Effekte der induzierbaren XHes2-Varianten in frühen Schwanzknospenstadien

Um die Funktion von XHes2 in späteren Entwicklungsstadien, besonders hinsichtlich der frühen Retinogenese, zu analysieren, wurden die Effekte von im Midneurulastadium induzierten XHes2-Varianten auf die Expression von NeuroD und Pax2 in frühen Schwanzknospenstadien mittels wmISH analysiert (Abb.2-15, Tab.2-4). NeuroD schien zur Beurteilung der Effekte auf die spätere Neurogenese interessant, da es u.a. in differenzierenden Retinoblasten der undifferenzierten neuralen Retina exprimiert wird (Kanekar et al., 1997); auch XHes2 wird in der undifferenzierten Retina exprimiert. Zudem wurde die NeuroD-Transkription in Neurulastadien durch ektopisches XHes2 reprimiert und durch ektopisches XHes2-ΔW-VP16 aktiviert. Pax2, das, ähnlich wie XHes2, u.a. in der dorsalen Ohrplakode exprimiert wird (Heller und Brändli, 1997), wurde dagegen sowohl durch die Überexpression von XHes2 als auch durch ektopisches XHes2-ΔW-VP16 in Neurulastadien gehemmt und zeigte somit ein von NeuroD abweichendes Verhalten in der Transkriptionsregulation durch XHes2.

Die Induktion von XHes2-GR im Stadium 17 resultierte unerwarteterweise in keiner signifikanten Veränderung der NeuroD-Expression im Stadium 26 (Abb.2-15B1,2).

Allerdings zeigte ein kleiner prozentualer Anteil der induzierten und der nicht-induzierten Embryonen eine Reduktion NeuroD-positiver Zellen auf der injizierten Seite, was auf eine unvollständige Inaktivierung des Fusionsproteins zurückzuführen sein wird (Tab.2-4).

Ähnliche Ergebnisse wurden in Embryonen beobachtet, die im Stadium 30 analysiert wurden (Daten nicht gezeigt). Selbst bei früherer Induktion von XHes2-GR im Stadium 11 konnte nur in ungefähr der Hälfte der Embryonen im Stadium 30 eine vorwiegend partielle Reduktion der NeuroD-Expressionsdomänen beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).

Auch die Expression von Pax2 wies infolge der Induktion von XHes2-GR im Stadium 17, wie die von NeuroD, keinerlei Veränderungen im Stadium 26 auf (Abb.2-15C1,2). Diese Daten sprechen gegen eine Repression von NeuroD und Pax2 durch im Stadium 17 induziertes XHes2-GR in der Retina früher Schwanzknospenstadien. Die Überexpression von induziertem NLS-XHes2-DBM-GR hatte, wie XHes2-GR, keinen Einfluß auf die NeuroD-Transkription (Abb.2-15B5,6). Dies konnte jedoch nicht interpretiert werden, da bei der Induktion von XHes2-GR kein Effekt beobachtet wurde.

Im Gegensatz dazu bedingte die Induktion von XHes2-ΔW-GR und XHes2-ΔW-VP16-GR im Stadium 17 eine deutliche Veränderung der NeuroD-Expression in frühen Schwanzknospenstadien. Infolge der Induktion von XHes2-ΔW-GR war die Anzahl NeuroD-positiver Zellen innerhalb der Expressionsdomänen deutlich erhöht

(Abb.2-2. Ergebnisse 55

15B7,8), was darauf hindeutet, dass aktives, ektopisches XHes2-ΔW-GR durch das Fehlen des WPRW-Motivs eine endogene Repression der NeuroD-Transkription in der

2. Ergebnisse 57

Abb.2-15: Die Induktion von XHes2-ΔW-VP16-GR im späten Neuralfaltenstadium aktiviert die NeuroD-Transkription ektopisch und reprimiert die Pax2-NeuroD-Transkription in frühen Schwanzknospenstadien.

Auswirkungen von in St.17 induzierten XHes2-Varianten auf die Expression von NeuroD und Pax2 in St.26-Embryonen analysiert mittels wmISH. (A) Schematische Darstellung der experimentellen Strategie.

Verschiedene RNAs (siehe 15B) wurden im animalen, polnahen Bereich in eine Blastomere des Zwei-Zell-Stadiums (St.2) von Xenopus laevis-Embryonen injiziert. Im St.17 wurde zu der Hälfte der injizierten Embryonen Dexamethason zur Induktion der Fusionsproteine hinzugefügt, während die andere Hälfte unbehandelt blieb. Induzierte und nicht-induzierte Embryonen wurden dann bis zum Erreichen des Stadiums 26 kultiviert und mittels wmISH analysiert. (B,C) wmISH-Analyse nach Überexpression Hormon-induzierbarer XHes2-Varianten. (B)NeuroD-Expression. (1) Bei Induktion von XHes2-GR im Stadium 17 ist die Expression von NeuroD unverändert. (3) Induziertes XHes2-ΔW-VP16-GR aktiviert die NeuroD-Transkription ektopisch in ZNS, Neuralleisten und Ektoderm. (5) Die Induktion von NLS-XHes2-DBM-GR hat keinen Einfluß auf NeuroD. (7) Induziertes XHes2-ΔW-GR erhöht die Dichte NeuroD-positver Zellen innerhalb der Expressionsdomänen. (B2,4,6,8) Ohne Dexamethason-kultivierte Embryonen zeigen keine Veränderung der NeuroD-Expression. (C) Pax2-Expression. (1) In St.17 induziertes XHes2-GR hat keinen Einfluß auf das Pax2-Expressionsmuster. (3) Die Induktion von XHes2-ΔW-VP16-GR blockiert die Transkription von Pax2.

(C2,4) Ohne Dexamethason-kultivierte Embryonen zeigen keine Veränderung der Pax2-Expression. Die injizierten RNAs sind jeweils über den Fotos und die untersuchten Genexpressionen jeweils links der Fotos angegeben. Ob die Embryonen mit Dexamethason (+Dex) oder ohne (-Dex) als Vergleichspool kultiviert wurden, ist rechts der Fotos dargestellt. Die Embryonen sind wie folgt orientiert: Seitenansicht, dorsal oben.

Abkürzungen und Symbole: nis, nicht-injizierte Seite; is, injizierte Seite; schwarzer Pfeil, Trigeminus (B) oder Ohrvesikel (C); graue Pfeilspitze, Retina; schwarze Pfeilspitze, ektopische Expression in Hirn und Rückenmark (B) oder Expression in Mittel-/Hinterhirn-Grenze (C); weiße Pfeilspitze, ektopische Expression in Epidermis.

injizierte RNA XHes2-GR NLS-XHes2-DBM-GR XHes2-ΔW-GR XHes2-ΔW-VP16-GR

Menge (pg) 50 50 50 50

Tab.2-4: Effekte überexprimierter induzierbarer XHes2-Varianten in St.26-Embryonen. Abkürzungen und Symbole: St., Stadium; +Dex, Induktion mit Dexamethason; -Dex, keine Induktion mit Dexamethason; Anzahl NeuroD, Anzahl der mittels wmISH (NeuroD-Expression) analysierten Embryonen; =, Expression unverändert;

↓, weniger bis keine positiven Zellen in Expressionsdomäne; ↑, mehr positive Zellen in Expressionsdomäne;

a, animal; n.a., nicht analysiert; *, ektopische Expression in Neuroektoderm und Ektoderm.

undifferenzierten Retina unterbinden kann. Induziertes XHes2-ΔW-VP16-GR war fähig, die NeuroD-Transkription ektopisch in nahezu allen Zellen neuroektodermaler und ektodermaler Derivate, wie ZNS, Augen, Neuralleisten und Epidermis, zu aktivieren (Abb.2-15B3,4). Dies zeigt, dass die ektopische Expression von NeuroD durch antimorphe XHes2-Varianten, wie XHes2-ΔW-VP16, nicht nur auf das Ektoderm begrenzt ist. Die Pax2-Transkription wurde hingegen durch im Stadium 17 induziertes XHes2-ΔW-VP16-GR in frühen Schwanzknospenstadien reprimiert (Abb.2-15C3,4), was auf einen anderen Regulationsmechanismus durch XHes2 hinweist.

Da diese Effekte auf die NeuroD- bzw. Pax2-Expression im Widerspruch zu den oben beschriebenen Ergebnissen mit der XHes2-GR-Variante stehen, sind weitere Experimente notwendig, um zu klären, ob die Induktion von überexprimiertem XHes2-GR im Stadium 17 tatsächlich keinen Effekt auf die NeuroD- und Pax2-Expression im Stadium

26 hat und, wenn dies zutrifft, bis zu welchem Induktionsstadium eine Repression von NeuroD und Pax2 möglich ist.

2.2.5.2.2 Effekte von induzierbarem XHes2-ΔC-VP16-GR in ektodermalen