Vergleichende Expressionsanalyse von XHes2, XHairy1, XHairy2b und ESR1

Das interessante und bisher nicht beschriebene Expressionsmuster von XHes2 während der Embryonalentwicklung, besonders in Regionen der Neurogenese, machte XHes2 zu einem guten Kandidaten für weitere Analysen. Da auch andere bHLH-O-Gene während der Entwicklung des Nervensystems von Xenopus laevis exprimiert werden, wurde zur Herausstellung von Ähnlichkeiten und Unterschieden die Expression von XHes2 mit der Expression von Xhairy1, Xhairy2b (Davis et al., 2001; Tsuji et al., 2003; Taelman et al., 2004) und ESR1 (Perron et al., 1998; Schneider et al., 2001) in drei verschiedenen Embryonalstadien mittels wmISH verglichen (Abb.2-7A).

Während XHes2 zu Beginn der Neurulation im Stadium 13,5 nur schwach in zwei schmalen Domänen am lateralen Rand der Neuralplatte exprimiert wird, die sich vermutlich im Bereich der Ohrplakoden befinden (Abb.2-7A1, Abb.2-5F), sind die Expressionsmuster von Xhairy1, Xhairy2b und ESR1 in diesem Stadium bereits weitaus komplexer (Abb.2-7A5,9,13). Xhairy1-Transkripte sind ebenfalls im Bereich der Ohrplakoden am lateralen Rand der Neuralplatte zu finden, sowie an der Abgrenzung der anterioren Neuralplatte zur Haftdrüse, des Vorderhirns zum Mittelhirn und der anterioren zur posterioren Neuralplatte, in der Bodenplatte des späteren Neuralrohrs und in einem Streifen zwischen späteren Inter- und Motorneuronen (Abb.2-7A5). Xhairy2b wird in der Bodenplatte und der gesamten Grenze der anterioren und lateralen Neuralplatte exprimiert, besonders breit im Bereich der anterioren Neuralfalten (Abb.2-7A9). ESR1-positive Zellen befinden sich im Stadium 13,5 im präsomitischen Mesoderm und in Regionen der primären Neurogenese in der posterioren Neuralplatte, im ventralen Vorderhirn und in den trigeminalen Plakoden (Abb.2-7A13). Somit scheint es keine Überlappung der Expression von XHes2 und ESR1, sowie von Xhairy1 und ESR1 zu geben. Inwieweit die Expressionsdomänen von XHes2, Xhairy1 und Xhairy2b im Bereich der Ohrplakoden am lateralen Rand der Neuralplatte im Stadium 13,5 überlappen, ist in diesem Expressionsvergleich in verschiedenen Embryonen nicht genau bestimmbar, könnte aber durch eine Doppel-wmISH analysiert werden.

Im Stadium 24, in dem das Neuralrohr bereits geschlossen ist, befinden sich die dominanten Expressionsdomänen von XHes2 in der späteren Retina und der dorsalen Ohrplakode, aber auch in Riechplakoden und Hirn sind XHes2-positive Zellen vorhanden (Abb.2-7A2,3, Abb.2-5K). ESR1 wird ähnlich wie XHes2 in der späteren Retina und den Riechplakoden exprimiert, allerdings sind die Domänen größer und die Expression erscheint stärker. ESR1-Transkripte sind aber auch im präsomitischen Mesoderm, in einigen Hirnnerven und vor allem im Neuralrohr, ausgenommen der Grenzen zwischen

Vorder-, Mittel-, Hinterhirn und Rückenmark, zu finden (Abb.2-7A14,15). Xhairy1-positive Zellen sind ebenfalls in der späteren Retina detektierbar, stärker ist die Expression allerdings im anterioren Teil des Auges, dem Augenbecher, und im Augenstiel, sowie im ventralen Bereich der Ohrplakoden. Außerdem wird Xhairy1 in bestimmten Abschnitten im Neuralrohr, in Neuralleistenzellen, der Epidermis und entstehenden Somiten exprimiert (Abb.2-7A6,7). Xhairy2b-Transkripte sind vor allem in den dorsalen Bereichen der Augen, im Neuralrohr und in Neuralleistenzellen, sowie in Vorniere und entstehenden Somiten vorhanden (Abb.2-7A10,11). Um die Expressionsdomänen im Bereich der Ohrplakode und des Auges im Stadium 24 näher zu charakterisieren, wurde die XHes2-Expression mit der Expression von XHairy1, ESR1, X-Ngnr-1 und NeuroD mittels Doppel-wmISH verglichen (Abb.2-7B). Die Expression von XHes2 im dorsalen Anteil der Ohrplakode überlappt weder mit der Expression von XHairy1 in der ventralen Ohrplakode (Abb.2-7B1), noch mit den Expressionen von ESR1 (Abb.2-7B2), X-Ngnr-1 (Abb.2-7B3) und NeuroD (Abb.2-7B4) in den sich ausbildenden Hirnnerven (Trigeminus). In der Region der späteren Retina scheint sich dagegen die XHes2-Expression mit den Expressionen von XHairy1 (Abb.2-7B1), ESR1 (Abb.2-7B2), X-Ngnr-1 (Abb.2-7B3) und NeuroD (Abb.2-7B4) zu überschneiden, was allerdings durch Schnitte bestätigt werden müßte. Der Expressionsvergleich im Stadium 24 zeigt, dass die vier untersuchten bHLH-O-Gene spezifische Muster mit teilweise überlappenden, aber auch mit benachbarten, klar gegeneinander abgegrenzten Expressionsdomänen besitzen.

Ähnlichkeiten und Unterschiede in der Expression zeigen sich auch im Stadium 39.

Während XHes2 (Abb.2-7A4, Abb.2-5O,P,W) und ESR1 (Abb.2-7A16) im Bereich der ciliären Marginalzone exprimiert werden, die sich teilende Vorläuferzellen, aber keine Stammzellen enthält, werden Xhairy1 (Abb.2-7A8) und Xhairy2b (Abb.2-7A12) vorwiegend in der peripheren Region der ciliären Marginalzone exprimiert, der sich teilende Stammzellen enthält und direkt an die sich entwickelnde Linse angrenzt. Zudem wird XHes2 (Abb.2-7A4, Abb.2-5M,P,U) im dorsalen Ohrvesikel und Xhairy1 (Abb.2-7A8) im ventralen Ohrvesikel exprimiert, Transkripte von Xhairy2b (Abb.2-7A12) und ESR1 (Abb.2-7A16) sind nicht detektierbar. Weitere Expressionsunterschiede finden sich in ZNS, Seitenliniensystem, Epidermis, Kiemenbögen und Pankreas.

Insgesamt wird durch den Expressionsvergleich deutlich, dass XHes2 während der Entwicklung des Nervensystems von Xenopus laevis, besonders durch die markante Transkription in dorsaler Ohrplakode und Retina, ein spezifisches Expressionsmuster besitzt, dass sich von den Expressionsmustern der bHLH-O-Gene Xhairy1, Xhairy2b und ESR1 unterscheidet.

Diese Unterschiede in der Expression lassen vermuten, dass die Transkription von XHes2, Xhairy1, Xhairy2b und ESR1 während der Embryonalentwicklung durch

2. Ergebnisse 35

verschiedene Faktoren reguliert wird, und dass die vier bHLH-O-Gene unterschiedliche Aufgaben bei der Ausbildung des Nervensystems übernehmen.

Abb.2-7: Das Expressionsmuster von XHes2 unterscheidet sich von dem verwandter bHLH-O-Gene.

(A) Vergleichende Expressionsanalyse von XHes2, Xhairy1, Xhairy2b und ESR1 während der Neurogenese von Xenopus laevis mittels wmISH. Die Embryonalstadien sind oberhalb der Fotos und die untersuchten Genexpressionen links der Fotos angegeben. Die Embryonen sind wie folgt orientiert: (A1,5,9,13) dorsale Ansicht, anterior unten; (A2,4,6,8,10,12,14,16) laterale Ansicht, anterior links; (A3,7,11,15) anteriore Ansicht, dorsal oben. (B) Vergleichende Expressionsanalyse von XHes2, XHairy1, ESR1, X-Ngnr-1 und NeuroD im St.24 von Xenopus laevis-Embryonen mittels Doppel-wmISH. Das Embryonalstadium ist links der Fotos und die untersuchten Genexpressionen sind oberhalb der Fotos angegeben (XHes2, rot; zweites Gen, braun). Die Embryonen sind wie folgt orientiert: laterale Ansicht, anterior links. Abkürzungen: ab, Augenbecher; anf, anteriore Neuralfalten; anpg, Abgrenzung der anterioren Neuralplatte zur Haftdrüse; apg, Abgrenzung der anterioren zur posterioren Neuralplatte;

as, Augenstiel; bp, Bodenplatte; da, dorsales Auge; dop, dorsale Ohrplakode; dov, dorsaler Ohrvesikel; epi, Epidermis; eso, entstehende Somiten; hn, Hirnnerven; hzus, Zellen im Hirn unbekannter Spezifität; img, Streifen zwischen späteren Inter- und Motorneuronen; is, intermediärer Streifen späterer Interneuronen; kb, Kiemenbögen;

ls, lateraler Streifen späterer sensorischer Neuronen; ms, medialer Streifen späterer Motorneuronen; nlz, Neuralleistenzellen; npeg, Neuralplatten-Ektoderm-Abgrenzung; nr, Neuralrohr; op, Ohrplakode; pa, Pankreas; psm, präsomitisches Mesoderm; ret, spätere Retina; rp, Riechplakode; sCMZ, ciliäre Marginalzone mit sich teilenden Stammzellen; sls, Seitenliniensystem; tp, trigeminale Plakode; vCMZ, ciliäre Marginalzone mit sich teilenden Vorläuferzellen; vmhg, Abgrenzung des Vorderhirns zum Mittelhirn; vn, Vorniere; vop, ventrale Ohrplakode; vov, ventraler Ohrvesikel; vvh, ventrales Vorderhirn.