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Optimierung von Beurteilungskriterien für die Leberzytologie beim Hund

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Academic year: 2022

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Optimierung von Beurteilungskriterien für die Leberzytologie beim Hund

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Julia Aschenbruck

Oberhausen

Hannover 2019

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Reinhard Mischke Klinik für Kleintiere

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein

Tag der mündlichen Prüfung: 17.05.2019

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Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form von mündlichen Vorträgen auf fol- genden Fachtagungen präsentiert:

 22. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Labordiag- nostik“ (InnLab 2014), 31.01.–01.02.2014, Gießen:

„Morphometrie von kaninen Hepatozyten“

Julia Aschenbruck, geb. Krause, Reinhard Mischke

Der zugehörige Abstract wurden veröffentlicht in der Tierärztl Prax Ausg K 42, 2014, V15

 26. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Labordiag- nostik“ (InnLab 2018), 02.–03.02.2018, Hannover:

„Optimierung eines Scores zur zytologischen Leberzellbeurteilung beim Hund“

Julia Aschenbruck, Reinhard Mischke

Der zugehörige Abstract wurden veröffentlicht in der Tierärztl Prax Ausg K 46, 2018, V 06

(4)
(5)

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ... V Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen... VII

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht... 3

2.1 Zytologie der physiologischen Leber ... 3

2.2 Krankheitsbedingte Veränderungen im caninen zytologischen Leberpräparat... 4

2.3 Morphometrie von caninen Leberzellen ... 9

2.3.1 Zell- und Kerngrößen ... 9

2.4 Leberzellscore Evaluierung ... 13

2.4.1 Kernkriterien ... 13

2.4.2 Zellkriterien ... 30

2.5 Leberzellscore zur Erfassung sonstiger Zellen ... 39

2.5.1 Neutrophile Granulozyten ... 39

2.5.2 Makrophagen ... 42

2.5.3 Lymphozyten und Lymphoblasten ... 44

2.5.4 Histiozytäre Zellen ... 47

2.5.5 Zellen der extramedullären Hämatopoese ... 48

3 Material, Tiere und Methoden ... 49

3.1 Studiendesign ... 49

3.2 Herkunft der Präparate (Tiere) ... 50

3.3 Herstellung der zytologischen Präparate ... 58

3.4 Versuchsdurchführung (Score-System) ... 59

3.5 Statistische Auswertung ... 67

(6)

4.1 Summary ... 70

4.2 Zusammenfassung ... 70

4.3 Einleitung ... 71

4.4 Material und Methoden ... 72

4.4.1 Studiendesign ... 72

4.4.2 Zytologisches Probenmaterial ... 72

4.4.3 Beurteilung, Zell- und Kernkriterien ... 73

4.4.4 Statistik ... 78

4.5 Ergebnisse ... 79

4.6 Diskussion ... 85

4.7 Literatur ... 88

5 Manuskript II ... 91

5.1 Summary ... 92

5.2 Einleitung ... 93

5.3 Material und Methoden ... 94

5.3.1 Studiendesign ... 94

5.3.2 Zytologisches Probenmaterial ... 95

5.3.3 Versuchsdurchführung ... 95

5.3.4 Statistik ... 97

5.4 Ergebnisse ... 97

5.5 Diskussion ...105

5.6 Literatur ...108

6 Übergreifende Diskussion ...111

7 Zusammenfassung...117

8 Summary ...121

9 Literaturverzeichnis ...123

10 Tabellarischer Anhang ...135

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Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

ALP Alkalische Phosphatase (nur in Tabellen) ALT Alanin-Aminotransferase (nur in Tabellen)

bzw. beziehungsweise

ca. circa

FNA Feinnadelaspiration (nur in Tabellen) GLDH Glutamatdehydrogenase (nur in Tabellen) hgr. hochgradig (nur in Tabellen)

HCC hepatozelluläres Karzinom (nur in Tabellen) HPF High Power Field (400x Vergrößerung) Htk Hämatokrit (nur in Tabellen)

i. m. intramuskulär (nur in Tabellen) kg Kilogramm (nur in Tabellen)

LPF Low Power Field

Max Maximum (nur in Tabellen)

metast. metastatisch

Min Minimum (nur in Tabellen)

mg Miligramm

mgr. mittelgradig (nur in Tabellen)

M-HCC mittelmäßig-differenziertes hepatozelluläres Karzinom (nur in Tabellen)

N-neopl. nicht-neoplatisch (nur in Tabellen)

(8)

S-HCC schlecht-differenziertes hepatozelluläres Karzinom (nur in Tabellen)

S-Adenokarzinom schlecht-differenziertes Adenokarzinom (nur in Tabellen) SIH Steroid-induzierte Hepatopathie

Vermtl. vermutlich (nur in Tabellen)

vs. Versus

G-HCC gut-differenziertes hepatozelluläres Karzinom (nur in Tabellen)

z. B. Zum Beispiel

(9)

1 Einleitung

Die zytologische Untersuchung ist auch in der Tiermedizin für die Diagnosestellung essentiell geworden und setzt da an, wo Blut- und Labortests sowie die Sonographie keine genaue Diagnose erlauben. Somit ist die Entnahme von Zellmaterial für die präzise Diagnose von verschiedenen Lebererkrankungen unerlässlich geworden (Bolliger, 1996). Die zytologische Untersuchung dieser Zellen bietet im Gegensatz zur histologischen Untersuchung den Vorteil, dass Leberzellen ultraschallgestützt minimal invasiv mittels Feinnadelaspiration (FNA) entnommen und zeitnah mikrosko- pisch beurteilt werden können. Andererseits bestehen Limitierungen in der Leberzy- tologie, insbesondere für das Erkennen von Zirrhose und Fibrose (Man-Shan Tsui et al., 1998; Perry und Johnston, 1985) und zum Beispiel auch in der Beurteilung von geringgradigen Hepatitiden. So können die im Präparat befindlichen Entzündungszel- len, wenn sie nicht in eindeutiger hoher Zahl vorliegen, sowohl einen inflammatori- schen Prozess repräsentieren als auch das Ergebnis einer Blutkontamination darstel- len (Weiss et al., 2001).

Bewertungssysteme können helfen, die Diagnose für verschiedene Lebererkrankun- gen zu vereinfachen. Von den bisher in der Veterinärmedizin veröffentlichten Studien zum Thema Leberzytologie befasst sich nur ein sehr geringer Teil mit der Erstellung eines Scoring-Systems zur Beurteilung der Leberzellmorphologie. In diesen Studien wurde sowohl der Einfluss des Alters auf die Leberzellen gesunder Hunde als auch der Einfluss verschiedener Lebererkrankungen im Vergleich zu gesunden Leberzel- len beim Hund untersucht (Stockhaus et al., 2002, 2004). Hierzu wurden Zell- und Kernkriterien in einem Bewertungssystem zusammengefasst, das die Ausprägung des jeweiligen Kriteriums erfasst hat. Eine weitere Studie befasste sich mit der Er- mittlung eines Scoring-Systems für Zell- und Kernkriterien, die für die Diagnose eines Leberzellkarzinoms beim Hund signifikant sind (Masserdotti und Drigo, 2012). Ent- scheidende Zellkriterien, die auf Malignität einer Umfangsvermehrung hinweisen können, sind zum wesentlichen Teil vom Kerndurchmesser sowie dessen Relation

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karyose, Makrokaryose und das „Kern-/Zytoplasma-Verhältnis“, das genau genom- men ein „Nukleus-/Zell-Durchmesser-Verhältnis“ (N-/Z-D-Verhältnis) ist. Bisher wur- den die Messwerte zur Ermittlung der Zell- und Kerngröße mittels eines Okular- Mikrometers oder eines Elektronenmikroskops erhoben (Hess et al., 1973; Stock- haus et al., 2002). Die zuvor erwähnten Studien (Masserdotti und Drigo, 2012;

Stockhaus et al., 2002; 2004) befassten sich ebenfalls mit unterschiedlichen Scores zur Erfassung von sonstigen Zellen im zytologischen Leberpräparat. Die Bewer- tungsschlüssel der genannten tiermedizinischen Studien basieren vor allem auf Stu- dien an Leberpräparaten des Menschen (Cohen et al., 1991; Kulesza et al., 2004).

Allerdings finden sich weder in der zugänglichen veterinär- noch humanmedizini- schen Literatur Studien, die verschiedene Leberzell-Scoring-Systeme miteinander vergleichen, um ein optimiertes, allgemeingültiges Bewertungssystem zu entwickeln.

Ziel dieser Arbeit war es, ein optimiertes Scoring-System zu entwickeln, das die Di- agnosefindung von zytologischen Leberuntersuchungen des Hundes unterstützt. Be- rücksichtigt wurden dabei verschiedene Bewertungsschlüssel für Kern- und Zyto- plasmakriterien (1. Studienteil) sowie die Anwesenheit von hämatopoietischen Zellen bzw. Entzündungszellen und infiltrativen Tumorzellen (2. Studienteil) aus Studien aus Human- und Tiermedizin, die sich mit Leberzell-Scores befassten. Zur Auswertung des Kriteriums N-/Z-D-Verhältnis erfolgten u. a. exakte Messungen von Kern- und Zelldurchmesser mittels digitaler Messsoftware. Unterschiedliche Bewertungsschlüs- sel für die zytologischen Kriterien der Hepatozyten und für die Anwesenheit sonstiger Zellen wurden bezüglich ihrer Aussagekraft anhand des Vergleichs des Ergebnisses von verschiedenen Hepatopathien und gesunden Lebern evaluiert.

(11)

2 Literaturübersicht

2.1 Zytologie der physiologischen Leber

Bei der mikroskopischen Untersuchung von gesunden Leberpräparaten finden sich vorwiegend große runde ovoide bis polygonale Hepatozyten (Bolliger, 1996; Kristen- sen et al., 1990; Ramaiah und Alleman, 2002; Stockhaus et al., 1997; Weiss et al., 2002). Diese enthalten zumeist einen runden Kern mit grobkörnig-retikulärem und einen oder mehrere, meist prominente Nukleoli (Stockhaus et al., 2002; Weiss et al., 2002). Die Anwesenheit von zweikernigen Zellen im gesunden Leberpräparat wurde in diversen Übersichtsarbeiten beobachtet (Kristensen et al., 1990; Ramaiah und Alleman, 2002; Weiss et al., 2002). Einige der Hepatozyten können in geringen Men- gen Pigment enthalten (Kristensen et al., 1990). Neben den Einlagerungen von Pig- ment finden sich gelegentlich auch kleine Vakuolen im Zytoplasma gesunder Leber- zellen (Ramaiah et al., 2002). Neben Leberzellen finden sich im zytologischen Le- berpräparat gelegentlich auch Gallengangsepithelzellen, welche sich kleiner darstel- len als Hepatozyten, einen runden bis ovoiden Nukleus aufweisen und in Clustern liegend vorzufinden sind (Bolliger et al., 1996; Kristensen et al., 1990; Ramaiah und Alleman 2002; Weiss et al., 2002).

Im zytologischen Präparat gesunder caniner Lebern finden sich neben dem vorherr- schenden Zelltyp der Hepatozyten auch andere Zellpopulationen. Für gewöhnlich kommen, Mastzellen und Makrophagen in geringer Anzahl vor (Bolliger, 1996; Kris- tensen et al., 1996; Ramaiah und Alleman 2002; Weiss et al., 2002). Zum Teil wird die Anwesenheit von Leukozyten, wobei diese von den Autoren nicht weiter differen- ziert werden, in zytologischen Präparaten von physiologischen Lebern der, wenn vorhandenen, Blutkontamination zugeschrieben (Kristensen et al., 1990; Weiss et al., 2002). Der Hintergrund von caninen zytologischen Leberpräparaten beinhaltet hier- bei nicht nur rote Blutzellen, sondern weist häufig auch zytoplasmatischen Debris

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2.2 Krankheitsbedingte Veränderungen im caninen zytologischen Leberpräparat

Steroid-induzierten Hepatopathie

Durch verschiedene Hepatopathien kann sich das zytomorphologische Bild der cani- nen Leber stark verändern. Bei der Steroid-induzierten Hepatopathie kommt es ent- weder aufgrund eines Hyperadrenokortizismus oder aufgrund von exogener Zufuhr von Glukokortikoiden zu einer Einlagerung von Glykogen in das Zytoplasma, welches Veränderungen im Zellbild hervorrufen kann (Ramaiah und Alleman 2002; Weiss et al., 2002). Charakterisiert sind diese Veränderungen durch eine unklare schaumig wolkige Zytoplasmaveränderung, wobei sich häufig keine abgrenzbaren Vakuolen identifizieren lassen (Bolliger, 1996; Stockhaus et al., 1997; Weiss et al., 2002). Die betroffenen Leberzellen bekommen ein geschwollenes Aussehen (Stockhaus et al.

1997, Weiss et al., 2002). Hierbei können diese Leberzellen zwei Mal so groß (Thompson et al., 1971) teilweise sogar zehn Mal so groß werden, wie normale He- patozyten (Fittschen und Bellamy, 1984). Kuhlenschmidt et al. (1991) maßen bei Hunden, die einer Glukokortikoidbehandlung unterzogen wurden, ein Volumen von 6600µm³, welches im Vergleich zu normalen Hepatozyten (2060µm³) ca. um das Dreifache erhöht war. Fiedler et al. (1958) konnten bei Hepatozyten von Hunden die einer Glukokortikoidbehandlung ausgesetzt waren, Hepatozyten mit irregulärer Form und einem zentral gelegenen Zellkern feststellen, welche große intrazytoplasmati- sche Vakuolen aufzeigten. In einer frühen Studie in der der hepatotoxische Effekt von Glukokortikoiden untersucht wurde, konnte an Leberzellen von Raten Karyor- rhexis, Karyolyse und Pyknose festgestellt werden (Tanyol und Rehfuss, 1955).

Durch die Veränderungen des Zytoplasmas kommt es, während des Ausstreichens des Zellmaterials auf den Objektträger, häufig zur Lyse der Leberzellen, was nach Auffassung von Kristensen et al. (1990) die zahlreichen freien Kerne im zytologi- schen Präparat erklärt.

Aufgrund von Sauerstoffmangel im Lebergewebe oder aufgrund von Toxinexposition kann es in der Leber zu einer hydrophischen Degeneration kommen (Raskin, 2000). Übersichtsarbeiten beschreiben bei dieser Form von Erkrankung Hepatozyten

(13)

mit einem schaumig aussehendes Zytoplasma (Bolliger, 1996; Ramaiah und Al- leman, 2002), was bedingt ist durch das Anschwellen des Endoplasmatischen Reti- kulums aufgrund von vermehrtem intrazellulären Wasser (Raskin, 2000). Eine ande- re Form der vakuoligen Degeneration ist die Lipidose. Das Zytomorphologische Bild weist klare, gut abgrenzbare Vakuolen auf (Bolliger, 1996; Ramaiah und Alleman, 2002; Raskin, 2000). Die hepatische Lipidose tritt häufig bei Katzen auf und findet sich nur selten bei Hunden (Weiss und Moritz, 2002).

Entzündliche Erkrankungen

Entzündliche Erkrankungen der caninen Leber weisen neben Hepatozyten neutrophi- le Granulozyten, Lymphozyten und Plasmazellen auf (Roth, 2001). Je nach Art der Entzündung können unterschiedliche Zellpopulationen bzw. Entzündungszellinfiltrati- onen auftreten (Stockhaus und Teske, 1997). Während die purulente Hepatitis cha- rakterisiert ist durch das Vorherrschen von neutrophilen Granulozyten im zytologi- schen Präparat, dominieren bei der chronisch aktiven Hepatitis Lymphozyten (Stock- haus und Teske, 1997; Weiss et al., 2002). Makrophagen und/oder neutrophile Gra- nulozyten und Lymphozyten finden sich hingegen bei der gemischtzelligen Entzün- dung (Ramaiah und Alleman, 2002).

Bei der zytologischen Diagnose von Hepatitiden sollte jedoch berücksichtigt werden, ob die Entzündungszellen wirklich eine lokale Entzündungsreaktion widerspiegeln oder das Resultat einer Blutkontamination darstellen (Weiss et al., 2001). Nach Auf- fassung von Raskin (2000) spricht das Vorhandensein einer größeren Menge von neutrophilen Granulozyten im Lebergewebe als im peripheren Blut für eine suppura- tive Hepatitis. Die Hepatozyten können sich bei zytologischen Hepatitispräparaten normal darstellen, sie können allerdings laut Stockhaus et al. (1997) und Kristensen et al. (1990) auch reaktive Kennzeichen aufweisen, wobei die Autoren hier keine wei- tere Angaben machen. Des Weiteren finden sich bei entzündlichen Prozessen der Leber häufig Pigmentablagerungen (Kristensen et al., 1990).

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Kristensen et al. (1990) beschreiben bei caniner Zirrhose maßgeblich das Vorkom- men von reaktiven Hepatozyten, hyperplastischem Gallengangsepithel sowie Cho- lestase. In der zugänglichen veterinärmedizinischen Literatur findet sich eine Origi- nalstudie, welche sich mit der Ermittlung von Zellkriterien für diese Erkrankung be- fasst (Stockhaus et al., 2004). Weiterhin befassten sich Masserdotti und Bertazzolo (2016) mit der Evaluierung von Zellkriterien, welche Hilfestellung bei der Diagnose von caniner hepatischer Fibrose geben sollten. In der zugänglichen Humanmedizini- schen Literatur finden sich zwei Originalstudien, welche sich mit Zellkriterien befas- sen, die die Detektierung einer Leberzirrhose unterstützen sollen (Dominis et al., 1973; Lundquist et al., 1970).

Beim Menschen findet sich häufig, begleitend zum hepatozellulären Karzinom, auch eine Leberzirrhose, was laut Hammer und Sikkema (1995), nur bei 8% der Hunde der Fall ist.

Hepatozelluläres Karzinom

Einer der häufigsten primären caninen Tumorerkrankungen der Leber ist das he- patozelluläre Karzinom (Hammer und Sikkema, 1995). Das zytologische Erschei- nungsbild wird in zahlreichen Übersichtsarbeiten (Patnaik et al., 1981; Ramaiah und Alleman, 2002; Trigo et al., 1982; Weiss et al., 2002) und Buchbeiträgen beschrieben (Arndt und Shelly, 2013; Meyer und Raskin, 2015; Mischke, 2016). Der zugänglichen Literatur lässt sich aber nur eine Originalarbeit zu den zytologischen Kriterien der Leberzellen beim hepatozellulärem Karzinom entnehmen (Masserdotti und Drigo, 2012).

Diese Neoplasie kann an diversen vorliegenden Malignitätskriterien der Zellen er- kannt werden (Meinkoth und Cowell, 2002; Wellmann, 1990). Die betroffenen Zellen weisen häufig Malignitätskriterien wie eine Anisokaryose, ein erhöhtes Nukleus- Zytoplasma-Verhältnis oder auch Anisozytose auf (Weiss et al., 2002). In humanen Studien werden als Merkmal für das hepatozelluläre Karzinom des Menschen häufig ein erhöhtes Nukleus-Zytoplasma-Verhältnis, sowie freie Zellkerne und multinukleäre

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Tumorzellen genannt (Bottles et al., 1990; De Boer et al., 1999; Kulesza et al., 2004;

Tsou et al., 1998). Einige in der Humanmedizin genannten Kriterien zur Diagnose eines hepatozellulären Karzinoms wie zum Beispiel die Pleomorphie von Zellen fin- den in der Tiermedizin weniger Anwendung. Aufgrund der hohen morphologischen Variabilität von caninen Leberzellen, finden sich auch stark pleomorphe Hepatozyten bei nicht neoplastischen Erkrankungen wie reaktiven oder regenerativen Prozessen (Stockhaus und Teske, 1997). Hepatozyten eines gut-differenzierten hepatozellulä- ren Karzinoms sowie eines hepatozellulären Adenoms können z.T. nicht von nor- malen Hepatozten unterschieden werden (Arndt und Shelly, 2013; Gondons und Forouhar, 1984; Trigo et al., 1982). In veterinärmedizinischen Übersichtsarbeiten werden die Zellen des hepatozellulären Adenoms größer als normale Hepatozyten beschrieben (Ponomarkov und Mackey, 1976), wobei eine milde Anisozytose- und karyose (Weiss und Mortiz, 2002) und ein erhöhtes Nukleus-Zytoplasma-Verhältnis (Gondos und Forouhar, 1984; Raskin, 2000) genannt werden.

Das Gallengangskarzinom ist nach dem hepatozellulären Karzinom einer der häu- figsten primären Lebertumoren beim Hund (Hammer und Sikkema, 1995). Häufig kommen hierbei intrahepatische Formen vor (Hayes et al., 1983). Sowohl beim Gal- lengangsadenom (Ponomarkov und Mackey, 1976; Trigo et al., 1982) als auch beim Gallengangskarzinom wird das Zellbild von diversen Übersichtsarbeiten als cuboidal beschrieben wird (Patnaik et al., 1981; Ponomarkov und Mackey, 1976; Rehmtulla, 1974; Trigo et al., 1982; Weiss und Moritz, 2002). Für gewöhnlich finden sich aller- dings beim Gallengangskarzinom nukleäre Malignitätskriterien mit Ausnahme der Nukleoli, welche sich kleiner und undeutlicher darstellen als die des hepatozellulärem Karzinoms (Ramaiah und Allemann, 2002).

Zu den häufigsten hämolymphatischen Tumorerkrankungen der caninen Leber gehört unter anderem das maligne Lymphom (Hammer und Cowell, 1995). Es han- delt sich hierbei, um einen sekundären Lebertumor (Stockhaus und Teske, 1997). Je nach Lymphomart können die Lymphozyten im zytologischen Präparat unterschied- lich aussehen (Weiss, 2002). Im Leberpräparat eines malignen Lymphoms finden

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weisen eine große runde Form auf, mit einem dunkelblauen Zellkern und nur wenig Zytoplasma (Weiss et al., 2002). Neben diesen Zellen können sich auch inflammato- rische Zellpopulationen wie neutrophile Granulozyten, reaktive Lymphozyten oder auch in kleinerer Anzahl Makrophagen oder eosinophile Granulozyten finden (French et al., 1996). Des Weiteren können Leberpräparate eines malignen Lymphoms auch eine extramedulläre Hämatopoese aufweisen (Fry et al., 2003; Sanja und Jelesijevic, 2001). Daher weisen Stockhaus und Teske (1997) darauf hin, dass die Unterschei- dung eines Lymphoms von einer extramedullären Hämatopoese problematisch sein kann (Stockhaus und Teske, 1997).

Eine weitere sekundäre Tumorerkrankung stellt das histiozytäre Sarkom dar. Ne- ben der Milz stellt die Leber eins der am häufigsten infiltrierten Organe dar (Moore et al., 2006). In der zugänglichen veterinärmedizinischen Literatur finden sich diverse Beschreibungen des mikroskopischen Bildes des histiozytären Sarkoms, welche auf histologischen Untersuchungen basieren (Affolter und Moore, 2002; Hayden et al., 1993; Moore und Rosin, 1986; Ramsey et al., 1996; Walton et al., 1996). In Buchbei- trägen (Arndt und Shelly, 2013) werden die Tumorzellen als große runde bis ovale Zellen mit exzentrisch gelegenen ovalen Kernen, mit reichlich Zytoplasma und ein- zelnen Vakuolen beschrieben. Veterinärmedizinische Übersichtsarbeiten beschrei- ben, das Vorkommen von anaplastischen Makrophagen, welche vor allem Anisozy- tose und Anisokaryose aufweisen, und multinukleäre Zellen (Weiss und Moritz, 2002). Auch Stockhaus und Teske (1997) konnten in caninen Leberzytologien histio- zytäre Zellen mit Malignitätskriterien in Form von nierenförmigen Kernen und irregu- lären Nucleoli feststellen. Des Weiteren finden sich in geringen Mengen auch neutro- phile und eosinophile Granulozyten sowie kleine Lymphozyten und Plasmazellen (Brown et al., 1995).

In der zugängigen veterinärmedizinischen Literatur gibt es nur wenige Studien die sich mit der extramedulläre Hämatopoese (EMH) beschäftigen. Nach Auffassung von Johns und Christopher (2012) liegt dies daran, dass die EMH häufig eine Be- gleiterscheinung anderer primärer Erkrankungen darstellt und kaum klinische oder diagnostische Konsequenzen hat. Laut veterinärmedizinischen Übersichtsarbeiten

(17)

(Raskin, 2000; Weiss et al., 2002) finden sich bei einer EMH überwiegend spätere Stadien der Vorläuferzellen der Erythro-, Granulo- und Thrombopoese. Zum Teil kann es schwierig sein, eine myeloproliferative Erkrankung von einer EMH abzu- grenzen (Stockhaus et al., 1997), wobei allerdings bei myeloproliferativen Erkran- kungen vorwiegend die unreifen Zellstadien zu finden sind (Weiss et al., 2002).

Johns und Christopher (2012) nennen vier Gründe für das Vorkommen einer EMH:

1.) Knochenmarkinsuffizienz, 2.) Myelostimulation 3.) Gewebliche Entzündungen, Verletzungen und Reparaturvorgänge 4.) Abnormale systemische oder lokale Che- mokinproduktion. In zwei veterinärmedizinischen Studien wurde das Vorkommen ei- ner EMH im Plexus choroideus (Bienzle et al., 1995) sowie im Zusammenhang mit Mammatumoren (Grandi et al., 2010) untersucht.

2.3 Morphometrie von caninen Leberzellen

2.3.1 Zell- und Kerngrößen

In den zugänglichen veterinärmedizinischen Studien beschäftigten sich drei Studien mit der Vermessung von caninen Hepatozyten mittels eines okularen Mikrometers (Ocqueteau et al., 1989; Stockhaus et al., 2002; Stockhaus et al., 2004). Hierbei konnten Stockhaus et al. (2002), nach Evaluierung verschiedener Altersstufen, einen durchschnittlichen Diameter von 27,7 µm für die gesunde Leberzelle feststellen (Tabelle 1). Die Zellgröße ist laut der Studie von Stockhaus et al. (2002) altersbe- dingten Schwankungen unterlegen und nimmt mit steigendem Alter deutlich zu (Tabelle 1). Ocqueteau et al. (1989) ermittelten einen kleineren Diameter für die Le- berzelle eines Hundes (Tabelle 1), untersuchten dies aber, soweit der Literatur ent- nehmbar, nur an einem Hund (Ocqueteau et al., 1989). Des Weiteren konnten Stockhaus et al. (2002), nach Evaluierung verschiedener Altersstufen, einen durch- schnittlichen Kerndiameter von 9,43 µm bei gesunden Leberzellen feststellen (Tabelle 1). Es konnten für die Kerngröße, anders als für die Zellgröße, keine alters- bedingten Veränderungen evaluiert werden (Stockhaus et al., 2002).

(18)

Beim Vergleich von Kerndiametern von gesunden caninen Hepatozyten mit Kerndi- ametern von Leberzellen, die eine Hepatopathie aufwiesen, fanden sich insgesamt betrachtet, deutliche Unterschiede (Stockhaus et al., 2004). Kerndiameter von Le- bern mit Lymphombeteiligung, mit reaktiver oder akuter Hepatitis unterschieden sich nicht wesentlich von dem Kerndiameter gesunder caniner Hepatozyten (Tabelle 1).

Tabelle 1: Literaturübersicht zu Zell- und Kerndiameter in zytologischen Präparaten der cani- nen Leber.

Kriterium Autor

Score / Auswer- tungs- Methode

Probenumfang Ergebnisse

Statistisch signifikante

Gruppen-

unterschiede (p-Wert)

Diameter

Stockhaus et al., 2002

arithmeti- scher Mittel- wert des Durchmes- sers von 50 Zellen (µm)

Gesund (n=28) Gruppe 1:

1–2 Jahre (n=8) Gruppe 2:

5–6 Jahre (n=10) Gruppe 3:

10–14 Jahre (n=10)

Durchschnittlicher Zelldurchmesser insgesamt: 27,7 µm Gruppe 1:

Zelldurchmesser: 26,2 µm Gruppe 2:

Zelldurchmesser: 27,9 µm Gruppe 3:

Zelldurchmesser: 28,7 µm

0,03 (Einzel- gruppen- vergleich:

signifkante Unterschiede

zwischen allen 3 Gruppen) Durchschnittlicher Kern-

durchmesser insgesamt:

9,43 µm Gruppe 1:

Kerndurchmesser: 9,6 µm Gruppe 2:

Kerndurchmesser: 9,5 µm Gruppe 3:

Kerndurchmesser: 9,3 µm

0,66

Stockhaus et al., 2004

arithmeti- scher Mittel- wert des Durchmes- sers von 50 Kernen (µm)

Gesund (n=28) Hepatopathien (n=73):

Lymphom (n=8) HCC (n=12)

Metastatisches Karzi- nom (n=6)

SIH (n=6) Lipidose (n=1) extrahepatische cho- lestase (n=6) Reaktive Hepatitis (n=10)

Akute Hepatitis (n= 6) Chron. Hepatitis (n=7) Zirrhose (n=8)

destruktive Cholangioli- tis (n=3)

Gesund: 9,43 µm Lymphom: 9,24 µm HCC: 10,42 µm

Metastatisches Karzinom:

8,51 µm SIH: 8,54 µm

Lipidose: keine Angaben Extrahepatische Cholesta- se: 9,37 µm

Reaktive Hepatitis: 9,25 µm Akute Hepatitis: 9,74 µm chron. Hepatitis: 10,07 µm Zirrhose: 13 µm

Destruktive Cholangiolitis:

12,57 µm

Ohne weitere Angaben

(19)

Fortsetzung Tabelle 1

Diameter

Hess et al., 1973

arithmeti- scher Mittel- wert des Durchmes- sers von 3240 Hepatozyten /Nuklei

Gesunde Hunde (n=4)

Kein signifikanter Unter- schied der Oberfläche zwischen Keil- und Feinnadelbiopsien

Ohne weitere Angaben cuboidale Zelle: 26,5 µ

(vermutl. µm) dodecahedrale Zelle: 21 µ

(vermutl. µm) Ohne weitere Angaben Bei Voraussetzung einer

sphärischen Form:

Nukleus: 6,9 µ (vermutl. µm)

Ohne weitere Angaben

Ocqueteau et al., 1989

Messung von drei Hepatozy- tendiametern (D1,D2,D3) bestehend aus jeweils dem arithme- tischen Mit- telwert von 20 Messun- gen

Diverse Säugerarten (n=11) darunter Hund (n=1)

D1: 17,20 µm D2: 15,70 µm D3: 14,70 µm

Ohne weitere Angaben

Fittschen und

Bellamy, 1984

Zellgröße der Hepato- zyten

Kontrollgruppe (n=6) (kein Prednison);

Gruppen (je n=6):

Niedrige orale Gruppe (0,6 mg/kg 2xtgl); Hohe orale Gruppe (2 mg/kg 2xtgl); i.m. Gruppe (4 mg/kg 1xtgl) i.m. Kon- trollgruppe (kein Pred- nison)

Generell waren die Hepato- zyten der niedrigen oralen Gruppe größer als die der Kontrollgruppe. Die Tiere der Intramuskulären Gruppe zeigten die größten Verän- derungen (Nicht Tabellarisch aufgeführt - keine Statistik)

Ohne weitere Angaben

Thompson et al., 1970

Zellgröße der Hepato- zyten

1.Gruppe (n=5): Kon- trolle

2.Gruppe (n=5): erhiel- ten 5mg/kg Kortiso- nacetat.

3.Gruppe (n=5): Subku- tane Kontrollgruppe, erhielten kein Kortison

Alle Hunde der 2.Gruppe wiesen vergrößerte Hepato- zyten auf, teilweise fast zweimal so groß wie norma- le Hepatozyten.

Hunde der 1. Und 3. Gruppe wiesen keine morphologi- schen Veränderungen auf.

Ohne weitere Angaben

HCC: hepatozelluläres Karzinom; SIH: Steroid-induzierte Hepatopathie, vermutl.: vermutlich, i.m.:

intramuskulär; durchschnittl.: durchschnittlicher, kg: Kilogramm, mg: Miligramm

Die Kerne von hepatozellulären Karzinomen wiesen allerdings im Durchschnitt einen Durchmesser auf, der fast um 1 µm größer war als der von gesunden Hepatozyten.

Bei einer Steroid-induzierten Hepatopathie hingegen fanden sich Kerndurchmesser, die im Durchschnitt fast 1 µm kleiner waren als die der gesunden caninen Leberzel-

(20)

Schwellung bedingte Größenzunahme lässt die Zellen auf das Doppelte ihrer Größe anwachsen (Fittschen und Bellamy, 1984; Thompson et al., 1970).Eine weitere tier- medizinische Studie befasste sich mit der Vermessung von caninen Hepatozyten indem, mittels elektronenmikroskopischer Aufnahmen, über welche ein Raster mit 2160 Linien pro Millimeter gelegt wurde, die Zell- und Kerngrößen evaluiert wurden.

Unter Berücksichtigung der Form der Zelle konnten hier unterschiedliche Zell- und Kerndiameter festgestellt werden (Tabelle 1).

Tabelle 2: Literaturübersicht zu Zell- und Kerndiameter in zytologischen Präparaten der hu- manen Leber.

Kriterium Autor

Score / Auswertungs-

methode

Proben-

umfang Ergebnisse

Statistisch signifikante Gruppenunter-

schiede (p-Wert)

Diameter

Yang et al., 2003

Nukleusgröße (normal; normale Abweichung) Zytoplasma Größe (erniedrigt;

deutlich ernied- rigt)

HCC (n=14)

N-neopl.-Leber

(n=14)

HCC:

Zytoplasma Größe:

erniedrigt: n=12;

deutlich erniedrigt: n=2;

Kerngröße:

normal: n=13;

normale Abweichung:

n=1;

N-neopl.-Leber: nicht weiter aufgeführt.

ohne weitere Angaben

Solé et al.,

1993 Kerngröße /

Zellgröße (im Vergleich zu normalen Hepatozyten)

HCC (n=102) N-neopl.-Leber

(n=28)

Gleichmäßig vergrößerte Kerne:

HCC: 63,7 %

N-neopl.-Leber: 10,7 %

<0,0001

Gleichmäßig verkleiner- tes Zytoplasma:

HCC: 29,4 % N-neopl.-Leber: 0 %

<0,005

De Boer et al., 1999

% Anwesenheit von vergrößerten Kernen

(mind. 2x so groß wie normaler Nukleus)

HCC (n=34) Benigne

Läsionen:

(n=27) Intermediäre Läsionen:

(n=9)

HCC: 88 % Intermediäre Läsionen:

89 %

Benigne Läsionen:

26 %

HCC vs. Benigne Läsionen:

<0,0001

HCC: hepatozelluläres Karzinom; N-neopl.: Nicht-neoplastisch

(21)

Die in Tabelle 2 aufgeführten humanmedizinischen Studien befassten sich mit den Schwankungen von Zell- oder Kerngrößen beim humanen hepatozellulären Karzi- nom in Vergleich zu nicht-neoplastischen Veränderungen bzw. zu benignen Hepato- zyten. Zwei dieser Studien konnten eine Verkleinerung des Zytoplasmas beim he- patozellulären Karzinom feststellen (Solé et al.,1993; Yang et al., 2003). Weiterhin konnten zwei Studien signifikant größere Kerne beim hepatozellulären Karzinom feststellen, im Vergleich zur jeweiligen Kontrollgruppe (De Boer et al.,1999; Solé et al., 1993 [Tabelle 2]).

2.4 Leberzellscore Evaluierung

2.4.1 Kernkriterien

2.4.1.1 Zwei-kernige und multinukleäre Zellen

Insgesamt beschäftigten sich in der zugänglichen humanmedizinischen Literatur acht Studien mit dem Kriterium der mehrkernigen Zellen, wobei drei Studien sich nicht nur mit der Anwesenheit von multinukleären Zellen beschäftigten, sondern auch das Vorkommen von zweikernigen Zellen im Leberpräparat untersuchten (Tabelle 3).

Hierbei konnten zweikernige Zellen sowohl in gesunden Leberaspiraten festgestellt werden, als auch in akuter Hepatitis und Zirrhose, in denen auch ein vermehrtes Vorkommen von mulitnukleären Zellen zu verzeichnen war (Lundquist und Akerman, 1970). Weiterhin konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich der Anwesenheit von zweikernigen Zellen bei gutartigen Leberaspiraten im Vergleich zum hepatozellu- lären Karzinom aufgezeigt werden (De Boer et al., 1999).

(22)

Tabelle 3: Literaturübersicht zum Kriterium der zwei-kernigen sowie multinukleären Zellen in zytologischen Präparaten der humanen Leber.

Kriterium Autor

Score/

Auswertungs- Methode

Probenumfang Ergebnisse

Statistisch signifikante

Gruppen- unterschiede

(p-Wert)

zwei-kernige und multinukleäre

Zellen

De Boer et al., 1999

% Anwesenheit des Kriteriums (Binukleation)

HCC (n=34) Gutartige Läsionen (n=27)

Intermediäre Läsionen (n=9)

HCC: 65 % Intermediär: 89 % Benigne: 78 %

HCC vs.

Benigne Läsionen:

<0,40 De Boer et

al., 1999

% Anwesenheit des Kriteriums (Multinukleation)

HCC (n=34) Gutartige Läsionen (n=27)

Intermediäre Läsionen (n=9)

HCC: 38 % Intermediär: 33 % Benigne: 0 %

HCC vs.

Benigne Läsionen:

<0,0001

Wee und

Nilsson, 2003

% Anwesenheit

des Kriteriums (>3 Nuklei)

Benigne FNA (n=22) Problem Fälle (n=3)

G-HCC (n=21) M-HCC (n=39) S-HCC (n=10)

Benign FNA: 0 % Problem Fälle: 1 Fall

G-HCC:19 % M-HCC: 72 % S-HCC: 80 %

Ohne weitere Angaben

Wee et al., 1993

% Anwesenheit von multinukleären Zellen

G-HCC (n=30) M-HCC (n=46) S-HCC (n=16)

G-HCC: 23 % M-HCC: 43 % S-HCC: 75 %

Ohne weitere Angaben Wee et al.,

1990 Anzahl der Proben mit multinukleären Zellen

G-HCC (n=14) M-HCC (n=11) S-HCC (n=3)

G-HCC: 14,29 % M-HCC: 9,1 % S-HCC: 33,3 %

Ohne weitere Angaben Takenaka et

al., 1999

% Anwesenheit des Kriteriums (multinukleäre Zellen)

G-HCC (n=20) M-HCC+ S-HCC

(n=11) Zirrhose (n=17)

G-HCC: 15 % M-HCC+S-HCC:

18 % Zirrhose: 35 %

Ohne weitere Angaben

Solé et al., 1993

% Anwesenheit des Kriteriums (multinukleäre Zellen/ zweikernige Zellen)

HCC (n=102) N-neopl.-Leber

(n=28)

Multinukleäre Zellen:

HCC: 18,6 % N-neopl.-Leber:

3,6 %

Keine weiteren Angaben zu zwei-

kernigen Zellen Ohne weitere

Angaben

Bottles et al., 1988

% Anwesenheit des Kriteriums von multinukleären Tumorzellen

HCC (n=35) Andere Tumoren (AT): (n=74) Darunter Lymphom (n=9)

HCC: 45,7 % Lymphom: 0 %

HCC vs. meta- stasierende

Tumore

>0,1

(23)

Fortsetzung Tabelle 3

zwei-kernige und multinukleäre

Zellen

Lundquist und Aker- man, 1970

% Anwesenheit des Kriteriums von multinukleären /binukleären Zellen

Hepatitis (n=20), Leberzirrhose

(n=20) Gesund (n=10)

Gesund:

Ab und an zwei- kernige Zellen Akute Hepatitis:

Zahlreiche zwei- kernige und multi- nukleäre Zellen Zirrhose:

17 von 20 Proben zeigten bi – oder multinukleäre Zellen

Ohne weitere Angaben

Soyuer et

al., 2002

% Anwesenheit des Kriteriums von multinukleären Tumorzellen

HCC (n=320) metastatische

Tumore (n=705) Benigne/Reaktive Läsionen (n=73)

HCC: 71,3 % metastatische

Karzinome:

29,7 %

Benigne/Reaktive Läsionen: 1,4 %

HCC vs.

Reaktive Läsionen:

<0,0001

HCC: hepatozelluläres Karzinom; G-HCC: gut-differenziertes hepatozelluläres Karzinom;

M-HCC: mittel-differenziertes hepatozelluläres Karzinom; S-HCC: schlecht-differenziertes hepatozellu- läres Karzinom; N-neopl.: Nicht-neoplastisch

In humanmedizinischen Studien wurde das Kriterium der mehrkernigen Zellen über- wiegend semiquantitativ mittels der Anwesenheit (ja /nein) pro Präparat beurteilt (Bottles et al., 1988; De Boer et al., 1999; Lundquist und Akerman, 1970; Solé et al.

1993; Takenaka et al., 1999; Wee und Nilsson, 2003; Wee et al., 1993; Wee et al., 1990). Während gutartige Leberaspirate zum Großteil das Vorkommen von zweiker- nigen Zellen zeigten, konnte übereinstimmend in zwei Studien die Abwesenheit von Zellen mit multipler Kernanzahl in gutartigen Leberaspiraten aufgezeigt werden (Tabelle 3). Vier der Studien konnten eine höhere Anzahl von multinukleären Zellen in mittel- bis schlecht-differenzierten hepatozellulären Karzinomen feststellen, als in gut-differenzierten Leberzellkarzinomen (Takenaka et al., 1999; Wee und Nilsson, 2003; Wee et al., 1993; Wee et al., 1990). Im Vergleich des hepatozellulären Karzi- noms mit gutartigen Leberaspiraten konnten außerdem signifikant mehr multinukleä- re Zellen beim Leberzellkarzinom festgestellt werden (De Boer et al., 1999).

(24)

Des Weiteren weist das hepatozelluläre Karzinom mehr Zellen mit multiplen Kernen auf als ein Lymphom, zeigt aber im Gesamtvergleich zu metastatischen Tumoren keinen signifikanten Unterschied (Bottles et al., 1988). Konträr zu der veterinärmedi- zinischen Studie von Masserdotti und Drigo (2012) beim Hund, konnten Solé et al.

(1993) beim Menschen auch Zellen mit multiplen Kernen in nicht-neoplastischen Le- bererkrankungen nachweisen (Tabelle 3). In zirrhotischen Leberveränderungen konnten zwei Studien ebenfalls in vermehrter Anzahl multinukleäre Zellen nachwei- sen (Lundquist und Akerman, 1970; Takenaka et al. 1999).

Tabelle 4: Literaturübersicht zum Kriterium zwei-kernigen- und multinukleären Zellen sowie der Anzahl von Nuklei pro Zelle in zytologischen Präparaten der caninen Leber.

Kriterium Autor

Score / Auswertungs-

Methode

Probenumfang Ergebnisse

Statistisch signifikante

Gruppen-

unterschiede (p-Wert)

Zwei- kernige-

und multi- nukleäre

Zellen Nuklei pro

Zelle

Masserdotti und Drigo, 2012

Zellen mit multip- len Nuklei (3 oder mehr Kerne /Zelle)

0=keine 1=1/HPF 2=1–3/HPF 3=>3/HPF

HCC (n=15) N-neopl.-Leber (n=15) N-neopl.-Leber:

[normale Leber (n=4), nicht spezifizierte vakuoläre Hepatopa- thie (n=6), suppurati- ve Hepatitis (n=2), chronisch idiopathi- sche Hepatitis (n=3)]

G-HCC:

0= 40 %, 1= 46,7 %,

2= 13,3 % N-neopl.-Leber:

0= 100 %

<0,001

Stockhaus et al., 2004

Durchschnittliche Abweichung der Anzahl Kerne pro Zelle im Vergleich zur Kontrolle

Gesund (n=28) SIH (n=6) Lymphom (n=8) HCC (n=12)

Akute Hepatitis (n=6) Reaktive Hepatitis (n=10)

Gesund: 0 Krank: -0,0617*

*keine Differenzie- rung zw. Den Er- krankungen

0,0072*

*keine Diffe- renzierung zw.

den Erkran- kungen

Stockhaus et al., 2002

Nuklei pro Zelle (Durchschnittliche Anzahl an Nuklei in 100 Zellen)

Gesund (n=28) Gruppe 1:

1– 2 Jahre (n=8) Gruppe 2:

5– 6 Jahre (n=10) Gruppe 3:

10–14 Jahre (n=10)

Gesamtergebnis:

Nuklei Anzahl: 1,21 Gruppe 1:

Nuklei Anzahl: 1,12 Gruppe 2:

Nuklei Anzahl: 1,19 Gruppe 3:

Nuklei Anzahl: 1,31

0,0001 (Einzel- gruppen- vergleich:

signifkante Unterschiede

zwischen allen 3 Gruppen)

G-HCC: gut-differenziertes hepatozelluläres Karzinom; N-neopl.: Nicht-neoplastisch; SIH: Steroid- induzierte Hepatopathie

(25)

In tiermedizinischen Studien wurden mehrkernige Zellen überwiegend quantitativ be- urteilt (Stockhaus et al., 2002; Stockhaus et al., 2004; Masserdotti und Drigo, 2012).

Während Stockhaus et al. (2002; 2004) die Anzahl der Kerne pro Zelle in 100 He- patozyten pro Probe ermittelten, beurteilten Masserdotti und Drigo (2012) die Anzahl von Zellen mit multiplen Kernen pro Gesichtsfeld in 20 zufällig gewählten Gesichts- feldern (400x Vergrößerung) pro Präparat und ordneten diese einem Score von 0

„keine“ bis 3 „>3/HPF“ zu (Tabelle 4). Mittels der Ermittlung der absoluten Kernanz- ahl pro Zelle konnten Stockhaus et al. (2002) aufzeigen, dass die Anzahl der Kerne pro Zelle bei Hunden im Alter signifikant zunimmt (Tabelle 4). Mit derselben Auswer- tungsmethode konnten Stockhaus et al. (2004) eine deutliche Abweichung in der An- zahl der Kerne pro Zelle zwischen gesunden caninen Hepatozyten und Hepatozyten von Hunden mit Hepatopathien feststellen (Tabelle 4). In der Studie von Masserdotti und Drigo (2012), in der pro Gesichtsfeld die Anzahl von Zellen mit multiplen Kernen (mindestens 3 oder mehr Kernen pro Zelle) beurteilt wurde, konnten deutlich mehr multiple Nuklei bei Hunden mit gut-differenziertem hepatozellulärem Karzinom fest- gestellt werden als bei Hunden mit nicht-neoplastischen Hepatopathien (Tabelle 4).

Es fanden sich in dieser Studie keine Zellen mit multiplen Nuklei bei Hunden mit nicht-neoplastischen Hepatopathien, während 47 % der Hunde mit gut- differenziertem hepatozellulärem Karzinom eine, und 13 % zwei Zellen mit multiplen Nuklei pro Gesichtsfeld zeigten (Tabelle 4).

2.4.1.2 Chromatinverteilung

In tiermedizinischen Studien wird das Kernkriterium der Chromatinverteilung über- wiegend quantitativ beurteilt (Stockhaus et al., 2002; Stockhaus et al., 2004; Mas- serdotti und Drigo, 2012). In diesen Studien finden sich verschiedene Arten der quantitativen Auswertung. Während Masserdotti und Drigo (2012) die Chromatinver- teilung von caninen Leberzellen pro Gesichtsfeld auswerteten, beurteilten Stockhaus et al. (2002; 2004) die Chromatinverteilung einer festgelegten Anzahl von Hepatozy- ten (Tabelle 5). Masserdotti und Drigo (2012) beurteilten dabei das Chromatin cani-

(26)

bis 3- „verklumpt“ (Tabelle 5). Die Chromatinmuster wurden in 20 zufällig gewählten Gesichtsfeldern in der 1000x Vergrößerung beurteilt. Stockhaus et al. (2002; 2004) hingegen beurteilten das Chromatin im caninen Leberpräparat anhand von 100 Le- berzellkernen. Das Chromatin der Zellen wurde hierbei entweder als regulär oder irregulär befundet. Die Anzahl der Zellen mit den entsprechenden Chromatinmustern wurde dabei in Prozent angegeben. Bei der Auswertungsmethode von Masserdotti und Drigo (2012) konnten Tendenzen des hepatozellulären Karzinoms zu grobkörni- gem Chromatinmustern festgestellt werden, während die nicht-neoplastischen cani- nen Lebererkrankungen ausschließlich granuläre Chromatinmuster aufzeigten (Mas- serdotti und Drigo, 2012). Bei der Beurteilungsmethode von Stockhaus et al. (2002;

2004) ließen sich ebenfalls Tendenzen zu vermehrtem irregulären Chromatin beim hepatozellulären Karzinom feststellen, wobei im Vergleich von gesunden Leberprä- paraten zu Leberpräparaten von Hunden mit diversen Lebererkrankungen, sich irre- guläre Chromatinmuster signifikant häufiger bei Hunden mit Hepatopathie als bei ge- sunden Tieren fanden (Tabelle 5). Mit steigendem Alter konnte bei gesunden Hun- den eine Tendenz zum vermehrten Aufkommen von irregulären Chromatinmustern festgestellt werden (Tabelle 5), welche allerdings keine statistische Relevanz aufwies (Stockhaus et al., 2002).

In den zugänglichen humanmedizinischen Studien wird das Kriterium der Chromatin- verteilung überwiegend semiquantitativ mittels der Anwesenheit (ja/nein) beurteilt (Solé et al., 1993; Wee und Nilsson, 2003; Takenaka et al., 1999; Cohen et al., 1991, Dominis et al., 1970). Zwei der in Tabelle 6 aufgeführten Studien bewerteten hierbei auch die qualitativen Veränderungen des Chromatins. Dominis et al. (1970) konnten sowohl reguläre als auch irreguläre Chromatinmuster in gesunden Leberpräparaten feststellen, allerdings keine Kondensation oder Schlitze und Vakuolen in den Leber- zellkernen. Letzteres konnte in vermehrtem Aufkommen in Lebern mit Hepatitis nachgewiesen werden (Tabelle 6). Von den zugänglichen humanen Studien unter- suchten zwei die Anwesenheit (ja/nein) von irregulärem Chromatin in nicht- neoplastischen Hepatopathien mit konträren Ergebnissen (Tabelle 6). Während in einer Studie irreguläres Chromatin in 13 % der nicht-neoplastischen Erkrankungen feststellt werden konnte, wurden im Rahmen der anderen Studie keinerlei irreguläre

(27)

Chromatinmuster bei dieser Erkrankungsgruppe nachgewiesen (Cohen et al., 1991;

Solé et al., 1993).

Tabelle 5: Literaturübersicht zum Kriterium „Chromatinverteilungen“ in zytologischen Präpa- raten der caninen Leber.

Kriterium Autor

Score / Auswertungs-

Methode

Probenumfang Ergebnisse

Statistisch signifikante

Gruppen-

unterschiede (p-Wert)

Chromatin- verteilung

Masserdotti und Drigo, 2012

0=kompakt 1=granulär 2=grobkörnig 3=verklumpt

HCC (n=15) N-neopl.-Leber (n=15) N-neopl.-Leber:

[normale Leber (n=4), nicht spezifizierte va- kuoläre Hepatopathie (n=6), suppurative Hepatitis (n=2), chro- nisch idiopathische Hepatitis (n=3)]

G-HCC:

1=80 %

2=20 % N-neopl.-Leber:

1=100 %

0,073

Stockhaus et al., 2004

Hepatozyten mit

irregulärem Chromatin- muster (% aus 100 Zellen)

Gesund (n=28) SIH (n=6) Lymphom (n=8) HCC (n=12)

Akute Hepatitis (n=6) Reaktive Hepatitis (n=10)

Gesund: 8,54 % Erkrankt: 57,4 % SIH: 13,33 % Lymphom: 57,5 % HCC: 69,17 % Akute Hepatitis:

53,33 %

Reaktive Hepatitis:

52 %

Gesund vs Erkrankt:

<0,0001 (kein Einzel- gruppenver-

gleich)

Stockhaus et al., 2002

Hepatozyten mit regulärem oder

irregulärem Chromatin- muster (% aus 100 Zellen)

Gesund (n=28) Gruppe 1:

1– 2 Jahre (n=8) Gruppe 2:

5– 6 Jahre (n=10) Gruppe 3:

10–14 Jahre (n=10)

Gesamtergebnis:

Regulär: 91,5 % Irregulär: 9,5 %

Gruppe 1:

Regulär: 92,78 % Irregulär: 7,22 %

Gruppe2:

Regulär: 91,3 % Irregulär: 8,7 %

Gruppe 3:

Regulär: 89,36 % Irregulär: 10,64 %

0,99

HCC: hepatozelluläres Karzinom; G-HCC: gut-differenziertes hepatozelluläres Karzinom; N-neopl.:

Nicht-neoplastisch; SIH: Steroid-induzierte Hepatopathie

(28)

Tabelle 6: Literaturübersicht zum Kriterium „Chromatinverteilungen“ in zytologischen Präpa- raten der humanen Leber.

Kriterium Autor

Score / Auswertungs-

Methode

Probenumfang Ergebnisse

Statistisch signifikante

Gruppen-

unterschiede (p-Wert)

Chromatin- verteilung

Solé et al., 1993

% Anwesenheit des Kriteriums (irreguläre Chromatinmus- ter/grobkörniges Chromatin)

HCC (n= 102), N-neopl.-Leber

(n=28) HCC:

Irregulär: 37,3 % Grobkörnig: 48 % N-neopl.-Leber:

Irregulär: 0 % Grobkörnig: 14,3 %

irregulär

<0,0005 grobkörnig:

<0,005

Wee und

Nilsson, 2003

% Anwesenheit des Kriteriums (irreguläres Chromatin- muster)

Benigne FNA (n=22) Problem Fälle (n=3) G-HCC (n=21) M-HCC (n=39) S-HCC (n=10)

Benigne FNA: 5 %

Problem Fälle: 0 % G-HCC:24 % M-HCC: 82 % S-HCC: 80 %

Ohne weitere Angaben

Takenaka et

al., 1999

% Anwesenheit des Kriteriums (irreguläres

Chromatin- muster)

G-HCC (n=20) M-HCC+ S-HCC

(n=11) Zirrhose (n=17)

G-HCC:0 % M-HCC+S-HCC:

18 % Zirrhose: 0 %

Ohne weitere Angaben

Cohen et al., 1991

% Anwesenheit des Kriteriums (irreguläres Chromatin- muster)

HCC (n=53) N-neopl.-Leber (n=30)

HCC: 73 % N-neopl.-Leber: 13 %

Ohne weitere Angaben

Dominis et

al., 1973 Anzahl der Pro- ben mit entsprechender Chromatin- verteilung

Gesund (n=36) Krank (n=141):

Zirrhose (n=32) Chron.

Aggressive Hepa- titis (n=78) Fettleber (n=31)

Gesund:

Regulär n=32;

Irregulär n=4;

Kondensation n=0 Schlitze & Vakuolen n=0 Zirrhose:

Regulär n=8 Irregulär n=24 Kondensation n=11 Schlitze & Vakuolen n=8 Hepatitis:

Regulär n=28 Irregulär n=40 Kondensation n=26 Schlitze & Vakuolen n=24 Fettleber:

Regulär n=9 Irregulär n=15 Kondensation n=7 Schlitze & Vakuolen n=4

Ohne weitere Angaben

HCC: hepatozelluläres Karzinom; G-HCC: gut-differenziertes hepatozelluläres Karzinom;

M-HCC: mittel-differenziertes hepatozelluläres Karzinom; S-HCC: schlecht-differenziertes hepatozellu- läres Karzinom; N-neopl.: Nicht-neoplastisch

(29)

Von den in Tabelle 6 aufgeführten Studien beschäftigten sich weiterhin zwei mit der Anwesenheit (ja/nein) von irregulärem Chromatin bei den unterschiedlichen Differen- zierungsgraden eines hepatozellulären Karzinoms (Takenaka et al., 1999; Wee und Nilsson, 2003). Beide Studien konnten eine Tendenz zum vermehrten Aufkommen von irregulären Chromatinmustern bei schlecht-differenzierten hepatozellulären Kar- zinomen feststellen, im Vergleich zum gut-differenzierten Leberzellkarzinomen (Tabelle 6). Bei hepatozellulären Karzinomen konnten weiterhin irreguläre und auch grobkörnige Chromatinmuster deutlich häufiger festgestellt werden als bei nicht- neoplastischen Lebererkrankungen (Solé et al., 1993). Dies deckt sich zum Teil mit der veterinärmedizinischen Studie von Masserdotti und Drigo (2012), die ebenfalls ein vermehrtes Aufkommen von grobkörnigem Chromatin bei Leberzellkarzinomen fanden (Tabelle 6). Des Weiteren finden sich bei zwei Studien, welche sich beide mit der Anwesenheit von irregulären Chromatinmustern bei Leberzirrhose beschäftigten, unterschiedliche Ergebnisse zu dieser Erkrankung. Während die Studie von Dominis et al. (1970) zu einem gewissen Prozentsatz auch irreguläre Chromatinmuster bei Leberpräparaten mit Zirrhose feststellen konnten, wiesen die Leberproben mit Zir- rhose in der Studie von Takenaka et al. (1999) keinerlei irreguläre Chromatinmuster auf (Tabelle 6).

2.4.1.3 Freiliegende Nuklei

Freiliegende Nuklei in Leberpräparaten wurden bisher kaum in veterinärmedizini- schen Studien untersucht. Masserdotti und Drigo (2012) untersuchten das Vorkom- men von freiliegenden Nuklei quantitativ mittels eines Scores von 0- „keine“ bis 3-

„>10/HPF“ (Tabelle 7). Hierbei wurden die freien Zellkerne in 20 zufällig gewählten Gesichtsfeldern mit der 400x Vergrößerung gezählt und der jeweiligen Score- einteilung zugeordnet (Masserdotti und Drigo, 2012). Mittels dieses Scoring-Systems fanden sich signifikant mehr freie Zellkerne pro Gesichtsfeld beim gut-differenzierten hepatozellulären Karzinom, als bei den nicht-neoplastischen Leberveränderungen (Tabelle 7). Freie Zellkerne fanden sich nur zu einem geringen Prozentsatz in Form

(30)

Tabelle 7: Literaturübersicht zum Kriterium „freiliegende Nuklei“ in zytologischen Präparaten der caninen Leber.

Kriterium Autor

Score / Auswertungs-

Methode

Probenumfang Ergebnisse

Statistisch signifikante

Gruppen-

unterschiede (p-Wert)

Freiliegende Nuklei

Masserdotti und Drigo, 2012

0= Keine;

1=1–2/HPF 2=2–10/HPF 3=>10/HPF

G-HCC (n=15) N-neopl.-Leber (n=15):

[normale Leber (n=4), nicht spezifizierte vakuolä- re Hepatopathie (n=6), suppurative Hepatitis (n=2),

chronisch idiopathische Hepatitis (n=3)]

G-HCC:

1= 26,7 %;

2= 33,3 %,

3= 40 % N-neopl.-

Leber:

0= 93,3 %, 1= 6,7 %

0,000

G-HCC: gut-differenziertes hepatozelluläres Karzinom; N-neopl.: Nicht-neoplastisch

In den zugänglichen humanmedizinischen Studien wurden freie Zellkerne überwie- gend semiquantitativ, in Form der Anwesenheit im Präparat, beurteilt (Tabelle 8). Bei den in diesen Studien beurteilten freien Zellkernen, handelt es sich vorwiegend um atypische freie Kerne, also freie Kerne, die Atypien in ihrer Morphologie aufwiesen (Tabelle 8). Einen Score der das Vorkommen der freien Nuklei im Präparat be- schreibt wurde von Pedio et al. (1988) erstellt. Hierbei wurden die Anzahl der freien Kerne im Präparat eines Scoring-Systems von „Keine (-)“ bis „Reichlich (++++)“ zu- gewiesen (Tabelle 8). Mittels dieses Scores ließ sich ein vermehrtes Aufkommen von freien Nuklei beim hepatozellulären Karzinom feststellen, wobei hier die Anzahl der Kerne in keinem Verhältnis zum Differenzierungsgrad des Tumors stand (Pedio et al., 1988). Die weiteren untersuchten Erkrankungen dieser Studie beinhalteten, ne- ben anderen Tumorerkrankungen, auch nicht-neoplastische Lebererkrankungen, wie re- und degenerative Prozesse, Entzündungen oder auch Leberpräparate ohne pa- thologische Veränderungen (Tabelle 8). Pedio et al. (1988) konnten, im Gegensatz zu der tiermedizinischen Studie von Masserdotti und Drigo (2012), auch bei diesen Erkrankungen, wenn z. T. auch nur sporadisch, freie Kerne feststellen (Tabelle 8).

(31)

Zwei der in Tabelle 8 aufgeführten Studien konnten übereinstimmend ein signifikant höheres Vorkommen von freien Nuklei bei humanen Leberzellkarzinomen, als bei nicht-neoplastischen Lebererkrankungen feststellen. Die Anwesenheit von freien Nuklei bei Leberzellkarzinomen im Vergleich zu gutartigen Leberaspiraten wurde von vier Studien untersucht, wovon zwei ein signifikant höheres Vorkommen von freien Nuklei beim Leberzellkarzinom feststellen konnten (Das, 1999; De Boer et al., 1999).

In den vier Studien die sich mit dem Vorkommen von freien Kernen bei den unter- schiedlichen Differenzierungsgraden des hepatozellulären Karzinoms beschäftigten, finden sich unterschiedliche Ergebnisse. Zwei dieser Studien können eine Tendenz zum höheren Aufkommen von freien Kernen beim schlecht-differenzierten, im Ver- gleich zum gut-differenzierten, Leberzellkarzinom feststellen, wohingegen die ande- ren beiden Studien konträr dazu ein höheres Vorkommen beim gut-differenzierten im Vergleich zum schlecht-differenzierten Leberzellkarzinom verzeichnen konnten (Tabelle 8).

Solé et al. (1993) betrachteten freie Kerne in Präparaten von humanen hepatozellulä- ren Karzinomen im Vergleich zu nicht-neoplastischen Lebererkrankungen. Sie ermit- telten zunächst deren relatives Vorkommen im Präparat und verzeichneten in 30 Fäl- len eines hepatozellulären Karzinoms und in 2 Proben der nicht-neoplastischen Le- berpräparate freie Leberzellkerne von >25 %. Jedoch wurde innerhalb der Studie festgestellt, dass wenn lediglich die Anwesenheit der freien Kerne beurteilt wurde, signifikantere Ergebnisse zu erwarten sind (Solé et al., 1993).

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