Die Behandlung mit syngener Samenblasenflüssigkeit hat keinen signifikanten Einfluss auf die Expansion der T reg -Zellen

Im Jahr 2004 zeigten Aluvihare und Kollegen, dass die Anzahl an CD4⁺CD25⁺ T-Zellen in Weibchen syngener Verpaarungen vergleichbar zu der Anzahl an CD4⁺CD25⁺ T-Zellen in Weibchen allogener Verpaarungen im Verlauf der Schwangerschaft ansteigt. Die Autoren schlossen deshalb eine

Alloanti-119

gen-bedingte Expansion der Treg-Zellen aus^[171]. Im Gegensatz dazu haben Arbeiten unserer und ande-rer Arbeitsgruppen gezeigt, dass die Anzahl an CD4⁺Foxp3⁺-Zellen in allogenen Verpaarungen im Vergleich zu syngenen Verpaarungen erhöht ist^[173] (unveröffentlichte Beobachtungen von Ana Teles), was auf eine Alloantigen-getriebene Expansion der Treg-Zellen hinweist. Widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der Anzahl an Treg-Zellen zwischen syngenen und allogenen Verpaarungen lassen sich mög-licherweise auf die Analyse der verschiedenen Marker der Treg-Zellen (CD25 oder Foxp3) zurückfüh-ren. Dennoch sind bis zum derzeitigen Zeitpunkt die Faktoren, welche die Treg-Zellexpansion bedin-gen, noch ungeklärt. Bei einer Alloantigen-unabhängigen Expansion der Treg-Zellen, die vorrangig durch TGF-β1 bedingt wird, würde man eine Erhöhung der Treg-Zellen auch in einer syngenen Verpaa-rung erwarten. Aus diesem Grund wurde in diesem Versuchsteil der Effekt der SBF von BALB/c-Männchen auf die Proliferation von genetisch identischen Treg-Zellen und Effektor T-Zellen aus BALB/c-Weibchen getestet. Es konnte ein leichter Anstieg der Treg-Zellen nach Behandlung mit syngener SBF im Vergleich zu den unbehandelten Treg-Zellen nach 24 Stunden festgestellt werden (Abb.28). Der beobachtete Effekt war unabhängig von der eingesetzten Konzentration an SBF. Nach 48 Stunden Kultur waren Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Treg-Zellen jedoch kaum noch nachweisbar (Abb.28). Insgesamt betrachtet konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den behandelten Treg-Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Treg-Zellen ermittelt werden.

Ein Einfluss der SBF auf die Proliferation der Effektor T-Zellen war zu keinem Zeitpunkt nachweisbar (Abb.28).

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Proliferation der Treg-Zellen (%)

0

Proliferation der Teff-Zellen (%)

SBF (ng/ml) - 140 70 - 140 70

24 h 48 h 24 h 48 h

(A) (B)

Abb. 28: Die Zugabe syngener Samenblasenflüssigkeit (SBF) hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Expansion der Treg-Zellen und der Effektor T-Zellen. Beide Zelltypen wurden aus einem Gemisch aus Thy-mus und Milz isoliert und zur Ermittlung der Proliferationsrate mit dem Farbstoff CFDA-SE gefärbt. Der pro-zentuale Anteil an proliferierten Zellen bezogen auf die Gesamtzahl eingesetzter Zellen wurde mittels Durch-flusszytometrie bestimmt. Die Zugabe syngener SBF von BALB/c-Männchen zu Treg-Zellen und CD4⁺CD25 -Effektor T-Zellen (Teff-Zellen) aus BALB/c-Weibchen zeigte nur einen leichten Anstieg der Proliferation der Treg -Zellen (A) nach 24 Stunden, jedoch nicht der Effektor T-Zellen (B). Die Daten sind als Mittelwerte mit Stan-dardabweichungen dargestellt. Die Proliferationsassays wurden für jeden Zelltyp mindestens zwei Mal mit Dop-pelbestimmungen durchgeführt. Der paarweise Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde mit dem Student´s t-Test durchgeführt. Es konnten keine signifikanten Unterschiede detektiert werden.

4.2.2.3 Die in vitro Behandlung mit rekombinantem TGF-β1 verursacht eine Expansion von T

-Zellen aus BALB/c-Weibchen, jedoch nicht aus CBA/J-Weibchen

Zur genaueren Analyse des Effektes von TGF-β1 auf die Expansion der Treg-Zellen, wurden diese aus einem Gemisch von Thymus und Milz aus CBA/J- oder BALB/c-Weibchen mit rekombinantem TGF-β1 (rTGF-β1) behandelt. Die Zugabe von rTGF-β1 konnte die Proliferation der Treg-Zellen aus BALB/c-Weibchen (n=4-6 für alle Zeitpunkte) nach 48 Stunden signifikant steigern (Abb.29). Die Hemmung des rTGF-β1 konnte den beobachteten Effekt vollständig neutralisieren (Abb.29).

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Proliferation der Treg- Zellen aus BALB/c (%) Proliferation der Treg- Zellen aus CBA/J (%)

rTGF-β1 (ng/ml) - 10 20 - 10 20 - 10 20 - 10 20 anti-TGF-β1 - - - + + + - - - + + +

24 h 48 h

24 h 48 h

(A) (B)

Abb. 29: Die Zugabe von rTGF-β1 hatte einen signifikanten Einfluss auf die Expansion der Treg-Zellen aus BALB/c-Weibchen, jedoch nicht auf Treg-Zellen aus CBA/J-Weibchen. Die Treg-Zellen wurden aus einem Gemisch aus Thymus und Milz isoliert und zur Ermittlung der Proliferationsrate mit dem Farbstoff CFDA-SE gefärbt. Der prozentuale Anteil an proliferierten Zellen bezogen auf die Gesamtzahl eingesetzter Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Behandlung von Treg-Zellen mit rTGF-β1 bewirkte einen signifikan-ten Anstieg der Proliferation der Treg-Zellen aus BALB/c-Weibchen (A), jedoch nicht der Treg-Zellen aus CBA/J-Weibchen (B). Der beobachtete Effekt des rTGF-β1 auf die Treg-Zellen aus den BALB/c-Weibchen konnte durch Zugabe von anti-TGF-β1 neutralisiert werden (A). Die Daten sind als Mittelwerte mit Standardabweichungen dargestellt. Die Proliferationsassays wurden mindestens drei Mal mit Doppelbestimmungen durchgeführt. Der paarweise Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde mit dem Student´s t-Test durchgeführt. * = p < 0,05;

** = p < 0,01.

Im Gegensatz dazu konnte die Zugabe des rTGF-β1 zu den Treg-Zellen aus CBA/J-Weibchen (n=4 für alle Zeitpunkte) keinen Effekt hervorrufen (Abb.29) Ein Einfluss von rTGF-β1 auf die Proliferation von Effektor T-Zellen konnte ebenfalls nicht gezeigt werden (Tab.7). Die gewonnenen Daten implizie-ren, dass TGF-β1 einen Einfluss auf die Expansion der Treg-Zellen aus BALB/c-Weibchen, jedoch nicht auf Treg-Zellen aus CBA/J-Weibchen hat.

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Tab. 7: Die Zugabe von rTGF-β1 hatte keinen Einfluss auf die Expansion der Effektor T-Zellen aus BALB/c- und CBA/J-Weibchen. Die CD4⁺CD25^- Effektor T-Zellen wurden aus einem Gemisch aus Thymus und Milz isoliert und zur Ermittlung der Proliferationsrate mit dem Farbstoff CFDA-SE gefärbt. Der prozentuale Anteil an proliferierten Zellen bezogen auf die Gesamtzahl eingesetzter Zellen wurde mittels Durchflusszytome- trie bestimmt. Die Zugabe von rTGF-β1 zu Effektor T-Zellen aus BALB/c- oder CBA/J-Weibchen hatte keinen Effekt auf die Proliferationsrate der Effektor T-Zellen. Die Daten sind als Mittelwerte mit Standardabweichungen dargestellt. Die Proliferationsassays wurden mindestens drei Mal mit Doppelbestimmungen durchgeführt. Der paarweise Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde mit dem Student´s t-Test durchgeführt. Es konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden.

Zeitpunkt Zugabe von rTGF-β1

(ng/ml)

Zugabe von

anti-TGF-β1 Proliferation der Teff

aus BALB/c (%) Proliferation der Teff

aus CBA/J (%)

24 Stunden - - 28,53±5,00 34,31±4,59

24 Stunden 10 - 28,65±5,24 33,08±2,84

24 Stunden 20 - 28,79±3,09 33,04±3,67

24 Stunden - + 32,31±10,49 31,12±1,03

24 Stunden 10 + 33,32±10,99 31,66±0,78

24 Stunden 20 + 31,75±12,07 30,50±1,69

48 Stunden - - 44,82±6,51 46,83±4,50

48 Stunden 10 - 42,91±8,88 48,61±3,61

48 Stunden 20 - 44,53±7,53 48,38±5,52

48 Stunden - + 46,59±10,08 52,14±2,64

48 Stunden 10 + 43,53±11,80 49,97±2,38

48 Stunden 20 + 44,45±13,10 50,17±1,05

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