Choriongonadotropin auf die Generierung, Migration und Funktion von T reg - -Zellen – Untersuchungen im Menschen
4.3.9 Transiente hCG-Expression von HCT116-Zellen begünstigt die Migration der T reg -Zellen
Zur Bestätigung einer hCG-vermittelten Migration der Treg-Zellen sowie zur genauen Aufklärung des Einflusses verschiedener Untereinheiten des hCG auf die Migration, wurden nicht-hCG-produzierende Darmkrebszellen mit verschiedenen hCG-Untereinheiten transfiziert und die Migration der Treg-Zellen analysiert. Die Transfektion der Darmkrebszelllinie HCT116 mit der α-Untereinheit sowie zwei ver-schiedenen β-Untereinheiten (hCG-β3 und hCG-β7) wurde in Kooperation mit Leipzig durchgeführt.
Der hCG-Gehalt im Zellkulturüberstand transfizierter Zellen betrug in Abhängigkeit vom Experiment 500-2800 IU/L. Im Vergleich dazu konnte im Zellkulturüberstand nicht-transfizierter HCT116-Zellen kein hCG nachgewiesen werden. In einem ersten Versuch wurde die Migration der Treg-Zellen zu den HCT116-Zellen bestimmt, welche mit dem vollständigen hCG-Molekül (α- und β-Untereinheit) trans-fiziert worden waren. Die Analyse der Zellmigration zeigte nach 24 Stunden einen signifikanten Un-terschied zwischen hCG-transfizierten HCT116-Zellen und den Kontroll-transfizierten HCT116-Zellen (Abb.43). Keine signifikanten Unterschiede ließen sich zwischen den verschiedenen hCG-β-Untereinheiten feststellen.
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4 8 24
Migration der Treg-Zellen zu HCT116-Zellen (%) 0 10 20 30
hCG-β 7-UE + α-UE hCG-β 3-UE + α-UE Kontrolle
*
Stunden der Migration
Abb. 43: HCG-transfizierte HCT116-Zellen begünstigten die Migration von Treg-Zellen. Unter Verwendung eines 2-Kammer-Transwell-Systems wurde die Migration von Treg-Zellen aus normal schwangeren Frauen (n=3) zu hCG-transfizierten oder Kontroll-transfizierten Darmkrebszellen (HCT116) untersucht. Die Ermittlung des prozentualen Anteils an migrierten Treg-Zellen bezogen auf die Gesamtzahl eingesetzter Treg-Zellen erfolgte mit-tels Durchflusszytometrie. Die transiente Expression des vollständigen hCG-Moleküls förderte die Migration der Treg-Zellen. Signifikante Unterschiede ließen sich nach 24 Stunden zwischen den hCG-transfizierten und den Kontroll-transfizierten HCT116-Zellen feststellen. Die Daten sind als Mittelwerte mit Standardabweichungen dargestellt. Der paarweise Vergleich zwischen den unterschiedlich transfizierten HCT116-Zellen wurde mit dem Student´s t-Test durchgeführt.* = p < 0,05. UE – Untereinheit.
In einem zweiten Experiment wurde analysiert inwieweit die hCG-Untereinheiten alleine ausreichend sind, um eine Migration der Treg-Zellen zu bewirken. Hierfür wurden HCT116-Zellen entweder nur mit der α-Untereinheit oder mit zwei verschiedenen β-Untereinheiten transfiziert. Die Auswertung der Migration zeigte eine signifikant stärkere Migration der Treg-Zellen zu den hCG-transfizierten Zellen im Vergleich zu den Kontroll-transfizierten Zellen. Dabei war die Migration der Treg-Zellen zu den mit der α-Untereinheit transfizierten Darmkrebszellen am stärksten ausgeprägt (Abb.44). Keine signifikan-ten Unterschiede konnsignifikan-ten zwischen den beiden verschiedenen β-Untereinheisignifikan-ten festgestellt werden (Abb.44). Die Ergebnisse haben gezeigt, dass neben dem vollständigen hCG-Molekül auch die einzel-nen hCG-Untereinheiten alleine das Potential haben Treg-Zellen anzulocken.
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4 8 24
Kontrolle hCG-β 7-UE hCG-β 3-UE α-UE
0 10 20
30 *** *
Stunden der Migration Migration der Treg-Zellen zu HCT116-Zellen (%)
Abb. 44: HCG-transfizierte HCT116-Zellen begünstigten die Migration von Treg-Zellen. Unter Verwendung eines 2-Kammer-Transwell-Systems wurde die Migration von Treg-Zellen aus normal schwangeren Frauen (n=3) zu hCG-transfizierten oder Kontroll-transfizierten Darmkrebszellen (HCT116) untersucht. Die Ermittlung des prozentualen Anteils an migrierten Treg-Zellen bezogen auf die Gesamtzahl eingesetzter Treg-Zellen erfolgte mit-tels Durchflusszytometrie. Die transiente Expression der einzelnen hCG-Untereinheiten förderte die Migration von Treg-Zellen. Signifikante Unterschiede ließen sich nach 24 Stunden zwischen den hCG-transfizierten und den Kontroll-transfizierten HCT116-Zellen feststellen. Die Migration der Treg-Zellen gegenüber den mit der α-UE transfizierten HCT116-Zellen war am stärksten ausgeprägt. Die Daten sind als Mittelwerte mit Standardabwei-chungen dargestellt. Der paarweise Vergleich zwischen den unterschiedlich transfizierten HCT116-Zellen wurde mit dem Student´s t-Test durchgeführt. * = p < 0,05. UE – Untereinheit.
Die Ergebnisse konnten deutlich zeigen, dass das vom Trophoblasten sezernierte hCG neben weiteren Faktoren, die Migration der Treg-Zellen zur fetal-mütterlichen Grenzfläche begünstigt.
4.3.10 Die nicht-hCG-produzierende Keratinozytzelllinie HaCat ist nicht in der Lage T
reg-Zellen anzulocken
Um weiterhin auszuschließen, dass die Migration der Treg-Zellen zu den JEG-3-Zellen und Primärtro-phoblasten hauptsächlich durch Chemokine vermittelt wird, die von beiden Zelltypen sezerniert wer-den, wurden in diesem Versuchsteil nicht hCG-produzierende Keratinozyten (HaCat) (siehe Tab.12 im Anhang) verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass HaCat-Zellen verschiedene Chemokine produzie-ren, die potentiell Lymphozyten anlocken können[262][263][264][265]. Unter Verwendung des 2-Kammer Transwell-Systems wurde die Migration der Treg-Zellen zu den HaCat-Zellen untersucht.
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Zusätzlich wurden JEG-3-Zellen in die Untersuchung mit einbezogen, da eine effektive Migration der Treg-Zellen zu diesen Zellen bereits nachgewiesen werden konnte. Im Vergleich zu den JEG-3-Zellen waren die HaCat-Zellen nicht in der Lage eine Migration der Treg-Zellen zu induzieren (Abb.45). Sig-nifikante Unterschiede in der Migrationsrate der Treg-Zellen ließen sich zu allen untersuchten Zeit-punkten zwischen den JEG-3-Zellen und HaCat-Zellen feststellen (Abb.45). Daher scheinen Chemo-kine, die sowohl von JEG-3-Zellen als auch von HaCat-Zellen produziert werden nicht die Hauptattraktoren für Treg-Zellen darzustellen. Vielmehr bestätigen die Ergebnisse eine durch hCG her-vorgerufene Migration der Treg-Zellen.
0 20 40
60 * * ** **
Migration der Treg-Zellen (%)
4 8 24 48
JEG-3 HaCat
Stunden der Migration
Abb. 45: Nicht hCG-produzierende HaCat-Zellen konnten keine Migration von Treg-Zellen induzieren.
Unter Verwendung eines 2-Kammer-Transwell-Systems wurde die Migration von Treg-Zellen aus normal schwangeren Frauen (n=4) zu hCG-produzierenden JEG-3-Zellen oder nicht hCG-produzierenden HaCat-Zellen untersucht. Die Ermittlung des prozentualen Anteils an migrierten Treg-Zellen bezogen auf die Gesamtzahl einge-setzter Treg-Zellen erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Eine Migration von Treg-Zellen zu nicht-hCG-produzierenden HaCat-Zellen konnte im Vergleich zu hCG-nicht-hCG-produzierenden JEG-3-Zellen nicht nachgewiesen werden. Signifikante Unterschiede in der Migrationsrate von Treg-Zellen zu HaCat-Zellen im Vergleich zu JEG-3-Zellen konnten zu allen untersuchten Zeitpunkten festgestellt werden. Die Daten sind als Mittelwerte mit Standardabweichungen dargestellt. Der paarweise Vergleich zwischen den JEG-3- und HaCat-Zellen wurde mit dem Student´s t-Test durchgeführt. * = p < 0,05; ** = p < 0,01.
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