Mittels des erstellten Auswertungsbogens, in dem die Kriterien, die in human- und tiermedizinischen Studien bereits beurteilt wurden, aufgelistet waren, wurden die Le-berpräparate mittels eines Zeiss Mikroskops zunächst in der 400x Vergrößerung be-urteilt. In 20 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern (High Power Field) wurden Zell-cluster von Hepatozyten nach dem Score-System der unterschiedlichen Studien be-urteilt. Zu den Zellkriterien, die in der 400x Vergrößerung beurteilt wurden, gehörten:
zweikernige Zellen, multinukleäre Zellen, freiliegende Nuklei, Nukleus-/Zell-Durchmesser-Verhältnis, zytoplasmatische Einschlüsse, und das intrazelluläres Pig-ment. Anschließend wurde die Chromatinverteilung bei 1000x Vergrößerung unter Zuhilfenahme von Immersionsöl beurteilt.
Zweikernige und multinukleäre Zellen wurden sowohl qualitativ als auch semiquanti-tativ mittels verschiedener Scores beurteilt (Tabelle 28). Des Weiteren wurde die Kernanzahl von 100 Hepatozyten pro Probe erfasst und die durchschnittliche Kernanzahl ermittelt.
Tabelle 28: Übersicht über Literaturangaben zur Beurteilung von zweikernigen und multinuk-leären Zellen im zytologischen Leberpräparat.
Kriterium Autor Score
0 1 2 3
Zwei-kernige
Zellen/
Kernanzahl
Masserdotti und Drigo, 2012 keine 1/HPF 1–3/HPF >3/HPF Stockhaus et al. 2002, 2004 Kerne pro Zelle (durchschnittliche Anzahl aus 100 Zellen) Cohen et al. 1991
Solé et al. 1993 De Boer et al. 1999
qualitativ
anwesend / nicht anwesend
Multiple Nuklei
( >3 )
Wee und Nilsson, 2003 Solé et al. 1993
Takenaka et al. 1999 De Boer et al. 1999
qualitativ
anwesend / nicht anwesend (Multiple Nuklei; >3 Nuklei)
Masserdotti und Drigo, 2012 keine 1/HPF 1–3/HPF >3/HPF
Freie Nuklei wurden sowohl in ihrem quantitativen Vorhandensein pro Gesichtsfeld mit verschiedenen Scores von 0–3 bzw. von 0–4 beurteilt, als auch qualitativ bezüg-lich ihrer Anwesenheit (ja/nein) (Tabelle 29).
Tabelle 29: Übersicht über Literaturangaben zur Beurteilung von freiliegenden Nuklei im zy-tologischen Leberpräparat.
Kriterium Autor Score
0 1 2 3 4
Frei-liegende
Nuklei
Masserdotti und Drigo,
2012 keine 1–2/HPF 3–10/HPF >10/HPF /
Cohen et al. 1991 Solé et al. 1993 Wee und Nilsson, 2003, Wee et al. 1990,1993 Takenaka et al. 1999 Das et al. 1999, De Boer et al. 1999
qualitativ
anwesend / nicht anwesend
G. Pedio et al., 1988 keine wenig mittelmäßig viele reichlich
HPF: High Power Field (Gesichtsfeld in der 400x Vergrößerung)
Die Chromatinverteilung im zytologischen Leberpräparat wurde in 1000x Vergrößerung unter Ölimmersion qualitativ sowohl in 20 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern pro Probe als auch in 100 Zellen pro Probe beurteilt. Des Weiteren erfolgte die Beurteilung der Anwesen-heit von irregulärem Chromatin pro Probe (Tabelle 30).
Tabelle 30: Übersicht über Literaturangaben zur Beurteilung der Chromatinverteilung im zy-tologischen Leberpräparat.
Kriterium Autor Score
0 1 2 3
Chromatin- verteilung
Masserdotti und Drigo, 2012
kompakt granulär grobkörnig verklumpt
Beurteilt in 20 Gesichtsfeldern pro Probe Stockhaus et al., 2004;
2002
Prozent der Zellen mit regulärem oder irregulärem Chromatin (aus 100 Zellen)
Wee und Nilsson, 2003 Takenaka et al. 1999 Solé et al. 1993 Cohen et al., 1991
Anwesenheit von irregulären Chromatinmustern in Probe (ja / nein)
Dominis et al., 1973 regulär irregulär Kondensation Schlitze und Vakuolen
Für die Bestimmung der Zell- und Kerngrößen der caninen Hepatozyten wurden die Proben mit verschiedenen Hepatopathien sowie der Kontrollgruppe mikroskopisch untersucht. Unter der 1000x Vergrößerung wurden mit Hilfe von Ölimmersion zu-nächst mikroskopische Aufnahmen eines zufällig ausgewählten Gesichtsfeldes ge-macht und im Anschluss wurden die im Gesichtsfeld liegenden Hepatozyten vermes-sen. Dies geschah in zwei Richtungen (Abbildung 1) mittels des Zeiss Imaging Solu-tion (Göttingen) Programms „Axio Vision 4.8“. Insgesamt wurden so die Diameter von 100 Hepatozyten pro Probe und deren Kernen ermittelt. Es wurde sowohl die Länge als auch die Breite der Zelle und des Zellkerns vermessen. Als Ansatzpunkte dienten hierbei jeweils die breitesten Stellen von Zelle und Kern (Abbildung 1). Die erhobenen Werte wurden anschließend in eine Tabelle aufgenommen und aus den beiden Messungen der Diameter der Zelle und des Kerns der Mittelwert pro Zelle gebildet (Tabelle 31). Aus diesen Messungen wurde das Kern-/Zell-Durchmesser-Verhältnis ermittelt, welches in den bisher publizierten Studien als Nukle-us/Zytoplasma-Verhältnis bezeichnet wurde. Dies wurde mittels genauer Messung, sowie mit einem semiquantitativen und einem qualitativen Score erfasst (Tabelle 32).
Tabelle 31: Beispiel für die Tabelle der Diametermessung in zwei Richtungen von Leberzelle und Leberzellkern
Zelle (in µm)
Ø (in µm) Kern (in µm)
Ø (in µm) N-/Z-D-Verhältnis Durchmesser 1 Durchmesser 2 Durchmesser 1 Durchmesser 2
1 26,00 24,00 25,00 8,00 10,00 9,00 1/2,77
2 23,00 28,00 25,50 8,50 9,50 9,00 1/2,83
3 .. .. .. .. .. .. ..
4 .. .. .. .. .. .. ..
5
Abbildung 1: Schema zur digital gestützten Messung des Zell- und Kerndurchmessers von caninen Leberzellen: (a) Messung in vertikaler Richtung, (b) Messung in horizontaler Rich-tung, jeweils 1000x Vergrößerung
(a) (b)
Tabelle 32: Übersicht über Literaturangaben zur Beurteilung des Nukleus-/Zell-Durchmesser- Verhältnis (N-/Z-D-Verhältnis) im zytologischen Leberpräparat.
Kriterium Autor Score
0 1 2 3
N-/Z-D- Verhältnis
Masserdotti und Drigo, 2012
keine
in <20 % der Hepatozyten
erhöht
in 20–60 % der Hepatozyten
erhöht
in >60 % der Hepatozyten
erhöht Beurteilt in 20 Gesichtsfeldern pro Probe
Cohen et al., 1991 Takenaka et al., 1999 De Boer et al., 1999 Wee und Nilsson, 2003
Anwesenheit eines erhöhten Nukleus/-Zell-Durchmesser-Verhältnisses in Probe
(ja / nein) Stockhaus et al.,
2002, 2004 Nukleus-/Zell-Durchmesser-Verhältnis (Messung von 100 Zellen)
Mittels eines Score-Systems von 0–3 wurden die zytoplasmatischen Einschlüsse bzw. die vakuoligen Veränderungen der Leberzellen erfasst. Hierfür wurden nach Masserdotti und Drigo (2012) in 20 verschiedenen zufällig ausgewählten Gesichts-feldern die Anzahl von Zellen mit Lipidvakuolen oder Glykogeneinlagerungen ge-schätzt (Tabelle 33). Des Weiteren wurde die Probe insgesamt auf das Vorhanden-sein von vakuoligen Einschlüssen nach dem Score von 0–3 nach Lundquist und A-kerman, (1970) untersucht.
Tabelle 33: Übersicht über Literaturangaben zur Beurteilung von zytoplasmatischen Ein-schlüssen und intrazellulärem Pigment im zytologischen Leberpräparat.
Kriterium Autor Score
0 1 2 3 Beurteilt in 20 Gesichtsfeldern pro Probe
Stockhaus et al., 2002, 2004
keine wenig mittelgradig viele
Beurteilt in 100 Zellen pro Probe Das et al., 1999,
Anwesenheit von Vakuolen in Probe (ja / nein)
Lundquist und Solé et al., 1993 Anwesenheit von Makrovakuolen in Probe (ja / nein)
Intra- zelluläres
Pigment
Stockhaus et al., 2002, 2004
keins wenig mittelgradig viel
Beurteilt in 100 Zellen pro Probe Solé et al., 1993
Wee et al., 1990 Wee et al., 1993 Bottles et al., 1988 Das, 1999
Anwesenheit von intrazellulärem Pigment in Probe (ja / nein)
Außerdem wurden vakuolige Veränderungen in 100 Zellen mittels des Scores nach Stockhaus et al. (2002; 2004) erfasst, wobei keine Differenzierung von Lipidvakuolen oder Glykogeneinlagerungen vorgenommen wurde (Tabelle 33). Als Vergleich für die hierbei verwendete Score-Graduierung dienten Vergleichsbilder (Abbildung 2). Wei-terhin wurde die Anwesenheit (ja/nein) von großen und kleinen Vakuolen sowie die Anwesenheit (ja/nein) insgesamt von vakuoligen Einschlüssen im Präparat bzw. pro Probe beurteilt. Das intrazelluläre Pigment wurde pro Zelle semiquantitativ mittels eines Scores von 0 bis 3 erfasst (Tabelle 33). Hierfür wurde das intrazelluläre Pig-ment in 50 Hepatozyten anhand von Vergleichsbildern in die jeweilige
Score-Graduierung eingeordnet und anschließend pro Patient gemittelt. Des Weiteren wur-de die Ausprägung wur-des intrazellulären Pigments im Präparat bezüglich seiner Anwe-senheit (ja/nein) qualitativ beurteilt.
Abbildung 2: Vergleichsbilder zur Graduierung von vakuoligen Veränderungen in der caninen Leberzelle (1000x Vergrößerung). Vakuolige Veränderungen (a–c) sowie glykogenbedingte Veränderungen (a’–c’). Dargestellt sind jeweils Zellen mit (a) / (a’) “wenig”, (b) / (b’) “mittel-gradig” sowie (c) / (c’) mit “viel” zytoplasmatischen Einschlüssen.
Abbildung 3: Vergleichsbilder zur Graduierung von intrazellulärem Pigment (1000x
(a) (b) (c)
(a) (b) (c)
(b‘) (c‘)
(a‘)
Des Weiteren wurden Zellpopulationen wie hämatopoetische Zellen, infiltrative tu-morzellen und Entzündungszellen im caninen Leberpräparat beurteilt. Pro Probe wurde die Anwesenheit (ja/nein) von weißen Blutzellen, Entzündungszellen und Rundzellen, sowie deren quantitatives Vorkommen erfasst. Hierfür wurde die absolu-te Anzahl dieser Zellen in den ersabsolu-ten 5 Gesichtsfeldern (400x Vergrößerung) gezählt sowie deren prozentuale Anzahl pro 250 Leberzellen. Zusätzlich wurde ihr Vorkom-men in 20 Gesichtsfeldern mit Hilfe eines Scores von 0 bis 3 beurteilt (Tabelle 34).
Die oben genannten Zählweisen wurden einzeln sowohl auf stabkernige als auch auf segmentkernige neutrophile Granulozyten, auf Lymphozyten und Lymphoblasten, auf Zellen der Erythropoese und Granulopoese sowie auf histiozytäre (Tumor-)Zellen angewendet. Makrophagen wurden in gleicher Weise beurteilt, mit dem Unterschied, dass hier, in Anlehnung an die Literatur, nicht in 5 sondern in 10 Gesichtsfeldern die absolute Anzahl erfasst wurde (Tabelle 35).
Tabelle 34: Übersicht über Literaturangaben zur Beurteilung von Entzündungszellen, infiltra-tiven Tumorzellen und hämatopoetischen Zellen im zytologischen Leberpräparat.
Kriterium Autor Score
0 1 2 3
Zelltyp
Masserdotti und
Drigo, 2012 keine 2–3 Zellen/HPF 4–10 Zellen/HPF >10 Zellen/HPF Stockhaus et al.
2002, 2004 Zelltyp % aus 250 Zellen
Lundquist und
Akerman, 1970 Zelltyp gezählt in 5 LPF
Wee et al. 1993
Zelltyp qualitativ
anwesend / nicht anwesend
HPF: High Power Field (Gesichtsfeld in der 400x Vergrößerung); LPF: Low Power Field (Gesichtsfeld in der 200x Vergrößerung)
Tabelle 35: Übersicht über Literaturangaben zur Beurteilung von Makrophagen im zytologi-schen Leberpräparat.
Kriterium Autor Score
0 1 2 3
Makro- phagen
Masserdotti und
Drigo, 2012 keine 2–3 Zellen/HPF 4–10 Zellen/HPF >10 Zellen/HPF Stockhaus et al.
2002, 2004 Kupffer Makrophagen % aus 250 Zellen
Lundquist und Akerman, 1970
Makrophagen gezählt in 10 LPF Dominis et al.
1973;
Wee et al, 1993
Makrophagen Qualitativ
anwesend / nicht anwesend
HPF: High Power Field (Gesichtsfeld in der 400x Vergrößerung); LPF: Low Power Field (Gesichtsfeld in der 200x Vergrößerung)