Versuchsteil II: Untersuchungen zur Expansion der T reg -Zellen während der frühen Schwangerschaft

3.2.2.1 Verpaarung der Mäuse

Weibliche, zwei Monate alte Mäuse, wurden mit zwei bis vier Monate alten Mäusemännchen ver-schiedener Mausstämme verpaart. Die Mäuse wurden zwei Mal täglich (morgens und abends) auf das Auftreten eines Vaginalpfropfens kontrolliert. Das Auftreten des Vaginalpfropfens kennzeichnet Tag

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Null der Schwangerschaft. Entsprechend des experimentellen Ansatzes wurden die Mäuseweibchen an verschiedenen Schwangerschaftstagen getötet und Gewebeproben entnommen.

3.2.2.2 Bestimmung des Einflusses von Bestandteilen des Ejakulats auf die Expansion von T

-Zellen

CBA/J-Weibchen wurden entweder mit intakten BALB/c-, vasektomierten BALB/c- (ohne Spermien) oder samenblasendefizienten BALB/c-Männchen (ohne Samenblasenflüssigkeit) verpaart (Abb. 14).

Auf Grund des fehlenden Vaginalpfropfens bei der Verpaarung mit samenblasendefizienten BALB/c-Männchen wurde der erste Schwangerschaftstag (Tag 0) durch das Auftreten von Spermien festgelegt.

Hierfür wurde zur Gewinnung von Vaginalflüssigkeit bei den Mäuseweibchen täglich eine Vaginalspü-lung vorgenommen (siehe 3.2.1.1). Die Präsenz der Spermien in der Vaginalfüssigkeit wurde mittels Durchlichtmikroskopie nachgewiesen. Die Schwangerschaft wurde zudem durch den Anstieg an Pro-gesteron verifiziert (siehe 3.2.2.7.1). Die Mäuseweibchen wurden an den Schwangerschaftstagen 0,5;

2 oder 5 getötet. Thymus, Milz, paraaortische Lymphknoten und Blut wurden entnommen. Lymphozy-ten wurden aus allen Organen isoliert und wie unter 3.2.4.16.1 erläutert gefärbt. Die Anzahl an Foxp3⁺-Zellen und CD4⁺Foxp3⁺-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt.

CBA/J BALB/c

(intakt)

(samenblasendefizient) (vasektomiert) x

Tötung und Organentnahme an Schwangerschaftstagen 0,5; 2 und 5

Durchflusszytometrie RT-PCR

x

x

Abb. 14: Schematische Darstellung der Mausverpaarungen zur Untersuchung des Einflusses des Ejaku-lats auf die Expansion der Treg-Zellen. CBA/J-Weibchen wurden mit intakten, vasektomierten oder samenbla-sendefizienten BALB/c-Männchen verpaart. Die schwangeren Mäuseweibchen wurden an den Schwanger-schaftstagen 0,5; 2 oder 5 getötet und die Anzahl an Foxp3⁺-Zellen und CD4⁺Foxp3⁺-Zellen im Thymus, in der Milz, in den lokalen Lymphknoten und im Blut mittels Durchflusszytometrie bestimmt.

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3.2.2.3 Gewinnung von Samenblasenflüssigkeit

Zur Gewinnung von Samenblasenflüssigkeit (SBF) wurde der Abdominalbereich von BALB/c- oder C57BL/6-Männchen unter sterilen Bedingungen eröffnet (siehe 3.2.4.3). Die Samenblasen wurden entnommen, in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und in diesem zerkleinert. Nach Zugabe von 400 µl sterilem PBS wurde die SBF bei 1000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Hierbei wurde die proteinhaltige SBF von Geweberesten getrennt. Der Überstand wurde in ein neues steriles 1,5 ml Re-aktionsgefäß überführt und ein weiteres Mal bei 9000 rpm für 1 Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und die darin enthaltene Menge an Protein bestimmt.

3.2.2.4 Proteinkonzentrationsbestimmung in der Samenblasenflüssigkeit

Die Bestimmung der Proteinkonzentration in der SBF wurde mit dem BioRad Protein Assay durchge-führt. Für die Standardreihe wurde eine BSA-Stocklösung in einer Konzentration von 1 mg/ml herge stellt. Ausgehend von dieser Stocklösung wurden folgende Verdünnungen angefertigt: 0,5; 0,25; 0,1;

0,05; 0,025 und 0,01 mg/ml. Die BioRad-Lösung wurde 1/5 vorverdünnt. Jeweils 20 µl der Probe und der Standardverdünnungen wurden mit 400 µl vorverdünnter BioRad-Lösung versetzt. Je 210 µl jedes Gemisches wurden dann auf eine 96-Lochplatte als Doppelbestimmung gegeben und im Mikrotiter- plattenleser bei 595 nm vermessen. Die Berechnung der Proteinkonzentration der Probe ergab sich aus folgender Gleichung:

Die Proteinkonzentration in der SBF betrug zwischen 6 – 8 mg/ml.

3.2.2.5

-Zellen und T-Effektorzellen mit Samenblasenflüssigkeit oder rekombinanten Molekülen

Nach Isolierung von Treg-Zellen und CD4⁺CD25^- T-Zellen aus einem Gemisch von Milz und Thymus (siehe 3.2.4.7) wurden beide Zellpopulationen mit CFDA-SE gefärbt (siehe 3.2.4.11). Nach der Fär-bung wurden die Zellen in FKS- und P/S-haltigem RPMI-Medium aufgenommen und die SBF in zwei Konzentrationen (140 ng/ml Protein bzw. 70 ng/ml Protein) zugesetzt. Als Kontrolle wurden die Zel-len in Kulturmedium ohne SBF kultiviert. Darüber hinaus wurden die ZelZel-len unter Zugabe von re-kombinantem TGF-β1 (10 ng/ml oder 20 ng/ml) kultiviert. Entsprechende Ansätze wurden für 0, 24

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und 48 Stunden als Doppelbestimmungen angesetzt. Zur Stimulation der Proliferation wurde dem Medium IL-2 in einer Konzentration von 10 ng/ml zugesetzt. Die Proliferation der Treg-Zellen und CD4⁺CD25^- T-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt.

3.2.2.6 Gewinnung von Blutplasma für die Bestimmung des Progesterongehaltes

Die Blutproben wurden bei 7000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Die Zentrifugation bewirkte ein Absinken aller zellulären Bestandteile, wobei im oberen Bereich des Probengefäßes das Blutplasma als klarer Überstand verblieb. Das Blutplasma wurde vorsichtig abgenommen und in ein neues Pro-bengefäß überführt. Die Proben wurden bis zur Progesteronbestimmung mittels Chemilumineszenz bei -80 °C gelagert.

3.2.2.7 Chemilumineszenz Immunoassay (CLIA)

Bei dieser Methode handelt es sich um ein kompetitives Immunoassay bei dem das Antigen (Progeste-ron) der Probe mit dem Enzym-markierten Antigen des Kits um eine begrenzte Anzahl an AK-Bindungsstellen auf der Mikrotiterplatte konkurriert. Die Menge an Enzym-markiertem Antigen wird dann mittels Chemilumineszenz nach Umsetzen des Substrates durch das Enzym gemessen. Der Messwert ist dabei invers proportional zu der unbekannten Antigenkonzentration der Probe. Das ergibt sich aus der Überlegung, dass je mehr Enzym-markiertes Antigen binden konnte, umso weniger un-markiertes Antigen in der Probe enthalten war.

3.2.2.7.1 Progesteronbestimmung mittels Lumineszenz

Blutplasmaproben von CBA/J-Weibchen, welche mit samenblasendefizienten BALB/c-Männchen verpaart worden waren, wurden zur Absicherung einer bestehenden Schwangerschaft auf ihren Proges-terongehalt untersucht. Nach Eintreten einer Schwangerschaft steigt die Progesteronkonzentration im Blutplasma an. Die Bestimmung des Progesterongehaltes wurde unter Verwendung des Progesteron LIA Kits vorgenommen. Nachdem die Plasmaproben auf Eis aufgetaut waren, wurden jeweils 25 µl der Proben, einer Positivkontrolle und der Kalibratoren (Standardkurve) in je ein Loch einer 96-Lochplatte gegeben. Alle Proben, Kontrollen und Kalibratoren wurden als Doppelbestimmungen ermittelt. In jedes Loch wurden 100 µl Meerrettich-Peroxidaselösung (1/100 vorverdünnt in Assaypuf-fer) mit einer Multikanalpipette gegeben. Es folgte eine Inkubation von 1 Stunde auf einem Schüttler (~200 rpm) bei RT. Nach der Inkubation wurde die 96-Lochplatte fünf Mal mit je 300 µl Waschpuffer (1/10 vorverdünnt in destilliertem Wasser) gewaschen, wobei der Waschpuffer durch Ausklopfen der

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Platte auf saugfähigem Papier aus den Löchern entfernt wurde. Anschließend wurde die LIA Substrat-lösung hergestellt. Lösung A und Lösung B wurden zu gleichen Anteilen gemischt und 1/5 in Lösung C verdünnt. Je 100 µl der fertigen Substratlösung wurden in jedes Loch gegeben, die Platte 10 Sekun-den lang leicht geschüttelt und dann 10 Minuten bei RT inkubiert. Nach Ablauf der Inkubation sollte die Messung der Lumineszenz innerhalb von 20 Minuten erfolgen, da sonst eine deutliche Abnahme der Lumineszenz-Intensität zu verzeichnen war. Die Lumineszenz wurde mit Hilfe eines Chemilumi-neszenzgerätes ermittelt und die gemessenen Werte als relative Lumineszenzeinheiten (RLU) darge- stellt. An Hand der ermittelten Werte für die Kalibratoren war es möglich eine Standardkurve zu erstel-len, bei der die RLUs gegen die von den Kalibratoren bekannten Progesteronkonzentrationen aufge- tragen wurden. Nach Erstellen einer Regressionsgeraden (r² > 0,95) konnten die Konzentrationen der Plasmaproben mit folgender Formel berechnet werden:

Eichgerade

3.2.3 Versuchsteil III: Einfluss des Schwangerschaftshormons Choriongonadotropin