Revitalisierung (transgener) Linien mit Hilfe kryokonservierter Spermatozoen

• Auftauen / Rehydrieren der Probe

• in vitro-Fertilisation

• Embryotransfer und nachfolgende Trächtigkeit

• Wurf und Aufzucht der Jungtiere

Um eine neue Zucht aufzubauen reicht theoretisch eine adulte und fertile Maus, die das Transgen trägt.

Auftauen der Spermatozoen:

Für das Auftauen von Spermatozoen ist eine hohe Auftaugeschwindigkeit am Besten geeignet. Allerdings hat die Einfriergeschwindigkeit einen größeren Einfluss auf die Qualität der Spermatozoen als die Auftaugeschwindigkeit (STACY et al. 2006).

in vitro-Fertilisation:

Die erste erfolgreiche Befruchtung von Eizellen bei Mäusen in vitro wurde von WHITTINGHAM (1968) durchgeführt. Erst ab 1990 war jedoch eine Kryokonservierung von Mausspermatozoen möglich (TADA et al.1990) und die Notwendigkeit einer erfolgreichen in vitro-Fertilisation mit eingefrorenen, eingelagerten und wieder aufgetauten Spermatozoen gegeben. Ohne eine verlässliche in vitro-Fertilisation mit nachfolgendem Embryotransfer wäre ein Einfrieren und Lagern von Spermatozoen nicht sinnvoll, da nur lebende Mäuse wieder nutzbar sind. Um dies zu erreichen, müssen viele unterschiedliche Faktoren aufeinander abgestimmt werden und optimal ineinandergreifen. Eine gute Spermaqualität ist nicht der einzige beeinflussende Faktor für eine gute Fertilität in der IVF. Auch die Qualität der Eizellen, die Einstellungen des Brutschrankes, die Medien und der genetische Hintergrund haben einen erheblichen Einfluss auf die Befruchtungsrate in der in vitro-Fertilisation. Ob eine IVF zu epigenetischen Effekten führt, welche nicht von der Gensequenz abhängig sind, sondern über das An- bzw. Abschalten vorhandener Gene den Phänotyp beeinflussen, wird kontrovers diskutiert. Im Vergleich zwischen der Genexpression in vivo und in vitro zeigen einige Proteine wie z.B. IGF-1 Ligand unterschiedliche Konzentrationen, während andere wie z.B. TGFα keine Unterschiede aufweisen (STOJANOV u. O´NEILL 2001). Bei Rindern und

Schweinen tritt bei in vitro produzierten bzw. geklonten und transferierten Embryonen eine erhöhte Resorptionsrate im Vergleich zu künstlicher Befruchtung und Embryotransfer auf.

Zudem ist die Tragzeit verlängert, es gibt vermehrt Schwergeburten und die Jungtiere haben ein höheres Geburtsgewicht sowie vermehrt Fehlbildungen (KRUIP u. DEN DAAS 1997).

Embryotransfer:

Ohne den Embryotransfer wären nicht nur die Kryokonservierung von Spermatozoen, sondern auch die von Embryonen unmöglich, ebenso wie die Generierung transgener Tiere.

Diese Technik spielt somit eine zentrale Rolle in der Generierung, Sanierung und Sicherung transgener Mäuse. Es gibt zwei unterschiedliche Methoden der Durchführung eines Embryotransfers: Die Embryonen können über das Infundibulum in den Eileiter transferiert werden (Eileitertransfer) oder über eine Kanüle direkt in den Uterus appliziert werden (Uterustransfer). Der erste erfolgreiche Uterustransfer von Embryonen wurde von McLAREN und BIGGERS (1958) durchgeführt. Ein Jahr später wurde der Eileitertransfer erstmals beschrieben (TARKOWSKI 1959). Das heute angewendete Protokoll für einen Eileitertransfer hat WHITTINGHAM (1968) aus einem Transferprotokoll für Ratten (NOYES und DICKMAN 1961) abgeleitet. Um einen Embryotransfer erfolgreich durchzuführen, d.h.

damit eine Maus trächtig wird, müssen zwei Voraussetzungen erfüllt sein: Erstens müssen scheinträchtige Ammen zur Verfügung stehen und zweitens sollte das Stadium der Scheinträchtigkeit annähernd mit dem Entwicklungsstadium der Embryonen übereinstimmen.

Scheinträchtige Ammen werden durch die gezielte Verpaarung mit vasektomierten, d.h.

deckfähigen, aber infertilen männlichen Tieren generiert. Der Eileitertransfer eignet sich somit am besten für zwei- bis achtzellige Embryonen, wobei Ammen am Tag 0,5 nach der Verpaarung hierfür zu bevorzugen sind. Der Uterustransfer ist für den Transfer von Blastozysten gut geeignet, wobei Ammen am Tag 3,5 nach der Verpaarung mit einem vasektomierten Tier am besten geeignet sind, da in diesem Fall die Entwicklung der Embryonen mit dem Trächtigkeitsstadium der scheinträchtigen Amme korreliert (NAGY et al. 2003).

Wurf und Aufzucht der Jungtiere:

Um eine ungestörte Geburt lebender Jungtiere nach einem Embryotransfer und Trächtigkeit zu sichern, sollten die Ammen möglichst ruhig und unter optimalen Umweltbedingungen gehalten werden, da Stress zu einer Beeinträchtigung der Reproduktionsleistung führen kann (MOBERG 1991). Durch Lärm oder ein nicht optimales Raumklima kann die Resorption der Embryonen bzw. Kannibalismus der Jungtiere nach dem Wurf ausgelöst werden. Auch eine an den erhöhten Energiebedarf angepasste Fütterung der Tiere ist für eine erfolgreiche Aufzucht notwendig (NAGY et al. 2003, GESELLSCHAFT FÜR VERSUCHSTIERKUNDE; SOCIETY FOR LABORATORY ANIMAL SCIENCE 2003).

Da eine Amme kleine Würfe manchmal nicht annimmt bzw. aufgrund einer verlängerten Trächtigkeit bei kleinen Würfen ein Kaiserschnitt notwendig werden kann, kann parallel zum Embryotransfer eine Verpaarung von Wildtyp-Tieren durchgeführt werden. Diese verpaarte Maus wirft dann zum selben Zeitpunkt wie die Amme. Ihr können die wertvollen transgenen Jungtiere untergelegt werden, wenn eine Aufzucht durch die eigentliche Amme nicht möglich sein sollte (NAGY et al. 2003).

2.3.1 Qualitätssicherung kryokonservierter Spermatozoen

Nur nach einer Kontrolle der Qualität kryokonservierter Spermatozoen bzw. Embryonen kann die Erhaltungszucht einer transgenen Linie beendet werden. Da die Spermaqualität ein individueller Parameter ist und zwischen Tieren derselben Linie schwanken kann, ist es notwendig, eine Probe von jedem Spendertier zu untersuchen (WOODS et al. 2004). Durch die hohe Anzahl an parallelen Proben pro Tier ist es problemlos möglich, eine von ihnen für die Qualitätskontrolle zu nutzen. So kann beurteilt werden, ob zusätzliche Spendertiere benötigt werden oder bereits eine ausreichende Sicherung der jeweiligen Linie erreicht wurde.

Die beiden Parameter für die Qualitätssicherung sind die Fertilität in der in vitro-Fertilisation und die Motilität der Spermatozoen. Der momentane Goldstandard ist die IVF. Auch wenn die Motilität als Beurteilungsparameter bestimmt wird, ist die Fertilität in der IVF zusätzlich und als Vergleichsparameter untersucht worden (TADA et al. 1990, SZTEIN et al. 1997, SZTEIN et al. 2000, OSTERMEIER et al. 2008). Die Spermienmotilität zeigt keine besonders gute Übereinstimmung mit der Fertilität in der IVF (THE JACKSON LABORATORY, 2008). Nur die Durchführung einer IVF erlaubt eine definitive Aussage über die

Befruchtungsfähigkeit der kryokonservierten Spermatozoen. Den stärksten Beweis für die mögliche Revitalisierung transgener Linien über kryokonservierte Spermatozoen stellen jedoch lebend geborene Jungtiere aus einem Transfer mit Embryonen aus einer in vitro-Fertilisation dar (THE JACKSON LABORATORY, 2008). Es muss bedacht werden, dass sowohl die in vitro-Fertilisation als auch der Embryotransfer sensible und komplexe Techniken sind, welche nicht immer zuverlässig funktionieren.

Voraussetzung für eine erfolgreiche IVF mit nachfolgendem ET ist das Verständnis des physiologischen Sexualzyklus sowie dessen Beeinflussung mit Hormonen zur Superovulation und die Physiologie der Gravidität, um scheinträchtige Ammen für den Embryotransfer zu generieren.