Real-time- (Echtzeit) PCR

Die "real-time" quantitative PCR (quantitative Echtzeit-PCR) stellt eine Weiterentwicklung der Poly-merase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) dar. Die PCR ist eine sehr schnelle und sen-sitive Methode zur in vitro-Amplifizierung spezifischer DNA-Abschnitte und ermöglicht somit die

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Detektion kleinster DNA-Mengen. Das Prinzip der PCR-Reaktion basiert auf der enzymatischen Ver-mehrung eines bestimmten DNA-Abschnittes (Template), der zwischen zwei spezifischen Starterse-quenzen, den so genannten Primern, liegt. Die Basenabfolge der beiden Primer muss komplementär zur amplifizierenden DNA-Sequenz sein. Weiterhin sollten die Primer eine Länge von 18 bis 30 Basen haben, einen G/C-Gehalt zwischen 20-80 % sowie eine Schmelztemperatur (Tm) von ca. 60 °C. Bei der Primerauswahl sollten Poly (T)-Bereiche, Haarnadelstrukturen und auch 3´-Komplementarität vermieden werden, da es sonst zu unspezifischen Bindungen oder Primerdimerbildung kommen kann.

Binden die Primer an die komplementären DNA-Abschnitte, katalysiert das Enzym DNA-Polymerase die in vitro-DNA-Synthese. Die DNA-Synthese erfolgt in drei Schritten: Jeder Zyklus besteht aus 1) einem Denaturierungsschritt bei 95 °C, um die beiden DNA-Stränge voneinander zu trennen, 2) einem Hybridisierungsschritt, in dem die beiden Primer an den jeweils komplementären Strang binden und 3) einem Syntheseschritt, während dessen der zwischen den Primern liegende DNA-Abschnitt mit Hilfe der DNA-Polymerase und der im Reaktionsmix vorhandenen Desoxyribonukleoti-de selektiv synthetisiert wird. Während jeDesoxyribonukleoti-des PCR-Zyklus sollte sich Desoxyribonukleoti-demnach die Menge Desoxyribonukleoti-der spezi- fischen DNA-Abschnitte verdoppeln, die im nächsten Zyklus wiederum als Template für die Amplifi-kationsreaktion dient. Theoretisch würde somit die Menge der Zielsequenz während der PCR-Reaktion exponentiell zunehmen. In der Praxis wird jedoch eine ca. 90-95 %ige Effizienz der PCR erreicht, da die Bedingungen für eine exponentielle Amplifizierung des Zielproduktes sowohl am An-fang wie auch am Ende der Reaktion nicht optimal sind. Eine typische PCR-Reaktion verläuft in den ersten Zyklen, bei denen die Templatemenge noch sehr gering ist, linear, steigt anschließend exponen-tiell an und erreicht in der letzten Phase der Reaktion ein Plateau, da die Enzymaktivität nach einer bestimmten Zeit nachlässt und auch die amplifizierten DNA-Abschnitte teilweise nicht mehr mit den Oligonukleotid-Primern, sondern untereinander hybridisieren. Aufgrund dieser PCR-Reaktionskinetik ist es schwierig, Aussagen über die Ausgangs-DNA-Mengen zu treffen. In vielen Fällen ist jedoch eine Quantifizierung der Ausgangstemplatemenge nötig. Dies führte zur Entwicklung von der Endpunkt-messung zur "real-time" quantitative PCR. Bei dieser PCR-Variante wird ein fluoreszierender Re-porterfarbstoff verwendet, um die Reaktion verfolgen zu können. Dieser Reporter kann von nicht-spezifischer Natur sein oder spezifisch mit der Ziel-DNA interagieren. In beiden Fällen steigt die Fluo-reszenz proportional mit der Produktmenge an. "Real-time" Detektionssysteme bestehen im Prinzip aus einem PCR-Cycler sowie einem optischen Detektionsmodul, über das die mit der Produktzunahme ansteigenden Fluoreszenzwerte online nach jedem Zyklus gemessen werden. Die Auswertung und Quantifizierung erfolgt mittels der geeigneten Computersoftware. Die Fluorophore werden -je nach System- mit Halogen-, LED- oder Laserlicht angeregt.

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3.2.4.17.4.1 Durchführung der RT-PCR nach dem Taqman-Prinzip

Beim TaqMan- oder auch 5´-Nuclease-Assay liegt zwischen den zwei spezifischen Oligonukleotid-Primern ein zusätzliches, fluoreszenzmarkiertes Oligonukleotid, die so genannte TaqMan-Sonde. Die-se Sonde ist mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff am 5´-Ende und einem intern eingebauten oder am 3´-Ende liegenden Quencher markiert. Die Reporterfluoreszenzemission wird bei der intakten TaqMan-Sonde durch die Nähe zum Quencher unterdrückt. Bei der Neustrangsynthese schneidet die Taq-Polymerase durch ihre 5´-, 3´-Exonukleaseaktivität die TaqMan-Sonde in kleine Fragmente, wodurch es zu einer Loslösung des Reporters vom Quencher kommt und die Reporterfluoreszenz frei-gesetzt werden kann (Abb.22).

Abb. 22: Schematische Darstellung des TaqMan-Prinzips. Nach Abspaltung des Reporters (R) vom Quencher (Q) durch die Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase wird die Reporterfluoreszenz messbar und zeigt die Synthese des spezifischen Zielstranges an. (Quelle:

www.antibiotikamonitor.at/12_02/12_02_06.htm;www.pcr.at/html/mblcy.html#Aufbau%20).

Die Zunahme der Reporterfluoreszenz wird nach jedem Zyklus gemessen und ist wiederum proportio-nal der Menge des DNA-Templates in dem Reaktionsgefäß. Die Taq-Polymerase fragmentiert nur die an die Zielsequenz gebundenen TaqMan-Sonden, nicht hybridisierte Einzelstränge bleiben unbescha-det. Mit Hilfe des TaqMan-Prinzips wurden hCG, TGF-β, IL-10 und foxp3 in den humanen Dezidua- und Plazentaproben mittels RT-PCR analysiert. Zu der zu amplifizierenden cDNA (1-3 µl) wurden jeweils 6,5 µl TaqMan-Mastermix, 3 µl Primermix, 0,5 µl TaqMan-Sonde und dH2O bis zu einem Endvolumen von 13 µl gegeben. Als Negativkontrolle (No Template Control, NTC) wurde eine

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schung aus allen Reagenzien ohne die zu amplifizierende cDNA verwendet. Alle Proben wurden als Doppelbestimmungen ermittelt. Die RT-PCR wurde mit Hilfe eines ABI Prism^®-Gerätes oder eines I-Cyclers durchgeführt.

PCR-Programm T T Zyklenzahl

95 °C 10 Minuten 1

Denaturierung 95 °C 15 Sekunden

Annealing/ Amplifizierung 60 °C 60 Sekunden 40

50 °C 60 Sekunden 1

3.2.4.17.4.2 Durchführung der RT-PCR unter Verwendung von SYBR-Green

SYBR^®-Green verhält sich wie Ethidiumbromid als interkalierender Farbstoff, der sich unspezifisch in Doppelstrang-DNA einlagert (Abb.23(a)). Dadurch kommt es mit fortschreitender PCR-Reaktion zu einem Fluoreszenzanstieg. Der Vorteil von SYBR^®-Green ist die universelle Verwendbarkeit, da es unspezifisch eingebaut wird und in jeder beliebigen PCR-Reaktion eingesetzt werden kann, sowie die hohe Signalstärke, da jedes DNA-Molekül mehrere Fluoreszenzmoleküle bindet. Darüber hinaus ist die Verwendung von SYBR^®-Green im Vergleich zum Einsatz von spezifischen Sonden die kosten-günstigere Variante. Es fehlt jedoch eine spezifische Bindung des Fluorophors an die zu amplifizieren-de Ziel-DNA, sodass eine Unterscheidung zwischen korrektem Produkt und Artefakt oamplifizieren-der Primerdi-meren, die während der PCR-Reaktion auch einen Fluoreszenzanstieg verursachen können, nicht möglich ist. Eine Differenzierung zwischen spezifischem Produkt und Primerdimeren sind im An-schluss an den PCR-Lauf mithilfe einer Schmelzkurvenanalyse möglich. Dabei kommt es durch schrittweisen Temperaturanstieg zu einer Auftrennung der DNA-Doppelstränge entsprechend ihrer jeweiligen Schmelzpunkte in ihre Einzelstränge. Die daraus resultierende Fluoreszenzabnahme wird aufgezeichnet. Aufgrund der Schmelztemperaturen kann man zwischen spezifischen Produkten und Primerdimeren unterscheiden, da Primerdimere bei geringeren Temperaturen schmelzen als die spezi-fischen, größeren PCR-Produkte (Abb.23(b)). Mittels SYBR^®-Green wurde nrp-1 in den humanen Dezidua- und Plazentaproben analysiert.

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Abb. 23: SYBR-Green (SG)-Reaktion und Schmelzkurvenanalyse. Einbau von SG in doppelsträngige DNA (a) Unterscheidung der mit SG markierten PCR-Produkte mittels Schmelzkurvenanalyse (b) (Quelle:

www.antibiotikamonitor.at/12_02/12_02_06.htm)

Zu 1 µl der zu amplifizierenden cDNA wurden jeweils 6,25 µl SYBR^®-Green Mastermix, 3 µl Primer-mix, 0,5 µl Fluorescein und dH2O bis zu einem Endvolumen von 13 µl gegeben. Als Negativkontrolle (No Template Control, NTC) wurde eine Mischung aus allen Reagenzien ohne die zu amplifizierende cDNA verwendet. Alle Proben wurden als Duplikate bestimmt. Die RT-PCR Analyse wurde mit Hilfe eines I-Cycler-Gerätes durchgeführt.

PCR-Programm T t Zyklenzahl

95 °C 3 Minuten 1

Denaturierung 94 °C 30 Sekunden

Annealing 60 °C 30 Sekunden 45

Amplifizierung 72 °C 30 Sekunden

95 °C 60 Sekunden 1

Stop 4 °C ∞ 1

Schmelzkurve T T Zyklenzahl

50 °C 1 Minute 1

je 0,5 °C Anstieg in jedem Zyklus

10 Sekunden 80

107 3.2.4.17.4.3 Auswertung der RT-PCR

Die Quantifizierung der PCR basiert bei allen Systemen auf der Messung des Fluoreszenz-Schwellenwertes, dem so genannten Threshold Cycle oder CT-Wert. Der CT-Wert ist jener PCR-Zyklus, bei dem die Reporterfluoreszenz einen festgelegten Fluoreszenz-Schwellenwert übersteigt.

Am Anfang der PCR-Reaktion wird nur die Basis- oder Hintergrundfluoreszenz gemessen, da die Reporterfluoreszenz aufgrund der geringen Templatekonzentration im Reaktionsgefäß während der ersten PCR-Zyklen normalerweise nicht detektierbar ist. Die Quantifizierung der DNA-Menge beruht nicht auf absoluten Mengen an PCR-Produkt, sondern auf der Kinetik der PCR-Reaktion. Dafür nimmt man als Richtlinie den CT-Wert, da zu diesem Zeitpunkt die Amplifikation exponentiell ist und es in dieser Phase der PCR-Reaktion keine limitierenden Faktoren, wie Primer- oder Nukleotidmangel, nachlassende Enzymaktivität oder Inhibition der PCR-Reaktion durch Generation bestimmter Produk-te gibt. Parallel dazu wird in jedem PCR-Lauf ein Haushaltsgen ("house keeping gene", β-Actin) mitamplifiziert, dessen Expression in jeder Probe gleich sein sollte. Es lässt sich im Folgenden aus den ermittelten CT-Werten für das zu untersuchende Gen (Zielgen) und für das Haushaltsgen die Differenz (∆CT) bilden, die Aufschluss über die relative Expression des zu untersuchenden Gens zur Expression des Haushaltsgenes liefert. Die relative Expression des Zielgens kann dann zwischen den einzelnen Proben verglichen werden. Der ∆CT - Wert berechnet sich nach folgender Formel:

2

Aus dem ermittelten ∆CT -Wert lässt sich die relative Expression des zu untersuchenden Gens berech-nen:

Expression = 2^-∆CT

Die berechneten Expressionswerte ließen sich anschließend mit Hilfe des Computerprogramms GraphPad Prism 5.0 graphisch darstellen und statistisch auswerten.

3.2.4.18 Statistik

Alle statistischen Berechnungen und graphischen Darstellungen wurden mit der Software GraphPad Prism 5.0 und SPSS Statistics 17.0 ausgeführt. Immunhistochemische und RT-PCR-Daten sind als Datenpunkte dargestellt, wobei jeder Datenpunkt einem Tier oder einer Probe entspricht. Die Daten

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sind als Mediane dargestellt. Der statistische Unterschied zwischen allen Gruppen wurde mit Hilfe des Kruskall-Wallis Test ermittelt, wohingegen statistische Unterschiede zwischen zwei Gruppen mit Hilfe des nicht-parametrischen Mann Whitney U-Tests ermittelt wurden. Dieser Test prüft, ob zwei unab-hängige Stichproben zu einer Grundgesamtheit gehören. Die Stichproben (Daten) müssen dabei keiner Normalverteilung folgen. Der Test ist demnach für schief verteilte und kleine Stichproben (geringe Anzahl an Tieren/Proben pro Stichprobe) gut geeignet. Bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 galt der Unterschied zwischen den beiden verglichenen Gruppen als statistisch signifikant.

Die nicht-parametrische Spearman Korrelation wurde verwendet, um eine Korrelation zwischen RT-PCR Daten zweier verschiedener Gene zu analysieren. Parametrische Daten (z. B. Migrationsda-ten) wurden mit dem Student´s t-Test für den Vergleich zwischen zwei Gruppen und mit Two-Way-ANOVA für den Vergleich zwischen drei oder mehr Gruppen ausgewertet.

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4 Ergebnisse

4.1 Versuchskomplex I: Untersuchungen zur Expansion der T

-Zellen vor der