Analysen zur Regulation der XHes2-Expression

Mehrere Studien in Xenopus laevis und anderen Vertebraten haben gezeigt, dass die Transkription von einigen bHLH-O-Genen durch Faktoren positiv reguliert werden kann, die Schlüsselfunktionen bei der Neurogenese übernehmen, wie Neurogenin oder Notch (Koyano-Nakagawa et al., 1999; Koyano-Nakagawa et al., 2000; Davis und Turner, 2001;

Iso et al., 2003). Neurogenin/X-Ngnr-1 fördert die neuronale Differenzierung (Ma et al., 1996), während die Aktivierung des Notch-Signalwegs die neuronale Differenzierung verhindert (Chitnis et al., 1995).

2.2.4.1Regulation der XHes2-Expression durch den Notch-Signalweg

Da nicht alle bHLH-O-Gene durch die Aktivierung des Notch-Signalwegs induzierbar sind, wie z.B. das Maus-Hes2-Gen und das Hes6-Gen aus Maus und Xenopus (Nishimura et al., 1998; Koyano-Nakagawa et al., 2000), galt es zu klären, ob die XHes2-Expression durch Notch stimuliert werden kann. Um dies zu untersuchen, wurden Komponenten des Notch-Signalwegs in Xenopus-Embryonen überexprimiert und die Effekte auf die XHes2-Transkription mittels RT-PCR in animalen Kappen (Abb.2-8) und mittels wmISH in Embryonen (Abb.2-9; Tab.2-1) analysiert.

Die ektopische Expression von Notch-ICD, einer konstitutiv-aktiven Form des X-Notch-1-Rezeptors (Coffman et al., 1993), führt weder in neuralisierten animalen Kappen (Abb.2-8B, Spur 9 vs. 7) noch in naiven animalen Kappen (Abb.2-(Abb.2-8B, Spur 5 vs. 3) zu einer gesteigerten XHes2-Transkription. Vielmehr scheint das Expressionsniveau von XHes2 in den Explantaten infolge der Überexpression von Notch-ICD leicht erniedrigt zu sein.

Bekannte Notch-Zielgene, wie ESR7 (Koyano-Nakagawa et al., 2000), werden im Unterschied zu XHes2 im neuralisierten und nicht-neuralisierten animalen Kappenektoderm induziert (Abb.2-8B, Spur 9 vs. 7; Spur 5 vs. 3).

In Embryonen verursacht die Überexpression von Notch-ICD und X-Su(H)-Ank, einer konstitutiv-aktiven Form von X-Su(H) (Wettstein et al., 1997), eine schwache ektopische Transkriptionsaktivierung von XHes2 ausschließlich im Randbereich der Neuralplatte, nicht aber innerhalb der Neuralplatte oder im gesamten Ektoderm (Abb.2-9B1,2,4,5;

Tab.2-1).

Diese Daten sprechen dafür, dass XHes2 kein direktes Notch-Zielgen, wie z.B. ESR7, ist.

Allerdings scheinen einige Zellen im Randbereich der Neuralplatte die Kompetenz zu besitzen, infolge des Notch-Signals die XHes2-Transkription aktivieren zu können.

2. Ergebnisse 37

2.2.4.2Regulation der XHes2-Expression durch X-Ngnr-1

Neben den bekannten Notch-Zielgenen, wie z.B. ESR7, kann auch XHes6, das kein Notch-Zielgen ist, durch den frühen Determinierungsfaktor X-Ngnr-1 induziert werden (Koyano-Nakagawa et al., 2000). Um der Frage nachzugehen, ob XHes2 durch X-Ngnr-1 reguliert wird, wurde X-Ngnr-1 in Xenopus-Embryonen überexprimiert und die Effekte auf die XHes2-Transkription mittels RT-PCR in animalen Kappen (Abb.2-8) und mittels wmISH in Embryonen (Abb.2-9) analysiert.

Die Überexpression von X-Ngnr-1 bewirkt sowohl in naiven, nicht-neuralisierten animalen Kappen als auch in neuralisierten animalen Kappen (Abb.2-8B, Spur 4 vs. 3, Spur 8 vs. 7) eine signifikante Hochregulation der XHes2-Expression. Durch die gleichzeitige Überexpression von Notch-ICD läßt sich die durch X-Ngnr-1 induzierte Erhöhung des XHes2-Expressionsniveaus jedoch verhindern (Abb.2-8B, Spur 6 vs. 4, Spur 10 vs. 8).

Die Transkription von ESR7 wird hingegen bei Coexpression von Notch-ICD und X-Ngnr-1 in naiven und neuralisierten Kappen stark aktiviert (Abb.2-8B, Spur 6 vs. 4, Spur X-Ngnr-10 vs.

8), allerdings induziert Notch-ICD allein bereits die Expression von ESR7 (Abb.2-8B, Spur 5 vs. 3, Spur 9 vs. 7).

In Embryonen resultiert die ektopische Expression von X-Ngnr-1 einerseits in der Hemmung der endogenen XHes2-Transkription, andererseits aber auch in der Induktion von XHes2 in isolierten Zellen vorwiegend im Ektoderm, vereinzelt im Neuroektoderm (Abb.2-9A1,2; Tab.2-1).

Tab.2-1: Einfluß von X-Ngnr-1 und Notch-Aktivierung auf die XHes2-Expression in Embryonen.

Abkürzungen und Symbole: a, animal; d, dorsal; n, Anzahl analysierter Embryonen; N-tub, N-tubulin; St., Stadium; =, Expression unverändert; ↓, weniger bis keine positiven Zellen in Expressionsdomäne; ↑, mehr positive Zellen in Expressionsdomäne; (*), ektopisch in wenigen einzelnen Zellen im Ektoderm; *, ektopisch in einzelnen Zellen im Ektoderm und Neuroektoderm; **, ektopisch in Neuroektoderm und Ektoderm; ***, schwache ektopische Expression nur im Grenzbereich von Neuroektoderm und Ektoderm. Bei mehr als 100%

zeigt ein Teil der Embryonen eine Kombination von Reduktion und ektopischer Expression in einzelnen Zellen.

Abb.2-8: X-Ngnr-1 und Notch haben unterschiedliche Effekte auf die XHes2-Transkription in animalen Kappen.

Untersuchungen zur Regulation der XHes2-Expression durch X-Ngnr-1 und Notch-ICD in naivem und durch Noggin neuralisiertem animalen Kappenektoderm mittels semiquantitativer RT-PCR. (A) Schematische Darstellung der experimentellen Strategie. Verschiedene Kombinationen von RNAs (siehe 8B) wurden im animalen, polnahen Bereich in beide Blastomeren des Zwei-Zell-Stadiums (St.2) von Xenopus laevis-Embryonen injiziert, animale Kappen (AKE) wurden im Stadium 9 (St.9) isoliert und solange kultiviert bis nicht-injizierte Kontrollembryonen (E) das Stadium 15 (St.15) erreichten. Die aus animalem Kappenektoderm und Kontrollembryonen gewonnenen RNA-Präparationen wurden dann mittels semiquantitativer RT-PCR analysiert. (B) RT-PCR-Analyse. Im naiven AKE und in durch Noggin neuralisierten Explantaten wird die XHes2-Expression durch X-Ngnr-1 signifikant hochreguliert (Spur 4 vs. 3 und Spur 8 vs. 7). Notch-ICD hat hingegen einen leicht inhibitorischen Effekt auf die Transkription von XHes2 (Spur 5 vs. 3 und Spur 9 vs. 7) und verhindert die durch X-Ngnr-1 induzierte Erhöhung des XHes2-Expressionsniveaus (Spur 6 vs. 4 und Spur 10 vs. 9). Die Kombinationen der injizierten RNAs sind über den jeweiligen DNA-Spuren angegeben.

Wasser (H2O) wurde anstelle von RNA als Negativkontrolle (Spur 1) und St.15-RNA als Positivkontrolle (Spur 2) eingesetzt. Alle RNA-Präparationen sind frei von Verunreinigungen mit genomischer DNA (nicht gezeigt).

Zur Überprüfung der eingesetzten RNA-Menge wurde die Expression von Histon H4 analysiert. Injizierte animale Kappen wurden mit den entsprechenden nicht-injizierten oder neuralisierten Explantaten verglichen.

Die Effektivität der RNA-Injektionen wurde mit direkten oder indirekten Zielgenen der überexprimierten Faktoren kontrolliert: X-Ngnr-1 mit N-tubulin und ESR7 (Spur 4 vs. 3, Spur 8 vs. 7: Aktivierung), Notch-ICD mit ESR7 (Spur 5 vs. 3, Spur 9 vs. 7: Aktivierung) und Noggin mit epidermalem (epi.) Keratin (Spur 7-10 vs. 3-6:

Hemmung). RNA/Embryo: 100pg X-Ngnr-1, 300pg Notch-ICD, 500pg Noggin. RT-PCR-Primer/Produktlängen epidermales Keratin: epi.Keratin_RTF/epi.Keratin_RTR/217bp, ESR7: ESR7_RT1F/ESR7_RT1R/212bp, Histon H4: H4_RTF/H4_RTR/188bp, N-tubulin: N-tubulin_RTF/N-tubulin_RTR/250bp, XHes2:

Hes2_RT1F/Hes2_RT1R/ 269bp.

2. Ergebnisse 39

Abb.2-9: X-Ngnr-1 und Notch regulieren die XHes2-Expression zelltypabhängig in Xenopus-Embryonen.

Effekte der X-Ngnr-1-Überexpression und der ektopischen Aktivierung des Notch-Signalwegs auf die XHes2-Expression in Xenopus laevis-Embryonen analysiert mittels wmISH. (A) Schematische Darstellung der experimentellen Strategie. Verschiedene RNAs (siehe 9B) wurden im animalen, polnahen Bereich in eine Blastomere des Zwei-Zell-Stadiums (St.2) von Xenopus laevis-Embryonen injiziert. Diese wurden bis zum Stadium 14/15 kultiviert und mittels wmISH analysiert. (B) Exogenes X-Ngnr-1, das die neuronale Differenzierung fördert und N-tubulin ektopisch aktiviert (B3; Aktivitätskontrolle), unterdrückt einerseits die endogene XHes2-Expression, aktiviert andererseits aber auch die XHes2-Transkription in einzelnen Zellen im Ektoderm und im Neuroektoderm (B1,2). (C) Die ektopische Aktivierung des Signalwegs durch Notch-ICD und X-Su(H)-Ank, die die neuronale Differenzierung hemmt und die Expression von X-MyT-1 reprimiert (C3,6; Aktivitätskontrollen), bewirkt eine schwache ektopische Expression nur im Grenzbereich von Neuroektoderm und Ektoderm (C1,2,4,5). (B,C) Die injizierten RNAs und deren Mengen sind jeweils über den Fotos und die untersuchten Genexpressionen jeweils links der Fotos angegeben. Die Embryonen sind wie folgt orientiert: dorsale Aufsicht, anterior ist unten. Teilbereiche der injizierten Seiten (B1,C1,C4) sind vergrößert dargestellt (B2,C2,C4). Abkürzungen und Symbole: is, injizierte Seite; nis, nicht-injizierte Seite;

schwarzer Pfeil, Ohrplakode (B1,2,C1,2,4,5) bzw. trigeminale Plakode (C3,6); schwarze Pfeilspitze, Expressionsdomäne differenzierender bzw. differenzierter sensorischer Neuronen; weiße Pfeilspitze, ektopische Expression.