2. Literatur
2.6. Physikalische Grundlagen der Fluoreszenzmikroskopie
Bei der Fluoreszenzmikroskopie müssen die Eigenschaften und das Zusammenspiel der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe, sowie eine mögliche Autofluoreszenz der Proben berücksichtigt werden, da nur so auswertbare Ergebnisse zu erzielen sind. Dies kann nur gelingen, wenn die physikalischen Eigenschaften von Licht und dessen Interaktion mit der Materie näher betrachtet werden.
2.6.1. Lumineszenz und Fluoreszenz
Unter dem Phänomen der Lumineszenz versteht man die Interaktion zwischen Licht und Materie, wobei die Materie die im Licht vorhandene Energie absorbiert, um diese kurze Zeit später wiederum als Licht abzugeben.
Zum Verständnis dieses Prozesses ist es wichtig, die physikalischen Eigenschaften des Lichtes zu kennen. Licht ist eine elektromagnetische Welle und verfügt somit über eine Wellenlänge λ, sowie eine Frequenz ν, welche über die Lichtgeschwindigkeit c in Beziehung zueinander stehen.
Es gilt:
ν = c / λ
c = 3*1010 cm/sec (Lichtgeschwindigkeit)
Wenn Licht auf Materie trifft, kann es durch diese ungehindert transmittieren, reflektiert werden oder es wird teilweise oder vollständig von der Materie absorbiert. Wird Licht absorbiert, nimmt die Materie die Energie E aus dem Licht auf. Auch diese Energie steht im Zusammenhang mit der Wellenlänge des Lichtes.
Es gilt:
E = h×ν = h×c/λ
h = 6,62×10-34 Js (Planckkonstante)
Durch die so aufgenommene Energie wird ein Molekül auf ein höheres, aber instabiles Energieniveau angehoben. Fällt es auf sein ursprüngliches, stabiles Energieniveau zurück, so wird die freiwerdende Energie teilweise als Licht abgegeben. Diese Lichtemission wird als Lumineszenz bezeichnet. Das emittierte Licht hat weniger Energie als das absorbierte und somit eine höhere Wellenlänge. Die Verschiebung der Wellenlänge zwischen Exzitation und Emission wird als Stock-Shift bezeichnet (GUILBAULT 1973). Dieser Vorgang ist von der Chemilumineszenz zu unterscheiden, welche ihre Erregungsenergie aus einer chemischen Reaktion bezieht (HERMAN 1998).
Abb. 5: Fluoreszenz
Stock-Shift am Beispiel von Exzitation und Emission des Fluoreszenzfarbstoffs Propidiumiodid gebunden an dsDNA (MOLECULAR PROBES; Inc. 1999)
Stock-Shift
Wellenlänge (nm) Exzitation Emission
Es gibt zwei unterschiedliche Arten von Lumineszenz: Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Von Fluoreszenz wird gesprochen, wenn die Emission von Licht aufhört, sobald die anregende Lichtquelle abgeschaltet wird. Bei der Phosphoreszenz bleib im Gegensatz hierzu die Emission auch nach dem Verlöschen der Lichtquelle erhalten (GERLACH 2009).
Fluoreszenz benötigt somit immer eine Energie- bzw. Lichtquelle von außen, so dass Licht von der Materie absorbiert und als Fluoreszenz wieder emittiert wird. Bei der Fluoreszenz wird zwischen einer Primär- bzw. Autofluoreszenz, bei der Moleküle von sich aus fluoreszieren, und einer Sekundärfluoreszenz, die durch Färbung mit fluoreszierenden Agenzien entsteht, unterschieden (GUILBAULT 1973).
2.6.2. Fluoreszenzmikroskopie
Voraussetzung für den Bau von Mikroskopen war die Entwicklung von Linsen, die im 13.
Jahrhundert erstmals in Form von Brillen genutzt wurden. Im 16. Jahrhundert wurden durch Kombination unterschiedlicher Linsen zunächst das Fernrohr und später die ersten Lichtmikroskope entwickelt (GERLACH 2009).
Anfang des 20. Jahrhunderts wurden UV-Mikroskope zur Verbesserung der Auflösung hergestellt. Die durch das UV-Licht ausgelöste Fluoreszenz galt als Störfaktor, bis ihr Nutzen als eigenständige Untersuchungsmethode erkannt wurde. Limitiert wurde diese am Anfang durch die Notwendigkeit von Proben mit einer Autofluoreszenz. Erst mit der Entdeckung und Nutzung der Fluoreszenzfarbstoffe begann der große Aufschwung der Fluoreszenzmikroskopie (GERLACH 2009), die heute in vielen Bereichen der Forschung und Diagnostik unverzichtbar ist. Die Herausforderungen bei der Fluoreszenztechnik sind einerseits die exakte Beleuchtung und somit Anregung der Probe und andererseits die Trennung des schwachen Emissionssignals vom viel stärkeren Exzitationssignal. Dies wird meistens durch den Einsatz von Prismen und Filtersystemen erreicht (HERMAN 1998).
Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie ist es möglich, sehr kleine Materialmengen mit einer hohen Spezifität und Sensitivität nachzuweisen. Es wird zudem eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung erreicht und auch quantitative Messungen sind möglich (HERMAN 1998). Der größte Unsicherheitsfaktor in der Fluoreszenzmikroskopie sind Hintergrundsignale, welche in hohem Maße durch die Fluoreszenz selbst und den Eigenschaften der Fluoreszenzfarbstoffe beeinflusst werden (HERMAN u. WANG 1996).
Zur Exzitation der Probe stehen zwei verschiedene Lichtquellen zur Verfügung: Laser oder UV-Lampen in Kombination mit Filtersystemen. Welche Lichtquelle sich für welches Experiment eignet, ist abhängig von den benötigten Wellenlängen, den verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen und dem Versuchsaufbau. Durch Laser wird ein monochromatisches Licht mit einer hohen Intensität freigesetzt. Nachteilig ist allerdings, dass für jeden Farbstoff ein anderer Laser benötigt wird. Die Alternative sind UV-Lampen, welche Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren und durch Filtersysteme auf bestimmte Wellenlängenbereiche reduziert werden können (HERMAN 1998). Ihr Vorteil ist, dass eine Lichtquelle für unterschiedliche Fluoreszenzen ausreicht.
Durch automatisierte Aufnahmesysteme ist es möglich, komplexe Versuche an lebenden Zellen oder Geweben durchzuführen, wobei eine große Menge an Daten produziert, gespeichert und später analysiert werden kann (HERMAN u. WANG 1996).
Die mikroskopische Aufnahme von Spermatozoen ist eine Herausforderung, da diese besondere Zellen sind. Ihre einzigartigen Eigenschaften müssen bei der Färbung und Mikroskopie beachtet werden. Spermatozoen sind motil, dies kann einerseits als Beurteilungsparameter herangezogen werden, andererseits wird die Mikroskopie hierdurch erheblich erschwert. Nur durch eine alternierende Aufnahme einzelner Gesichtsfelder mit verschiedenen Fluoreszenzkanäle wird ein Vergleich mehrerer Färbungen möglich.
Mindestens zwei Fluoreszenzkanäle werden zur Differenzierung der lebenden von den toten Spermatozoen benötigt. Würde erst die gesamte Region in einem Kanal und anschließend in einem zweiten Kanal aufgenommen, so wäre eine Zuordnung der Spermatozoen nicht mehr gegeben, da diese in der Zwischenzeit ihre Position geändert hätten. Durch die Aufnahme der beiden Fluoreszenzkanäle direkt nacheinander von jedem einzelnen Gesichtsfeld wird dies vermieden. Zudem besitzen Spermatozoen im Gegensatz zu anderen Zellen nur geringe Mengen an Zytoplasma, sie bestehen vorwiegen aus dem Zellkern und Schwanz. Zum Färben von Spermatozoen kommen somit vor allem Farbstoffe, die im Zellkern binden, in Frage.
2.6.3. Fluoreszenzfarbstoffe
Nicht fluoreszenzfähige Objekte können mit Hilfe fluoreszierender Farbstoffe angefärbt und zur Fluoreszenz gebracht werden. Dieser Vorgang wird als Fluorochromierung bezeichnet (GERLACH 2009). Ein fluoreszierendes Molekül kann wiederholt zur Fluoreszenz angeregt werden. Bei Fluoresceinisothiocyanat zum Beispiel ist dies rund 30000mal nacheinander
möglich, bevor es durch Prozesse im Exzitationsstadium ausbleicht (HERMAN 1998). Dieser auch als Photobleaching bezeichnete Prozess des graduellen und endgültigen Verlustes der Fluoreszenz ist abhängig von der Belichtungszeit und dem verwendeten Fluorochrom (HERMAN u. WANG 1996).
Zur Bestimmung, ob eine Zelle lebt oder tot ist, stehen verschiedene Parameter zur Verfügung. Es können Stoffwechselprodukte gemessen werden, welche eine Aussage über die Aktivität der Zellen liefern oder es kann die Permeabilität der Zellmembran getestet werden.
Die Membranintegrität ist bei toten Zellen nicht mehr gegeben.
Fluoresceindiacetat:
Fluoresceindiacetat (FDA) ist ein Fluoreszenzfarbstoff für lebende Zellen, der sowohl die Stoffwechselaktivität einer Zelle als auch ihre Membranpermeabilität erfasst. Durch unspezifische Esterasen wird FDA in stoffwechselaktiven Zellen zu Fluorescein umgewandelt, welches die Zelle durch eine intakte Zellmembran nicht verlassen kann und somit im Zytoplasma akkumuliert (INVITROGEN 2008). Das Absorptionsmaximum von Fluorescein liegt im blauen Farbbereich bei 485 nm und das Emissionsmaximum bei 514 nm im grünen Farbbereich.
Hoechst 33342:
Hoechst 33342 ist ein Farbstoff, der an die DNA bindet und sowohl lebende als auch tote Zellen färbt. Der Farbstoff bindet an mindestens drei aufeinander folgende A-T-Basenpaare.
Die Exzitation beträgt 350 nm und liegt somit im ultravioletten Bereich. Die Emission liegt mit 461 nm im blauen Farbbereich (INVITROGEN 2005).
Ethidiumbromid:
Ethidiumbromid (EtBr) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der nur eine defekte Zellmembran penetrieren kann und somit durch Interkalierung mit DNA tote Zellen färbt. Bei einer Wellenlänge von 254 nm wird die Energie von der DNA aufgenommen und an EtBr übertragen, so dass dieses fluoresziert. Eine Anregung mit Licht der Wellenlänge 366 nm regt den Farbstoff direkt zur Fluoreszenz an. Die Emission liegt mit 605 nm im roten Farbspektrum (SAMBROOK u. RUSSELL 2001).
Propidiumiodid:
Propidiumiodid (PI) bindet sowohl an DNA als auch an RNA, wobei es keine oder nur eine geringe sequenzabhängige Bindung an die DNA bzw. RNA zeigt. Die Membran von lebenden Zellen ist impermeabel für Propidiumiodid. Erst nach dem Zelltod kann es die nicht mehr funktionstüchtige Membran passieren und somit tote Zellen färben. Für Propidiumiodid liegt die Exzitation bei 536 nm im grünen Farbbereich und die Emission bei 617 nm im roten Farbbereich (MOLECULAR PROBES; Inc. 1999).