaufnahmen und ihre Auswertung ... 63

4.1.1. Differenzierung plasmamembranintakter Spermatozoen... 66

4.1.2. Bestimmung der Motilität ... 70

4.2. Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzaufnahmen... 71

4.3. Einfluss der Kryokonservierungsmethode auf die Fertilität in der IVF... 78

4.4. Einfluss des genetischen Hintergrundes auf die Fertilität in der IVF ... 78

4.5. Einfluss des Transgens auf die Fertilität in der IVF... 79

4.6. Einfluss des Alters des Spendertieres auf die Fertilität in der IVF ... 81

4.7. Einfluss der Spermaqualität auf die Befruchtung in der IVF... 81

4.8. Embryotransfer... 83

4.9. Qualitätskontrolle kryokonservierter Spermatozoen anhand der Plasmamembranintegrität... 85

5. Diskussion ... 87

5.1. Versuchstiersparende Qualitätskontrolle... 87

(7)

5.1.1. Etablierung der Färbetechnik ... 87

5.1.2. Die Aufnahmetechnik ... 88

5.1.2.1. Auswertung der Fluoreszenzaufnahmen zur Bestimmung der Plasmamembranintegrität... 89

5.1.3. Spermaqualität als Beurteilungsparameter für die Fertilität in der in vitro- Fertilisation... 89

5.1.4. Ergebnisse der In vitro-Fertilisation... 92

5.1.4.1. Alternative Techniken zur in vitro-Fertilisation... 97

5.1.5. Embryotransfer... 98

5.1.6. Grenzwerte der Plasmamembranintegrität für die Sicherung transgener Linien mit kryokonservierten Spermatozoen... 100

5.2. Schlussfolgerungen ... 101

6. Zusammenfassung... 103

7. Summary ... 105

8. Literaturverzeichnis... 107

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Verzeichnis verwendeter Abkürzungen °C Grad Celsius

Abb. Abbildung

BL/6 Mausstamm C57BL/6N

BSE bovine spongiforme Enzephalopathie bzw. beziehungsweise

c Lichtgeschwindigkeit

ca. circa

cm Zentimeter

C.l. Corpus luteum CPA cryoprotective agent CO2 Kohlendioxid CRH Corticoliberin

DAPI Fluoreszenzfarbstoff; im TissueFAX®: Fluoreszenzkanal (335-383 nm Exzitationswellenlänge)

d.h. das heißt

DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfid

DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg DNA Desoxyribonukleinsäure

ds doppelsträngig

E Energie

ET Embryotransfer

eCG equines Choriongonadotropin EtBr Ethidiumbromid

FDA Fluoresceindiacetat

FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations FOV field of view

FSH Follikel stimulierendes Hormon

g Gramm

GFP Fluoreszenzfarbstoff; im TissueFAX®: Fluoreszenzkanal (450-490 nm Exzitationswellenlänge)

gld generalized lymphoprolerative disease GnRH Gondoliberin

GV-SOLAS Gesellschaft für Versuchstierkunde – society of laboratory animal science

h Planckkonstante

hCG humanes Choriongonadotropin HTF human tubal fluid

i.p. intra peritoneal

ICSI intrazytoplasmatische Spermieninjektion IGF 1 insulin like growth factor 1

IVF in vitro-Fertilisation JAX Jackson Laboratory

KfK Kernforschungszentrum Karlsruhe

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KSOM Medium zur in vitro-Kultivierung von embryonalen Präimplantationsembryonen

l Liter

LH Lutropin

LL lower left

log logarithmisch

LR lower right

lx Lux

M Molar

M2 Medium zur Kryokonservierung von Präimplantationsembryonen

mg Milligramm

ml Milliliter

mm Millimeter

ms Millisekunde

n Anzahl

N2 Stickstoff

nm Nanometer

No/mm2 Ereignisse pro Quadratmillimeter PPV positiv prädiktiver Wert

MTG Monothioglycerol

O2 Sauerstoff

p Wahrscheinlichkeit

PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung p.c. post coitum

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PI Propidiumiodid

PMSG pregnant mare serum gonadotropin SPF spezifiziert pathogenfrei

Tab. Tabelle

TEXA Fluoreszenzfarbstoff; im TissueFAX®: Fluoreszenzkanal (540-580 nm Exzitationswellenlänge)

tg transgen

TGFα transforming growth factor α RNA Ribonukleinsäure

UL upper left

U.I. internationale Einheiten

UR upper right

UV ultraviolett

VP+ Vaginalpfropf positiv z.B. zum Beispiel

ν Frequenz

λ Wellenlänge

µm Mikrometer

2er zweizellige Embryonen

3R drei R: replacement, reduction, refinement

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(11)

1. Einleitung und Problemstellung

Transgene Tiere sind einmalige Mutanten mit deren Hilfe Gene und ihre Funktion, ihre Regulation aber auch (humane) Erkrankungen untersucht werden können. Die Generierung und Charakterisierung von transgenen Tieren ist sehr aufwändig, so dass einmal generierte Tiere möglichst erhalten werden sollten. Häufig können sie auch zur Beantwortung weiterer Fragestellungen als der ursprünglich geplanten herangezogen werden. Nur in Ausnahmefällen ist dies mit Hilfe einer Erhaltungszucht sinnvoll, da diese neben dem Aufwand besonders anfällig für genetische Drift und Hygieneeinbrüche ist. Außerdem benötigt eine Zucht viele Versuchstiere und beansprucht entsprechend viel Platz in der Tierhaltung. Eine bewährte Methode zur Sicherung transgener Linien ist die Kryokonservierung von Embryonen und/oder Spermatozoen. Diese ermöglicht eine nahezu unbegrenzte Lagerung der eingefrorenen Proben in flüssigem Stickstoff bei -196°C. Hierdurch ist auch ein unproblematischer Austausch von Tieren zwischen Laboratorien mit unterschiedlichem Hygienestatus möglich und im Falle eines Hygieneeinbruches ermöglicht die Kryokonservierung einen Wiederaufbau der betroffenen transgenen Linien. Die Einstellung einer Erhaltungszucht ist jedoch nur nach erfolgreicher Qualitätskontrolle der kryokonservierten Proben sinnvoll. Die Qualitätskontrolle ist somit ein sehr wichtiger Schritt bei der Kryokonservierung von Embryonen und Spermatozoen. Welche Methode sich zur Sicherung einer Linie eignet, muss im Einzelfall entschieden werden, da sowohl die Kryokonservierung von Spermatozoen als auch die von Embryonen Vor- und Nachteile hat.

Die Kryokonservierung von Spermatozoen hat den Vorteil eines einfacheren Einfrierprotokolls im Vergleich zu Embryonen. Es werden nur wenige Spendertiere benötigt, die nicht zeitintensiv vorbehandelt werden müssen. Nachteilig ist die aufwändige Revitalisierung mit in vitro-Fertilisation (IVF) und nachfolgendem Embryotransfer (ET).

Außerdem ist bei der Kryokonservierung von Spermatozoen nur eine Konservierung der Mutation, d.h. des mutierten Gens, und nicht des Mutanten, also eines definierten Tieres mit Mutation, möglich. Für die IVF müssen weibliche Wildtyp-Mäuse als Eizellspender genutzt werden, so dass der Genotyp der geborenen Jungtiere nicht identisch mit dem des Spermatozoen-Spendertieres ist.

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Die Kryokonservierung von Spermatozoen transgener Mäuse und ihre Qualitätskontrolle sind mit verschiedenen Problemen behaftet. Auf Grund der geringen Größe von Mäusen ist eine Spermagewinnung am lebenden Tier unmöglich, so dass ein wiederholtes Nutzen besonders guter Tiere nicht möglich ist. Durch die meistens kleine Populationsgröße stehen oft nur wenige Tiere als Spendertiere zur Verfügung. In der Regel ist der genetische Hintergrund von transgenen Mäusen ein Inzuchtstamm, so dass schon hierdurch ein negativer Effekt auf die Fertilität zu erwarten ist. Zusätzlich kann dieser auch durch das Transgen selbst verstärkt werden. Es ist demnach nicht möglich, Mindestanforderungen für die Spermaqualität zu formulieren und anschließend nach diesen zu selektieren. Vielmehr ist es notwendig, die Kryokonservierungstechnik zu optimieren und Parameter für die Qualitätskontrolle zu finden, welche eine Vorhersage über die erfolgreiche Revitalisierung der transgenen Linie mit den eingelagerten Proben ermöglichen. Das ist nötig, um im Zweifelsfall entscheiden zu können, ob weitere Proben zur Sicherung benötigt werden oder nicht. Da die Spermaqualität ein absolut individueller Parameter ist, muss die Qualitätskontrolle alle Spendertiere berücksichtigen.

Derzeit ist die einzige verlässliche Qualitätskontrolle kryokonservierter Spermatozoen die Durchführung einer IVF mit nachfolgendem Embryotransfer. Diese Techniken sind nicht nur zeit- und kostenintensiv, sondern benötigen auch viele Versuchstiere. Beide sind zudem komplexe und sensible Techniken, deren Erfolg nicht ausschließlich von der Spermaqualität bestimmt wird, sondern auch anderen Einflüssen, wie z.B. dem Medium und der Eizellqualität, unterliegt. Dennoch sind IVF und ET die Voraussetzung, um eine über Spermatozoen kryokonservierte transgene Linie zu revitalisieren. Eine zuverlässige Alternative zu diesen Techniken zur Qualitätskontrolle kryokonservierter Spermatozoen von Mausmutanten ohne den Einsatz von Versuchstieren ist bisher nicht verfügbar. In der Humanmedizin genutzte „Sperm-Analyzer“-Geräte eignen sich für diese Fragestellung wenig, da sie nur Motilität und Morphologie der Spermatozoen erfassen, aber nicht das Verhältnis von lebenden zu toten Spermatozoen berücksichtigen. Mit ihnen ist eine Beurteilung der Eignung von Proben für weiterführende Techniken, wie z.B. laserassistierte IVF oder intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI), nicht möglich. Ziel dieser Dissertation war es, eine möglichst versuchstierfreie Technik zur Untersuchung kryokonservierter Spermatozoen von Mausmutanten zu etablieren und zu validieren.

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Folgende Faktoren sollen hierfür erfasst, bearbeitet und diskutiert werden:

• Die Rolle der Parameter Spermatozoenkonzentration, Motilität und Plasmamembranintegrität zur Beurteilung der Spermaqualität

• Der Einfluss des genetischen Hintergrundes auf die Fertilität in der IVF

• Der Einfluss des Transgens auf die Fertilität in der IVF

• Der Einfluss der Kryokonservierungsmethode auf die Fertilität in der IVF

• Die erfolgreiche Revitalisierung transgener Linien durch IVF und ET

Mit Hilfe der relativ einfach durchführbaren fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung sollen die Arbeitsabläufe im Labor optimiert sowie der Arbeits- und Zeitaufwand für die Qualitätssicherung reduziert werden. Durch den weitgehenden Verzicht auf IVF zur Qualitätskontrolle kryokonservierter Spermatozoen soll in Zukunft die Zahl der benötigten Versuchstiere stark reduziert werden. Hiermit wird den Forderungen „reduction“ und

„replacement“ der „3R“-Systematik nach Russell und Burch (1959) nachgekommen.

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2. Literatur

2.1. Transgene Tiere

Transgene Tiere sind Tiere, die eine gezielte Mutation tragen und diese stabil an ihre Nachkommen vererben. Sie sind besonders wertvoll, weil Gene und Stoffwechselwege, deren Funktion und Regulation, sowie ganze Krankheitsmodelle mit ihrer Hilfe untersucht und verstanden werden können. Die transgenen Techniken werden inzwischen nicht mehr nur zur Generierung von Modellen zum Verständnis einzelner Gene eingesetzt, sondern auch in der Biotechnologie zur Produktion pharmakologisch wichtiger Proteine oder als Testsysteme genutzt (SCHENKEL 2006).

Mit Hilfe verschiedener Techniken, wie viralem Gentransfer (JAENISCH 1974), homologer Rekombination (EVANS und KAUFMAN 1981, MARTIN 1981, WILLIAMS 1990) oder Vorkerninjektion (PALMITER et al. 1982), ist es möglich, ein vorhandenes Gen zu inaktivieren oder ein zusätzliches (fremdes) Gen in ein Genom zu integrieren. Mäuse eignen sich besonders gut für die Generierung von Mutanten, da ihre Generationszeit kurz ist und sie einfach zu halten sind. Zudem ist die Maus das einzige Versuchstier, bei dem die homologen Rekombinationstechniken sicher etabliert sind und somit sehr gezielte Veränderungen am Genom, insbesondere eine Geninaktivierung, erreicht werden können (SCHENKEL 2006).

Mit Hilfe der transgenen Techniken kann also entweder ein zusätzliches Gen in das Genom eingebracht werden, was ein „gain of function“ bedeutet, oder durch die Inaktivierung eines vorhandenen Genes oder seines Produktes ein „loss of function“ bewirkt werden. Durch sogenannte indizierbare Techniken ist es möglich, ein Gen gezielt an- oder abzuschalten.

2.1.1. Nutzen und Besonderheiten transgener Tiere

Zu Beginn des 19. Jahrhunderts ist bei der gezielten Zucht von speziellen Fellfarbvarianten bei Mäusen aufgefallen, dass die hierzu genutzte Inzucht dieser Tiere zu einem erhöhten Auftreten von Krebserkrankungen führte. Auf diese Weise sind die ersten noch heute genutzten Inzuchtstämme etabliert worden (NAGY et al. 2003). Erste Mutanten sind durch spontane Mutationen entstanden, wie z.B. die sogenannten „waltzer mouse“ (DOEL und GREEN 1966) oder die gld-Mäuse: gld steht für generalized lymphoproliferative disease (ROTHS et al. 1984). Auf eine passende spontane Mutation zur Untersuchung gezielter

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Fragestellungen zu warten, ist bei den etwa 30.000 Genen der Maus nicht besonders aussichtsreich. Mit der gezielten Mutation spezifischer Gene durch die verschiedenen transgenen Techniken ergaben sich völlig neue Möglichkeiten, um gezielten Fragestellungen nachgehen und Antworten auf diese finden zu können. Die Voraussetzung hierfür war die von LIN (1966) erstmals erfolgreich durchgeführte Manipulation an lebenden Embryonen, welche die Injektion von bovinem Gammaglobulin in den Pronucleus überlebten. Die erste transgene Maus generierte JAENISCH (1974) mithilfe eines viralen Gentransfers. Das Anwendungsgebiet für transgene Tiere ist weit gefächert. Die häufigsten Anwendungsgebiete sind jedoch die Untersuchung von gewebespezifischen oder entwicklungsspezifischen Genregulationen und der Effekt eines Transgens auf den Phänotyp (NAGY et al. 2003). So wurden strukturell veränderte Prionen als Ursache für Scrapie und BSE mit Hilfe transgener Mäuse bestätigt (WEISSMANN et al. 1998).

Mit der Generierung immer neuer transgener Tiere entstanden neue Herausforderungen in der Versuchstierhaltung. Die Erhaltungszucht dieser einmaligen Tiere benötigt nicht nur viel Platz, sondern birgt auch die Gefahr des Verlustes der Tiere, z.B. durch einen Hygieneeinbruch in der Haltung. Zudem kommt es durch die Zucht der Tiere zu einer genetischen Drift, d.h. nach einigen Generationen sind die Nachkommen nicht mehr identisch mit der Ursprungsgeneration. Außerdem besteht die Gefahr einer Einkreuzung unerwünschter Gene durch Labor-Unfälle, z.B. durch falsche Verpaarungen. Generell handelt es sich bei transgenen Linien um kleine bis sehr kleine Populationen, die in der Regel nur an einem Standort gehalten und gezüchtet werden, so dass die Gefahr eines Totalverlustes entsprechend hoch ist. Zum Schutz dieser sehr wertvollen Tiere sollte es einen „Desaster-Plan“ geben. Mit Hilfe der Kryokonservierung von Präimplantationsembryonen und/oder Spermatozoen kann eine Sicherung der transgenen Linien erreicht werden (THE JACKSON LABORATORY 1997). Diese ermöglicht zudem einen erleichterten Austausch transgener Tiere zwischen verschiedenen Einrichtungen. Auf einen für die Tiere belastenden Transport kann verzichtet werden und unterschiedliche Hygienebedingungen innerhalb der Tierhaltungen bereiten weniger Schwierigkeiten (SCHENKEL 2006). Die Kryokonservierung ist zwar kein steriles Verfahren, trotzdem ist eine Kontamination mit pathogenen Keimen bei korrekt verschlossenen Proben unwahrscheinlich (BIELANSKI et al. 2000, BIELANSKI et al. 2003), so dass mit Pathogenen infizierte Populationen gleichzeitig mit der Kryokonservierung saniert

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werden können. Für den Sanierungseffekt ist der steril durchzuführende Embryotransfer mit einem mehrstufigen Waschen der Embryonen besonders wichtig, ebenso wie der Hygienestatus der für den Transfer verwendeten scheinträchtigen Ammen. Wenn möglich sollten die Ammen aus der Zielhaltung stammen, um den dort geforderten Bedingungen zu entsprechen. Bei einer sterilen Operation sollten die Nachkommen aus den kryokonservierten Proben spezifiziert pathogenfrei (SPF) sein und dem Hygienestatus der Amme entsprechen.

Bis zur Kontrolle des Hygienestatus der Tiere ist es sinnvoll, diese in Quarantäne zu halten und erst nach einem befundlosen mikrobiologischen Diagnoseergebnis in die Zielhaltung zu verbringen.

Die Kryokonservierung transgener Mauslinien hat dementsprechend folgende Vorteile:

• Sicherung transgener Linien vor Verlust

• Verzicht auf Erhaltungszucht, wenn die Tiere nicht für Versuche gebraucht werden

• Schutz vor genetischer Drift

• Sanierung von (transgener) Linien zur Erlangung des SPF-Status

• Einfacher Austausch von (transgener) Linien zwischen verschiedenen Einrichtungen ohne Tiertransporte

2.2. Kryokonservierung

Das Wort Kryokonservierung setzt sich aus dem griechischen krýo = Kälte und dem lateinischen conservare = erhalten / bewahren zusammen und kann entsprechend mit „durch Kälte bewahren“ übersetzt werden. Definiert wird Kryokonservierung als Lagerung biologischen Materials, insbesondere Zellen, bei extrem tiefen Temperaturen durch Verwendung von flüssigem Stickstoff (PSCHYREMBEL 260. Auflage 2004).

2.2.1. Entwicklung der Kryokonservierung

Der Wunsch, Erbgut sichern zu können, besteht seit langer Zeit. So werden auf Spitzbergen im Svalbard Global Seed Vault Pflanzensamen aus aller Welt im dauergefrorenen Boden konserviert, um die Welternährung im Falle globaler Katastrophen zu sichern (MINISTRY OF AGRICULTURE AND FOOD NORWAY 2008). Erste Versuche der künstlichen Besamung unternahmen Araber, indem sie mit Hilfe eines Schwammes Sperma aus gerade verpaarten fremden Stuten stahlen, um mit diesem ihre eigenen Stuten zu befruchten (CRABO 2001). Anfang des letzten Jahrhunderts wurde in Russland damit begonnen, die

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Durchführung einer künstlichen Befruchtung zu etablieren (IWANOW 1907). Parallel zu dieser Entwicklung stand das Verständnis von Tiefkühlprozessen und deren Auswirkung auf Zellen im Mittelpunkt des Interesses, wobei vorwiegend mit Pflanzen, Bakterien und Protozoen gearbeitet wurde (SMITH 1961). Diese Untersuchungen zeigten, dass durch den Einfrier- und Auftauprozess zelluläre Veränderungen entstehen, wobei die Bildung von Eiskristallen als wesentliche Ursache der Zellschädigungen erkannt wurde. Erst Mitte des 20. Jahrhunderts wurde die protektive Wirkung von Glycerin auf Geflügelsperma bei der Kryokonservierung entdeckt (POLGE et al. 1949). Diese kryoprotektive Eigenschaft von Glycerin bestätigte sich wenig später auch beim Einfrieren von Bullensperma (O’DELL und ALMQUIST 1957). Seither wird an der Optimierung der Kryokonservierungsprotokolle gearbeitet (WATSON 1995). Die Kryokonservierung ist inzwischen ein fester Bestandteil der modernen Tierzucht geworden. Es sind große Besamungsstationen entstanden, über die das Sperma gewonnen, aufbereitet und verschickt wird. 2008 wurden in Deutschland beispielweise 4.408.397 Erstbesamungen von Rindern durchgeführt (AREITSGEMEINSCHAFT DEUTSCHER RINDERZÜCHTER e.V. 2008). Auch in der Pferdezucht ist der Einsatz der künstlichen Besamung (KB) weit verbreitet, nur bei Robustpferderassen wie dem Isländer überwiegt noch der Natursprung. Eine Ausnahme stellt die Zucht Englischer Vollblüter dar: bei ihnen ist die künstliche Befruchtung bis auf wenige streng geregelte Ausnahmen beschränkt, um eine Einschränkung des Genpools durch die Nutzung weniger Hengste zu vermeiden. In der Tierzucht steht die Produktion möglichst vieler Nachkommen mit den gewünschten Eigenschaften, wie z.B. hohe Milchleistung, Magerfleischanteil oder Bewegungsablauf im Vordergrund.

In der Versuchstierkunde geht es hingegen um die Sicherung einmaliger, sehr wertvoller transgener Linien, welche aus sehr kleinen Populationen bestehen und zusätzlich auch durch eine verminderte Fertilität oder die Auswirkungen des Transgens beeinträchtigt sein können.

1972 gelang es erstmals, Oozyten und Embryonen von Mäusen erfolgreich über einen längeren Zeitraum in flüssigem Stickstoff zu konservieren. Es wurden nach Revitalisierung und Embryotransfer lebende Jungtiere geboren (WHITTINGHAM et al. 1972).

Die erste erfolgreiche Kryokonservierung von Mausspermatozoen gelang erst 1990 (TADA et al. 1990), wobei schon zu diesem Zeitpunkt ein deutlicher Einfluss des verwendeten Mausstammes zu beobachten war. Inzuchtstämme wie z.B. BL/6, auf den viele transgene

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Mäuse gezüchtet werden, zeigten jedoch keine oder nur geringe Befruchtungserfolge nach der Revitalisierung (SONGSASEN u. LEIBO 1997, SZTEIN et al. 2000). Es wurden viele Versuche zur Optimierung der Kryokonservierungstechnik unternommen, wobei OSTERMEIER et al. (2008) eine modifizierte Methode publiziert haben, mit deren Hilfe auch diese „schwierigen“ Mausstämme über Spermatozoen effektiv kryokonserviert werden können.

2.2.2. Biochemische Prozesse bei der Kryokonservierung

Durch den Einfriervorgang kommt es zu einer Dehydrierung von Zellen, da das intrazelluläre Wasser nicht bei 0 °C gefriert. Die Zellmembran und Ionen-Konzentration des Zytoplasmas sind dafür verantwortlich, dass das intrazelluläre Wasser bei Temperaturen von -10 °C bis -15 °C noch nicht gefroren ist: Dieser Zustand wird als „supercooled“ bezeichnet. Im Extrazellularraum wird die Konzentration von nicht zellulär permeablen, osmotisch aktiven Substanzen durch das bereits kristallisierte Wasser erhöht. Dies führt zu einem Ausstrom von Wasser aus der Zelle und somit zu ihrer Dehydrierung. Beim Unterschreiten von -15 °C kommt es zu einer intrazellulären Bildung von Eiskristallen, welche die gesamte Zellstruktur schädigen und zum Tod der Zelle führen können (MAZUR 1970).

Für jeden Zelltyp gibt es eine optimale Einfriergeschwindigkeit, welche von der Wasserpermeabilität und dem Verhältnis von Zellvolumen zur Zelloberfläche abhängig ist.

Zwei gegenläufige Prozesse sind während des Einfrierens als Auslöser von Zellschädigungen oder –tod möglich: Wird eine Zelle zu schnell eingefroren, so bilden sich intrazelluläre kleine Eiskristalle aus, die beim Auftauen zu großen Eiskristallen verschmelzen und die Zelle schädigen. Bei zu langsamem Einfrieren der Zelle kommt es zur Dehydrierung mit einer Konzentrationserhöhung der nicht membrangängigen Substanzen und pH-Wert-Änderung innerhalb der noch physiologisch aktiven Zelle. Je länger Zellen diesen Bedingungen ausgesetzt sind, umso größer ist deren schädigende Wirkung. Für jeden Zelltyp gibt es somit eine optimale Einfriergeschwindigkeit, die langsam genug ist, um intrazelluläre Eiskristallbildung zu verhindern und schnell genug, um die schädigenden Lösungseffekte zu minimieren (MAZUR 1970).

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intrazelluläre Eiskristalle

„Lösungseffekte“

Eiskristalle

zu langsam

optimal

zu schnell

Einfriergeschwindigkeit:

Abb. 1: Kryokonservierungsprozess

Schematische Darstellung der Einfrierprozesse in einer Zelle und Schädigung durch zu langsames bzw. zu schnelles Einfrieren (nach MAZUR 1970).

LEIBO (1992) unterteilt das Einfrieren und Auftauen in vier Schritte:

• zum Einfrieren werden die Zellen in Medien mit unphysiologischen Bedingungen durch hochkonzentrierte Kryoprotektiva verbracht

• Abkühlen der Temperatur mit einem fast vollständigen Entzug des intrazellulären Wassers

• nach einer unterschiedlich langen Lagerzeit werden die Proben wieder auf ihre physiologische Temperatur erwärmt

• die Zellen müssen das verlorene Wasser wieder aufnehmen, also rehydrieren, und in ihr physiologisches Milieu zurückkehren

In Abhängigkeit von der Membranpermeabilität der Zelle für Wasser und des verwendeten Kryoprotektivums kann der letzte Schritt einen osmotischen Schock auslösen, welchen LEIBO (1992) als die Ursache für den Zelltod ansieht. Durch eine zu schnelle Wasseraufnahme wird die Integrität der Zellmembran beschädigt und die Zelle lysiert. Mit

(20)

einer schrittweisen Equilibrierung zurück in den physiologischen Zustand kann diesem Phänomen entgegenwirkt werden. Damit widerspricht LEIBO (1992) einem schädigenden Lösungseffekt.

Abb. 2: Kryokonservierung: De- und Rehydrierung der Zelle

Prozesse während des Einfrierens und Auftauens, möglicher osmotischem Schock als Ursache für den Zelltod (nach LEIBO 1992).

Für ein erfolgreiches Einfrieren von Zellen ist jedoch nicht nur der Zelltyp verantwortlich, sondern es müssen auch tierartspezifische und sogar tierindividuelle Reaktionen auf die Kryokonservierungsmethode berücksichtigt werden. Ein Protokoll, welches bei einer Tierart erfolgreich eingesetzt wird, kann bei einer anderen Tierart zu schlechten oder ausbleibenden Erfolgen führen (WOODS et al. 2004).

Osmotischer Schock H2O

Einfrieren

Einfrieren / Dehydrierung Auftauen / Rehydrierung

Langsames rehydrieren

Lagerung bei -196°C

Lebende Zelle

Zu schnelles rehydrieren

Kryoprotektiva Zugeben von

Kryoprotektiva

(21)

2.2.3. Kryoprotektiva

Als Kryoprotektiva werden Stoffe bezeichnet, welche Zellen beim Einfrieren vor einer Schädigung schützen sollen. Traditionell werden die Kryoprotektiva in zwei Klassen eingeteilt: in penetrierende und nicht penetrierende Kryoprotektiva (MERYMAN 1971).

Penetrierende Kryoprotektiva, wie z.B. Glycerin oder Dimethylsulfoxid (DMSO), diffundieren in die Zelle und schützen diese vor zu schneller Dehydrierung. Um eine Zelle effektiv schützen zu können, müssen die Kryoprotektiva zwei Voraussetzungen erfüllen: Zum einen müssen sie die Zellmembran passieren können und zum anderen dürfen sie in den benötigten Konzentrationen nicht zelltoxisch sein. Verbleibt ein zu großer Anteil von ihnen außerhalb der Zelle, so haben sie einen gegenteiligen Effekt und bewirken eine zusätzliche Dehydrierung der Zelle (MERYMAN 1971). Ihr Schutzeffekt ist in hohem Maße abhängig von der Permeabilität der Zellmembran für das jeweilige Kryoprotektivum. Nur wenn das Kryoprotektivum ausreichend Zeit bekommt, in die Zelle zu diffundieren, ist ein Schutz möglich. Dies gilt insbesondere für weniger permeable Substanzen wie Diethylen- und Triethylen-Glycerin, bei denen die Überlebensrate der Zellen eine deutliche Abhängigkeit von der Einwirkzeit vor der Kryokonservierung zeigt. Diese Abhängigkeit ist bei dem hoch permeablen Ethylen-Glycerin nicht vorhanden und bei dem etwas weniger permeablen DMSO nur gering ausgeprägt (LEIBO 1986).

Nicht penetrierende Kryoprotektiva sind Makromoleküle, in der Regel Zucker wie z.B.

Raffinose. Sie erhöhen die Viskosität der extrazellulären Flüssigkeit und ermöglichen osmotisch bedingt einen schnellere Wasserdiffusion aus der Zelle. Mit ihrer Hilfe wird die optimale Einfrierrate von Zellen erhöht, wodurch gleichzeitig die Expositionszeit der Zelle mit schädigenden Lösungseffekten verringert wird (MERYMEN 1977). Ihr Schutzeffekt ist am höchsten bei schnellen und sehr schnellen Einfrierverfahren. Sie können auch als Schutz vor einem osmotischen Schock beim Auftauen kryokonservierter Proben eingesetzt werden.

Dann sind sie während des Einfrierens nicht im selben Medium wie die Embryonen, sondern befinden sich in einer zweiten, getrennten Phase, dem Verdünnungsmedium, dargestellt in Abb. 3. Beim Auftauen werden die beiden Medien gemischt und das nicht penetrierende Kryoprotektivum schützt die Zellen vor einem zu schnellen Wassereinstrom. Diese Technik wird bei der Kryokonservierung von Mausembryonen eingesetzt (LEIBO u. MAZUR 1971).

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Abb. 3: Einfrieren von Embryonen

Beladene Paillette zum Einfrieren von Mausembryonen.

M2 + G = Einfriermedium mit Glycerol zum Schutz der Embryonen während des Einfrierens M2 + S = Verdünnungsmedium mit Saccharose, welches durch das Vermischen mit dem Einfriermedium direkt nach dem Auftauen einen möglichen osmotischen Schock verhindert

2.2.4. Kryokonservierung von Spermatozoen

Die Kryokonservierung von Spermatozoen zur Sicherung transgener Mauslinien wurde als Alternative zur Kryokonservierung von Embryonen Ende des 20. Jahrhunderts etabliert (MARSCHALL 1999, MARSCHALL et al. 1999, SZTEIN et al. 2000). Das Einfrieren von Spermatozoen hat gegenüber der Kryokonservierung von Embryonen den Vorteil, dass nur wenige Spendertiere benötigt werden, welche im Vergleich zu Embryonenspendern vor der Kryokonservierung nicht behandelt werden müssen. Im Gegensatz zum Einfrieren ist die Revitalisierung aufwändiger, da eine in vitro-Fertilisation (IVF) mit anschließendem Embryotransfer durchgeführt werden muss. Für eine IVF werden Oozyten von Wildtyp- Mäusen mit dem genetischen Hintergrund der transgenen Mauslinie genutzt, wodurch eine Konservierung der homozygoten Mutation oder auch der gesamten Mutante nicht möglich ist (Abb. 4, S.13; Tab. 1, S. 14). Im Anschluss an eine erfolgreiche Revitalisierung kann somit noch die Notwendigkeit einer Rückkreuzung bestehen (Abb. 4, S. 13), z.B. wenn für die Versuche homozygot transgene Tiere benötigt werden (SCHENKEL 2006). Dies ist bei der Kryokonservierung homozygoter Präimplantationsembryonen nicht notwendig.

Spritze

Adaptor

Stopfen

M2 + S

M2 + S M2 + G

Embryonen Luft

(Schweißnaht) (Schweißnaht)

(23)

Abb. 4: Kryokonservierung von Spermatozoen

Schematische Darstellung der Kryokonservierung von Mausspermatozoen aus „Transgene Tiere“ (SCHENKEL 2006).

Die Spermatozoen werden nach dem JAX-Protokoll kryokonserviert, welches keine Spermatozoenkonzentrationsbestimmung und Verdünnung vor dem Einfrieren vorsieht (SZTEIN et al. 2000, OSTERMEIER et al. 2008).

(24)

Tab. 1: Vergleich der Kryokonservierung von Embryonen und Spermatozoen

Vor- und Nachteile der Kryokonservierung von Embryonen und Spermatozoen im Vergleich.

VP+-Spendertiere = Vaginalpfropf positive Tiere, d.h. sicher kopulierte Mäuse

Parameter Embryonen Spermatozoen

Zahl der

Embryonen/Spermatozoen pro Spendertier

niedrig sehr hoch

Aufwand der Kryokonservierung

hoch

(200-500 Embryonen;

> 20-50 VP+-Spendertiere)

niedrig

(ca. 10 Spendertiere) Aufwand der

Revitalisierung

niedrig (nur ET)

hoch (IVF + ET) Genotyp der

revitalisierten Proben identisch nicht identisch

(Einfluss Eizellspender) Kryokonservierung von Mutation/mutiertem Tier Mutation

Qualitätskontrolle Probe verloren eine Probe von 14 Kontrollgenotypisierung nicht immer möglich möglich

Verfügbarkeit bei den meisten genetischen Hintergründen möglich

IVF nicht bei allen

genetischen Hintergründen durchführbar

Die Fertilität in der in vitro-Fertilisation ist abhängig vom genetischen Hintergrund der jeweiligen Mauslinie. Eine Ursache für diese Unterschiede in der Befruchtungsrate kann in einer genetisch abhängigen Sensitivität der Mausspermatozoen gegenüber osmotischen Veränderungen liegen (SONGSASEN u. LEIBO 1997). WALTERS et al. (2005) bestätigten einen Einfluss von nicht physiologischen Bedingungen (osmotischer Stress) auf die Motilität der Spermatozoen, jedoch keinen genetischen Einfluss auf die Akrosomenintegrität und Membranpermeabilität. Ein genetischer Einfluss auf den Befruchtungserfolg in einer IVF zeigt sich aber auch mit frisch gewonnenen Spermatozoen, ohne dass diese osmotischen Veränderungen ausgesetzt sind, wobei Hybride- oder Auszuchtlinien die besten Ergebnisse erzielen (SUZUKI et al. 1996).

Für die Kryokonservierung von Spermatozoen ist die Einfriergeschwindigkeit von besonderer Bedeutung. STACY et al. (2006) erzielten bei der Untersuchung der Temperaturveränderungen beim Nakagata-Protokoll (NAKAGATA 2000) zum Einfrieren von Spermatozoen eine Variation der Einfriergeschwindigkeit von 30° bis 300 °C/min, abhängig von geringen Änderungen im Protokoll nicht näher spezifizierter Parameter, wie z.B. der Füllhöhe des Stickstoffs oder der Eintauchtiefe der Probe in den Stickstoff. Eine

(25)

mittlere Einfriergeschwindigkeit von 114 °C/min resultierte in einer höheren Motilität der Spermatozoen nach dem Auftauen als eine langsame (39 °C/min) oder schnelle (192 °C/min) mittlere Einfriergeschwindigkeit.

WOODS et al. (2004) kritisierten, dass viele Erkenntnisse, wie z.B. eine kontrollierte Einfriergeschwindigkeit, bislang nicht in die Routine bei der Kryokonservierung von Spermatozoen übernommen wurden, sondern nach wie vor die Kryoprotektiva abrupt zu den Spermatozoen gegeben würden und das Einfrieren unkontrolliert in der Dampfphase des Stickstoffs stattfindet.

2.2.5. Lagerung kryokonservierter Proben

Kryokonservierte Proben können entweder in der Flüssigphase des Stickstoffs bei -196 °C oder im Stickstoffdampf oberhalb des Flüssigkeitsniveaus gelagert werden. Um eine Übertragung von Krankheitserregern zwischen verschiedenen Proben zu verhindern, ist für menschliche Embryonen und Spermien eine Lagerung in der flüssigen Phase des Stickstoffs durch das Medizinproduktegesetz verboten. Eine Übertragung von Krankheitserregern ist besonders bei der offenen Lagerung, d.h. bei nicht versiegelten Proben, beobachtet worden.

BIELANSKI et al. wiesen eine Übertragung von viralen (2000) und bakteriellen (2003) Pathogenen über die Flüssigphase des Stickstoffs bei offenen Proben nach. Problematisch bei der Lagerung im Stickstoffdampf ist jedoch das Halten einer konstanten Temperatur. Es kann zu Temperaturschwankungen kommen, welche sich negativ auf die Plasmamembranintegrität der Proben auswirken. Durch das Öffnen des Lagerbehälters kommt es zu einem Einstrom von Luft mit Raumtemperatur, welche sich mit dem Stickstoffdampf mischt und somit dessen Temperatur drastisch erhöht. Unterhalb einer Temperatur von -130 °C findet keine Bildung von Eiskristallen mehr statt. Wird die Probe jedoch auf über -130 °C erwärmt so können kleine Eiskristalle innerhalb der Zellen zu größeren Kristallen verschmelzen und hierdurch eine Schädigung der Zelle bewirken (MERYMAN 1956). Zudem wird eine Übertragung von Pathogenen auch über die Dampfphase des Stickstoffs diskutiert (BIELANSKI et al. 2000).

(26)

2.3. Revitalisierung (transgener) Linien mit Hilfe kryokonservierter Spermatozoen Die Revitalisierung kryokonservierter Spermatozoen lässt sich in vier Phasen unterteilen:

• Auftauen / Rehydrieren der Probe

in vitro-Fertilisation

• Embryotransfer und nachfolgende Trächtigkeit

• Wurf und Aufzucht der Jungtiere

Um eine neue Zucht aufzubauen reicht theoretisch eine adulte und fertile Maus, die das Transgen trägt.

Auftauen der Spermatozoen:

Für das Auftauen von Spermatozoen ist eine hohe Auftaugeschwindigkeit am Besten geeignet. Allerdings hat die Einfriergeschwindigkeit einen größeren Einfluss auf die Qualität der Spermatozoen als die Auftaugeschwindigkeit (STACY et al. 2006).

in vitro-Fertilisation:

Die erste erfolgreiche Befruchtung von Eizellen bei Mäusen in vitro wurde von WHITTINGHAM (1968) durchgeführt. Erst ab 1990 war jedoch eine Kryokonservierung von Mausspermatozoen möglich (TADA et al.1990) und die Notwendigkeit einer erfolgreichen in vitro-Fertilisation mit eingefrorenen, eingelagerten und wieder aufgetauten Spermatozoen gegeben. Ohne eine verlässliche in vitro-Fertilisation mit nachfolgendem Embryotransfer wäre ein Einfrieren und Lagern von Spermatozoen nicht sinnvoll, da nur lebende Mäuse wieder nutzbar sind. Um dies zu erreichen, müssen viele unterschiedliche Faktoren aufeinander abgestimmt werden und optimal ineinandergreifen. Eine gute Spermaqualität ist nicht der einzige beeinflussende Faktor für eine gute Fertilität in der IVF. Auch die Qualität der Eizellen, die Einstellungen des Brutschrankes, die Medien und der genetische Hintergrund haben einen erheblichen Einfluss auf die Befruchtungsrate in der in vitro-Fertilisation. Ob eine IVF zu epigenetischen Effekten führt, welche nicht von der Gensequenz abhängig sind, sondern über das An- bzw. Abschalten vorhandener Gene den Phänotyp beeinflussen, wird kontrovers diskutiert. Im Vergleich zwischen der Genexpression in vivo und in vitro zeigen einige Proteine wie z.B. IGF-1 Ligand unterschiedliche Konzentrationen, während andere wie z.B. TGFα keine Unterschiede aufweisen (STOJANOV u. O´NEILL 2001). Bei Rindern und

(27)

Schweinen tritt bei in vitro produzierten bzw. geklonten und transferierten Embryonen eine erhöhte Resorptionsrate im Vergleich zu künstlicher Befruchtung und Embryotransfer auf.

Zudem ist die Tragzeit verlängert, es gibt vermehrt Schwergeburten und die Jungtiere haben ein höheres Geburtsgewicht sowie vermehrt Fehlbildungen (KRUIP u. DEN DAAS 1997).

Embryotransfer:

Ohne den Embryotransfer wären nicht nur die Kryokonservierung von Spermatozoen, sondern auch die von Embryonen unmöglich, ebenso wie die Generierung transgener Tiere.

Diese Technik spielt somit eine zentrale Rolle in der Generierung, Sanierung und Sicherung transgener Mäuse. Es gibt zwei unterschiedliche Methoden der Durchführung eines Embryotransfers: Die Embryonen können über das Infundibulum in den Eileiter transferiert werden (Eileitertransfer) oder über eine Kanüle direkt in den Uterus appliziert werden (Uterustransfer). Der erste erfolgreiche Uterustransfer von Embryonen wurde von McLAREN und BIGGERS (1958) durchgeführt. Ein Jahr später wurde der Eileitertransfer erstmals beschrieben (TARKOWSKI 1959). Das heute angewendete Protokoll für einen Eileitertransfer hat WHITTINGHAM (1968) aus einem Transferprotokoll für Ratten (NOYES und DICKMAN 1961) abgeleitet. Um einen Embryotransfer erfolgreich durchzuführen, d.h.

damit eine Maus trächtig wird, müssen zwei Voraussetzungen erfüllt sein: Erstens müssen scheinträchtige Ammen zur Verfügung stehen und zweitens sollte das Stadium der Scheinträchtigkeit annähernd mit dem Entwicklungsstadium der Embryonen übereinstimmen.

Scheinträchtige Ammen werden durch die gezielte Verpaarung mit vasektomierten, d.h.

deckfähigen, aber infertilen männlichen Tieren generiert. Der Eileitertransfer eignet sich somit am besten für zwei- bis achtzellige Embryonen, wobei Ammen am Tag 0,5 nach der Verpaarung hierfür zu bevorzugen sind. Der Uterustransfer ist für den Transfer von Blastozysten gut geeignet, wobei Ammen am Tag 3,5 nach der Verpaarung mit einem vasektomierten Tier am besten geeignet sind, da in diesem Fall die Entwicklung der Embryonen mit dem Trächtigkeitsstadium der scheinträchtigen Amme korreliert (NAGY et al. 2003).

(28)

Wurf und Aufzucht der Jungtiere:

Um eine ungestörte Geburt lebender Jungtiere nach einem Embryotransfer und Trächtigkeit zu sichern, sollten die Ammen möglichst ruhig und unter optimalen Umweltbedingungen gehalten werden, da Stress zu einer Beeinträchtigung der Reproduktionsleistung führen kann (MOBERG 1991). Durch Lärm oder ein nicht optimales Raumklima kann die Resorption der Embryonen bzw. Kannibalismus der Jungtiere nach dem Wurf ausgelöst werden. Auch eine an den erhöhten Energiebedarf angepasste Fütterung der Tiere ist für eine erfolgreiche Aufzucht notwendig (NAGY et al. 2003, GESELLSCHAFT FÜR VERSUCHSTIERKUNDE; SOCIETY FOR LABORATORY ANIMAL SCIENCE 2003).

Da eine Amme kleine Würfe manchmal nicht annimmt bzw. aufgrund einer verlängerten Trächtigkeit bei kleinen Würfen ein Kaiserschnitt notwendig werden kann, kann parallel zum Embryotransfer eine Verpaarung von Wildtyp-Tieren durchgeführt werden. Diese verpaarte Maus wirft dann zum selben Zeitpunkt wie die Amme. Ihr können die wertvollen transgenen Jungtiere untergelegt werden, wenn eine Aufzucht durch die eigentliche Amme nicht möglich sein sollte (NAGY et al. 2003).

2.3.1 Qualitätssicherung kryokonservierter Spermatozoen

Nur nach einer Kontrolle der Qualität kryokonservierter Spermatozoen bzw. Embryonen kann die Erhaltungszucht einer transgenen Linie beendet werden. Da die Spermaqualität ein individueller Parameter ist und zwischen Tieren derselben Linie schwanken kann, ist es notwendig, eine Probe von jedem Spendertier zu untersuchen (WOODS et al. 2004). Durch die hohe Anzahl an parallelen Proben pro Tier ist es problemlos möglich, eine von ihnen für die Qualitätskontrolle zu nutzen. So kann beurteilt werden, ob zusätzliche Spendertiere benötigt werden oder bereits eine ausreichende Sicherung der jeweiligen Linie erreicht wurde.

Die beiden Parameter für die Qualitätssicherung sind die Fertilität in der in vitro-Fertilisation und die Motilität der Spermatozoen. Der momentane Goldstandard ist die IVF. Auch wenn die Motilität als Beurteilungsparameter bestimmt wird, ist die Fertilität in der IVF zusätzlich und als Vergleichsparameter untersucht worden (TADA et al. 1990, SZTEIN et al. 1997, SZTEIN et al. 2000, OSTERMEIER et al. 2008). Die Spermienmotilität zeigt keine besonders gute Übereinstimmung mit der Fertilität in der IVF (THE JACKSON LABORATORY, 2008). Nur die Durchführung einer IVF erlaubt eine definitive Aussage über die

(29)

Befruchtungsfähigkeit der kryokonservierten Spermatozoen. Den stärksten Beweis für die mögliche Revitalisierung transgener Linien über kryokonservierte Spermatozoen stellen jedoch lebend geborene Jungtiere aus einem Transfer mit Embryonen aus einer in vitro- Fertilisation dar (THE JACKSON LABORATORY, 2008). Es muss bedacht werden, dass sowohl die in vitro-Fertilisation als auch der Embryotransfer sensible und komplexe Techniken sind, welche nicht immer zuverlässig funktionieren.

Voraussetzung für eine erfolgreiche IVF mit nachfolgendem ET ist das Verständnis des physiologischen Sexualzyklus sowie dessen Beeinflussung mit Hormonen zur Superovulation und die Physiologie der Gravidität, um scheinträchtige Ammen für den Embryotransfer zu generieren.

2.4. Sexualzyklus der Maus

Mäuse sind polyöstrisch und erreichen im Alter von sechs bis sieben Wochen die Geschlechtsreife. Die Dauer eines Sexualzyklus umfasst ca. vier bis fünf Tage. Es handelt sich um eine spontane Abfolge wiederkehrender Ereignisse (ALLEN 1922). Unter normalen Umweltbedingungen zeigen Mäuse einen circadianen Rhythmus der Reproduktion in Abhängigkeit von der Tageslichtlänge und den klimatischen Bedingungen. Durch die standardisierten Bedingungen in der Labortierhaltung sollen Mäuse keine jahreszeitliche Abhängigkeit des Reproduktionsverhaltens zeigen (PARKES und BRAMBELL 1928). Der Tag-Nachtrhythmus im Tierhaus ist das ganze Jahr auf „Frühling“ mit 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit eingestellt. Zudem herrscht eine konstante Temperatur von 22 °C, so dass die Mäuse „Frühlingsgefühle“ haben und eine hohe Reproduktionsaktivität zeigen.

SCHWAB und SCHENKEL (2008b) beschreiben dagegen trotz dieser standardisierten Bedingungen einen deutlichen jahreszeitlichen Rhythmus in der Embryonenausbeute über einen Zeitraum von fünf Jahren. Dieses Phänomen ist unter anderem auf Schwankungen der Luftfeuchtigkeit in Abhängigkeit von der Außentemperatur zurückzuführen (DIERCKS et al.

2010).

2.4.1. Scheinträchtigkeit bei der Maus

Die Ovulation ist bei der Maus ein spontanes Ereignis. Um eine vollständige Funktion der Corpora lutea (C.l.) zu erreichen, wird jedoch ein neuroendokriner Stimulus (Stimulation der Cervix) benötigt (KENNEY et al. 1977). Bleibt dieser Reiz durch eine nicht erfolgte Paarung

(30)

aus, so bilden sich nach der Ovulation C.l. mit eingeschränkter Funktion und verkürzter Lebensdauer (DONNELLEY und HAU 1994). Diese insuffizienten C.l. sind nicht in der Lage eine Trächtigkeit aufrecht zu erhalten. Vor allem für die Generierung von scheinträchtigen Ammen für einen Embryotransfer ist dies von großer Bedeutung. Ohne eine Stimulation der Cervix, wie z.B. die Verpaarung mit einem vasektomierten männlichen Tier, wäre die Amme nicht in der Lage, Jungtiere auszutragen. Eine erfolgte Kopulation ist am sogenannten Vaginalpfropf, welcher aus koagulierten Proteinen aus der Samenflüssigkeit besteht und die Vagina bis zu 24 Stunden nach der Verpaarung verschließt, erkennbar. Nach 19 bis 21 Tagen Trächtigkeit werden die Jungtiere blind und unbehaart geboren. Im Durchschnitt besteht ein Wurf aus sechs bis zehn Jungtieren, ihre Anzahl ist aber insbesondere bei transgenen Mäusen variabel und kann wesentlich kleiner sein. Nach der Geburt sollte die Maus mit ihren Jungtieren zwei bis drei Tagen in Ruhe gelassen werden, da bei einer Störung die Gefahr von Kannibalismus droht (NAGY et al. 2003). Mit frühestens drei Wochen können die schnell heranwachsenden Jungtiere vom Muttertier abgesetzt werden (NAGY et al. 2003).

2.4.2. Superovulation und Synchronisation des Östrus

Um eine gezielte und erhöhte Ovulationsrate zu induzieren, werden vorwiegend präpubertäre weibliche Mäuse mit einem Alter von vier bis sechs Wochen mit Hormonen behandelt. Die Superovulation kann für unterschiedliche Zwecke eingesetzt werden: die Gewinnung einer möglichst hohen Oozytenanzahl zur Durchführung einer IVF oder die gezielte Verpaarung von Mäusen zur terminierten Geburt von Jungtieren bzw. um definierte Embryonalstadien zur Kryokonservierung oder Sanierung zu erhalten. Superovuliert wird nach dem von WHITTINGHAM (1971) entwickelten Schema, wobei die Tiere zu festgelegten Zeiten mit Gonadotropinen behandelt werden. Die erste Injektion mit equinem Choriongonadotropin (eCG) zur Stimulation der Follikelreifung (FSH-Analogon) wird zwei Stunden vor Beginn der Nachtphase appliziert. Zur gezielten Verpaarung wird nach 44 Stunden humanes Choriongonadotropin (hCG) zur Induktion der Ovulation (LH-Analogon) injiziert und die Tiere werden über Nacht zu den männlichen Tieren gesetzt. Für die Gewinnung von Oozyten wird hCG 48 Stunden nach der eCG-Gabe appliziert. 12 bis 14 Stunden später können die unbefruchteten Oozyten aus der Ampulle des Eileiters präpariert und in der IVF eingesetzt werden.

(31)

Zu beachten ist, dass der genetische Hintergrund den Erfolg der Superovulation beeinflusst (BYERS et al. 2006), wobei Mäuse aus Hybrid- und Auszucht bessere Oozyten- und Embryonenspender sind als Inzuchttiere (AUERBACH et al. 2003). Die Wirkung des exogenen Gonadotropins wird von wenigen stammspezifischen Genen beeinflusst (SPEAROW 1988, SPEAROW u. BARKLEY 1999).

Entscheidend für den Erfolg der Superovulation ist auch der Zeitpunkt der ersten Gonadotropingabe. Befinden sich die Tiere im Östrus, so kann die größte Anzahl an Oozyten gewonnen werden, während im Diöstrus mit der niedrigsten Anzahl zu rechnen ist (TARIN et al. 2002). Aus diesem Grund ist es sinnvoll, mit präpubertären Tieren zu arbeiten, wenn die Trächtigkeit nicht aufrechterhalten werden soll. Bei ihnen wird eine hohe Oozyten- bzw.

Embryonenausbeute erreicht, da sie sich noch nicht im Zyklus befinden (NAGY et al. 2003).

Bei älteren Tieren, welche sich bereits im Zyklus befinden, ist die Reaktion auf die Superovulation abhängig vom Zyklusstand des einzelnen Tieres, so dass die Zahl der gewonnenen Eizellen im Vergleich mit präpubertären Mäusen niedriger ist.

2.4.3. Stress in der Versuchstierhaltung

Generell ist die Frage nach Wohlbefinden oder Stress nicht nur aus ethischer Sicht, sondern auch im Hinblick auf die Qualität von Tierversuchsergebnissen besonders wichtig. Eine generell gültige Definition von Stress gibt es nicht. BROOM und JOHNSON (1993) definieren Stress als einen Umweltfaktor, durch den das Kontrollsystem des Tieres überfordert und seine Fitness reduziert wird. Nach dieser Definition geht Stress immer mit einem schlechteren Wohlbefinden einher (BROOM 1996), wohingegen DAWKINS (1980) Stress unter bestimmten Umständen sogar als ein Zeichen für Wohlbefinden ansieht.

Negativer Stress wird als Distress und positiver Stress als Eustress bezeichnet. Die GESELLSCHAFT FÜR VERSUCHSTIERKUNDE; SOCIETY FOR LABORATORY ANIMAL SCIENCE (1992) definiert Distress, also Stress mit einem negativen Einfluss auf den Organismus, als einen Zustand, in welchem das Tier einen Großteil seiner Anstrengungen bzw. Ressourcen adaptiven Reaktionen auf Umwelteinflüsse widmen muss. In den Begriff Distress werden „Angst“, „Frustration“ oder „Depression“ mit einbezogen. „Diskomfort“

wird als milde Form von Distress angesehen.

Im Umkehrschluss definiert BROOM (1988) Wohlbefinden eines Individuums als die Fähigkeit, sich situationsgemäß an die Anforderungen seiner Umwelt anzupassen und diese

(32)

zu bewältigen. Im Tierschutzgesetz geht der Begriff Wohlbefinden über das bloße Fehlen von Schmerzen, Leiden und Schäden hinaus. Er wird als „frei von negativen Empfindungen“

verstanden und wird durch Gesundheit, Zufriedenheit, Erfüllung sozialer und ethologischer Bedürfnisse sowie durch normales Verhalten gekennzeichnet (HACKBARTH u. LÜCKERT 2002).

Im Umgang mit Versuchstieren ist es wichtig zu beachten, dass Handhabung und Management der Tiere einen nicht zu unterschätzenden Stressfaktor darstellen (MATTERI u.

MOBERG 1986). Auch Lärm, Vibrationen, andere Tiere, eine hohe Belegungsdichte, das Raumklima und zahlreiche weitere Umweltfaktoren sind potentielle Stressoren für die Tiere.

Hierbei muss die vom Menschen abweichende Sinneswahrnehmung der Tiere berücksichtigt werden. Mäuse können im Ultraschallbereich hören und somit durch für Menschen nicht wahrnehmbare Geräusche gestresst werden (CASTELHANO-CARLOS u. BAUMANS 2010). Auch das Verhalten des Experimentators, des an Versuchen beteiligten Personals und der Tierpfleger stellt einen potentiell zu Distress führenden Reiz dar (GESELLSCHAFT FÜR VERSUCHSTIERKUNDE; SOCIETY FOR LABORATORY ANIMAL SCIENCE 1992).

Die Umweltbedingungen, darunter auch Lärm, führen zu einer Verminderung der Reproduktionsrate von Mäusen (DIERCKS et al. 2010).

Viele unterschiedliche Stressoren können das Wohlbefinden der Tiere negativ beeinflussen (BREAZILE 1987). Eine erfolgreiche Reproduktion ist von einer strikten Abfolge neuroendokriner Prozesse abhängig. Im ovariellen Zyklus ist die Follikelreifung mit nachfolgender Ovulation eine besonders Stress-sensitive Phase (MOBERG 1991). Stress bewirkt eine Veränderung der neuroendokrinen Interaktionen auf verschiedenen Ebenen der Hypothalamus-Hypophysen-Achse. Durch die Aktivität des Corticoliberin (CRH) kommt es zu einer Verminderung der Sekretion von Gonadoliberin (GnRH) im Hypothalamus (RIVIER u. VALE 1984, TSIGOS u. CHROUSOS 2002a). Im Proöstrus kommt es durch Stress zu einer Unterdrückung der Ausschüttung der Gonadotropine Lutropin (LH) und Follitropin (FSH) und dadurch zu einer Hemmung der Ovulation (ROOZENDAAL et al. 1995). Eine erhöhte Glukokortikoidausschüttung führt zu einer Hemmung von Wachstum und Reproduktion auf der Ebene von Hypothalamus, Hypophyse und peripherer Hormone. Die Hemmung der peripheren Hormone erfolgt hierbei über eine Änderung der Rezeptoren im Zielgewebe (CHROUSOS 2000b). Neben den Glukokortikoiden werden stressbedingt auch

(33)

endogene Opioide aktiviert, welche über Opioidrezeptoren im Hypothalamus eine verminderte LH-Ausschüttung bewirken (PETRAGLIA 1986).

Durch Stress wird nicht nur der Sexualzyklus negativ beeinflusst, sondern es kann auch zu einer Störung der Embryonalentwicklung im Falle einer Trächtigkeit kommen. Verschiedene Studien zeigen einen negativen Effekt von Lärm bzw. Vibration auf die Embryonalentwicklung, wobei insbesondere die Knochenbildung (CASTILLO et al. 2006;

XIE et al. 2006) und die Entwicklung des Herz-Kreislaufsystems (FARAH et al. 2004, FARAH et al. 2006) betroffen sind. In einem Versuch zu den Folgen eines Erdbebens im Mausmodell hatten MONTENEGRO et al. (1995) eine Resorptionsrate von bis zu 50% der Trächtigkeiten beobachtet. Hohe Resorptionsraten wurden durch ein Projekt zur Untersuchung der Auswirkung von Verkehrslärm, welcher durch künstliche Vibration simuliert wurde, ausgelöst (FANGHANEL u. SCHUMACHER 1980). NAWROT et al.

(1980) zeigten, dass unterschiedliche Arten von Lärm zu einer Embryotoxizität führen. Auch Baulärm führt zu einer verminderten Reproduktivität von Mäusen (DIERCKS et al. 2010).

2.5. Alternative Qualitätskontrolle kryokonservierter Spermatozoen

Die in vitro-Fertilisation mit nachfolgendem Embryotransfer ist nicht nur eine sehr zeitaufwändige und kostenintensive Technik, sondern es werden zudem sehr viele Versuchstiere zu reinen Kontrollzwecken benötigt. Eine alternative, verlässliche Technik ohne den Einsatz von Versuchstieren zur Qualitätssicherung ist somit anzustreben. Die IVF ist eine sensible Technik, die nicht nur von der Qualität der Spermatozoen abhängt, sondern auch durch die Qualität der Oozyten bzw. Eizellspendertiere beeinflusst wird. Damit unterliegt sie auch exogenen Einflussfaktoren wie Klima, jahreszeitliche Abhängigkeit der Embryonenausbeute (SCHWAB u. SCHENKEL 2008b), oder haltungs- und umgangsbedingtem Stress im Tierhaus, da insbesondere die Reproduktionsrate negativ durch Stress beeinflusst wird (MOBERG 1991). Neben der Spermaqualität haben auch die Qualität der Oozyten, sowie das Kulturmedium einen Einfluss auf die Fertilität in der IVF (DANDEKAR u. GLASS 1987, HO et al. 1995, SCOTT u. WHITTINGHAM 1996, BECKER u. JERCHOW 2010). Diese Technik wird von vielen Faktoren beeinflusst, so dass eine Aussage über die Spermaqualität bei einer guten Befruchtung möglich ist, bei einer schlechten Fertilität aber nicht zwingend eine schlechte Spermaqualität ursächlich verantwortlich sein muss. Zudem ist der notwendige Embryotransfer ebenfalls eine Technik,

(34)

die nicht immer zuverlässig funktioniert. Aus diesen Gründen ist eine alternative Untersuchungsmethode für die Spermaqualität sinnvoll.

Zur Beurteilung der Spermaqualität wurden bisher folgende Parameter als relevant angesehen:

• Motilität

• Spermatozoenkonzentration

• Plasmamembranintegrität

Die Parameter Motilität und Spermatozoenkonzentration können mikroskopisch beurteilt werden, wobei objektive Auswertungen der subjektiven Betrachtung und Klassifizierung vorzuziehen sind. Die Parameter Spermatozoenkonzentration und Plasmamembranintegrität können durch Färbung mit geeigneten Farbstoffen dargestellt werden (WALTERS et al.

2005).

2.6. Physikalische Grundlagen der Fluoreszenzmikroskopie

Bei der Fluoreszenzmikroskopie müssen die Eigenschaften und das Zusammenspiel der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe, sowie eine mögliche Autofluoreszenz der Proben berücksichtigt werden, da nur so auswertbare Ergebnisse zu erzielen sind. Dies kann nur gelingen, wenn die physikalischen Eigenschaften von Licht und dessen Interaktion mit der Materie näher betrachtet werden.

2.6.1. Lumineszenz und Fluoreszenz

Unter dem Phänomen der Lumineszenz versteht man die Interaktion zwischen Licht und Materie, wobei die Materie die im Licht vorhandene Energie absorbiert, um diese kurze Zeit später wiederum als Licht abzugeben.

Zum Verständnis dieses Prozesses ist es wichtig, die physikalischen Eigenschaften des Lichtes zu kennen. Licht ist eine elektromagnetische Welle und verfügt somit über eine Wellenlänge λ, sowie eine Frequenz ν, welche über die Lichtgeschwindigkeit c in Beziehung zueinander stehen.

Es gilt:

ν = c / λ

c = 3*1010 cm/sec (Lichtgeschwindigkeit)

(35)

Wenn Licht auf Materie trifft, kann es durch diese ungehindert transmittieren, reflektiert werden oder es wird teilweise oder vollständig von der Materie absorbiert. Wird Licht absorbiert, nimmt die Materie die Energie E aus dem Licht auf. Auch diese Energie steht im Zusammenhang mit der Wellenlänge des Lichtes.

Es gilt:

E = h×ν = h×c/λ

h = 6,62×10-34 Js (Planckkonstante)

Durch die so aufgenommene Energie wird ein Molekül auf ein höheres, aber instabiles Energieniveau angehoben. Fällt es auf sein ursprüngliches, stabiles Energieniveau zurück, so wird die freiwerdende Energie teilweise als Licht abgegeben. Diese Lichtemission wird als Lumineszenz bezeichnet. Das emittierte Licht hat weniger Energie als das absorbierte und somit eine höhere Wellenlänge. Die Verschiebung der Wellenlänge zwischen Exzitation und Emission wird als Stock-Shift bezeichnet (GUILBAULT 1973). Dieser Vorgang ist von der Chemilumineszenz zu unterscheiden, welche ihre Erregungsenergie aus einer chemischen Reaktion bezieht (HERMAN 1998).

Abb. 5: Fluoreszenz

Stock-Shift am Beispiel von Exzitation und Emission des Fluoreszenzfarbstoffs Propidiumiodid gebunden an dsDNA (MOLECULAR PROBES; Inc. 1999)

Stock-Shift

Wellenlänge (nm) Exzitation Emission

(36)

Es gibt zwei unterschiedliche Arten von Lumineszenz: Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Von Fluoreszenz wird gesprochen, wenn die Emission von Licht aufhört, sobald die anregende Lichtquelle abgeschaltet wird. Bei der Phosphoreszenz bleib im Gegensatz hierzu die Emission auch nach dem Verlöschen der Lichtquelle erhalten (GERLACH 2009).

Fluoreszenz benötigt somit immer eine Energie- bzw. Lichtquelle von außen, so dass Licht von der Materie absorbiert und als Fluoreszenz wieder emittiert wird. Bei der Fluoreszenz wird zwischen einer Primär- bzw. Autofluoreszenz, bei der Moleküle von sich aus fluoreszieren, und einer Sekundärfluoreszenz, die durch Färbung mit fluoreszierenden Agenzien entsteht, unterschieden (GUILBAULT 1973).

2.6.2. Fluoreszenzmikroskopie

Voraussetzung für den Bau von Mikroskopen war die Entwicklung von Linsen, die im 13.

Jahrhundert erstmals in Form von Brillen genutzt wurden. Im 16. Jahrhundert wurden durch Kombination unterschiedlicher Linsen zunächst das Fernrohr und später die ersten Lichtmikroskope entwickelt (GERLACH 2009).

Anfang des 20. Jahrhunderts wurden UV-Mikroskope zur Verbesserung der Auflösung hergestellt. Die durch das UV-Licht ausgelöste Fluoreszenz galt als Störfaktor, bis ihr Nutzen als eigenständige Untersuchungsmethode erkannt wurde. Limitiert wurde diese am Anfang durch die Notwendigkeit von Proben mit einer Autofluoreszenz. Erst mit der Entdeckung und Nutzung der Fluoreszenzfarbstoffe begann der große Aufschwung der Fluoreszenzmikroskopie (GERLACH 2009), die heute in vielen Bereichen der Forschung und Diagnostik unverzichtbar ist. Die Herausforderungen bei der Fluoreszenztechnik sind einerseits die exakte Beleuchtung und somit Anregung der Probe und andererseits die Trennung des schwachen Emissionssignals vom viel stärkeren Exzitationssignal. Dies wird meistens durch den Einsatz von Prismen und Filtersystemen erreicht (HERMAN 1998).

Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie ist es möglich, sehr kleine Materialmengen mit einer hohen Spezifität und Sensitivität nachzuweisen. Es wird zudem eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung erreicht und auch quantitative Messungen sind möglich (HERMAN 1998). Der größte Unsicherheitsfaktor in der Fluoreszenzmikroskopie sind Hintergrundsignale, welche in hohem Maße durch die Fluoreszenz selbst und den Eigenschaften der Fluoreszenzfarbstoffe beeinflusst werden (HERMAN u. WANG 1996).

(37)

Zur Exzitation der Probe stehen zwei verschiedene Lichtquellen zur Verfügung: Laser oder UV-Lampen in Kombination mit Filtersystemen. Welche Lichtquelle sich für welches Experiment eignet, ist abhängig von den benötigten Wellenlängen, den verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen und dem Versuchsaufbau. Durch Laser wird ein monochromatisches Licht mit einer hohen Intensität freigesetzt. Nachteilig ist allerdings, dass für jeden Farbstoff ein anderer Laser benötigt wird. Die Alternative sind UV-Lampen, welche Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren und durch Filtersysteme auf bestimmte Wellenlängenbereiche reduziert werden können (HERMAN 1998). Ihr Vorteil ist, dass eine Lichtquelle für unterschiedliche Fluoreszenzen ausreicht.

Durch automatisierte Aufnahmesysteme ist es möglich, komplexe Versuche an lebenden Zellen oder Geweben durchzuführen, wobei eine große Menge an Daten produziert, gespeichert und später analysiert werden kann (HERMAN u. WANG 1996).

Die mikroskopische Aufnahme von Spermatozoen ist eine Herausforderung, da diese besondere Zellen sind. Ihre einzigartigen Eigenschaften müssen bei der Färbung und Mikroskopie beachtet werden. Spermatozoen sind motil, dies kann einerseits als Beurteilungsparameter herangezogen werden, andererseits wird die Mikroskopie hierdurch erheblich erschwert. Nur durch eine alternierende Aufnahme einzelner Gesichtsfelder mit verschiedenen Fluoreszenzkanäle wird ein Vergleich mehrerer Färbungen möglich.

Mindestens zwei Fluoreszenzkanäle werden zur Differenzierung der lebenden von den toten Spermatozoen benötigt. Würde erst die gesamte Region in einem Kanal und anschließend in einem zweiten Kanal aufgenommen, so wäre eine Zuordnung der Spermatozoen nicht mehr gegeben, da diese in der Zwischenzeit ihre Position geändert hätten. Durch die Aufnahme der beiden Fluoreszenzkanäle direkt nacheinander von jedem einzelnen Gesichtsfeld wird dies vermieden. Zudem besitzen Spermatozoen im Gegensatz zu anderen Zellen nur geringe Mengen an Zytoplasma, sie bestehen vorwiegen aus dem Zellkern und Schwanz. Zum Färben von Spermatozoen kommen somit vor allem Farbstoffe, die im Zellkern binden, in Frage.

2.6.3. Fluoreszenzfarbstoffe

Nicht fluoreszenzfähige Objekte können mit Hilfe fluoreszierender Farbstoffe angefärbt und zur Fluoreszenz gebracht werden. Dieser Vorgang wird als Fluorochromierung bezeichnet (GERLACH 2009). Ein fluoreszierendes Molekül kann wiederholt zur Fluoreszenz angeregt werden. Bei Fluoresceinisothiocyanat zum Beispiel ist dies rund 30000mal nacheinander

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möglich, bevor es durch Prozesse im Exzitationsstadium ausbleicht (HERMAN 1998). Dieser auch als Photobleaching bezeichnete Prozess des graduellen und endgültigen Verlustes der Fluoreszenz ist abhängig von der Belichtungszeit und dem verwendeten Fluorochrom (HERMAN u. WANG 1996).

Zur Bestimmung, ob eine Zelle lebt oder tot ist, stehen verschiedene Parameter zur Verfügung. Es können Stoffwechselprodukte gemessen werden, welche eine Aussage über die Aktivität der Zellen liefern oder es kann die Permeabilität der Zellmembran getestet werden.

Die Membranintegrität ist bei toten Zellen nicht mehr gegeben.

Fluoresceindiacetat:

Fluoresceindiacetat (FDA) ist ein Fluoreszenzfarbstoff für lebende Zellen, der sowohl die Stoffwechselaktivität einer Zelle als auch ihre Membranpermeabilität erfasst. Durch unspezifische Esterasen wird FDA in stoffwechselaktiven Zellen zu Fluorescein umgewandelt, welches die Zelle durch eine intakte Zellmembran nicht verlassen kann und somit im Zytoplasma akkumuliert (INVITROGEN 2008). Das Absorptionsmaximum von Fluorescein liegt im blauen Farbbereich bei 485 nm und das Emissionsmaximum bei 514 nm im grünen Farbbereich.

Hoechst 33342:

Hoechst 33342 ist ein Farbstoff, der an die DNA bindet und sowohl lebende als auch tote Zellen färbt. Der Farbstoff bindet an mindestens drei aufeinander folgende A-T-Basenpaare.

Die Exzitation beträgt 350 nm und liegt somit im ultravioletten Bereich. Die Emission liegt mit 461 nm im blauen Farbbereich (INVITROGEN 2005).

Ethidiumbromid:

Ethidiumbromid (EtBr) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der nur eine defekte Zellmembran penetrieren kann und somit durch Interkalierung mit DNA tote Zellen färbt. Bei einer Wellenlänge von 254 nm wird die Energie von der DNA aufgenommen und an EtBr übertragen, so dass dieses fluoresziert. Eine Anregung mit Licht der Wellenlänge 366 nm regt den Farbstoff direkt zur Fluoreszenz an. Die Emission liegt mit 605 nm im roten Farbspektrum (SAMBROOK u. RUSSELL 2001).

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