Räumlich-zeitliche Expressionsanalyse von XHes2 während der Embryogenese

Um die räumliche Verteilung der XHes2-Transkripte während der Embryonalentwicklung zu untersuchen, wurde eine „whole-mount“ in situ Hybridisierung (wmISH) mit einer XHes2-spezifischen Sonde auf verschiedenen Embryonalstadien von Xenopus laevis durchgeführt (Abb.2-5).

In Embryonen des Vier-Zell-Stadiums, sowie in frühen und späten Blastulastadien sind maternale XHes2-Transkripte in der animalen Hälfte detektierbar (Abb.2-5A-C). Die beobachtete Zunahme der XHes2-Expressionsstärke in der animalen Hälfte später Blastulastadien verglichen mit der animalen Hälfte früher Blastulastadien könnte auf das Einsetzen der zygotischen XHes2-Transkription zurückzuführen sein (Vergleich: Abb.2-5B und C) und stimmt mit den Ergebnissen aus der RT-PCR-Analyse überein (Abb.2-4, St.7-9).

Zu Beginn der Gastrulation im Stadium 10 sind keine XHes2-Transkripte mehr nachweisbar (Abb.2-5D), was auf eine Degradierung der im späten Blastulastadium vorhandenen XHes2-Transkripte ohne eine erneute Expression hindeutet. Im Stadium 11 wird XHes2 in isolierten Zellen des animalen Ektoderms vorübergehend exprimiert (Abb.2-5E). Eine Beschränkung der Expression auf das ventrale animale Ektoderm, wie im Fall der Expression von X-Delta-1 und α-tubulin (Deblandre et al., 1999), konnte

allerdings nicht festgestellt werden. Zum Ende der Gastrulation im Stadium 12,5/13 sind keine XHes2-Transkripte mehr detektierbar (Daten nicht gezeigt). Diese begrenzte Expression von XHes2 während der Gastrulation erklärt auch die geringe Menge von XHes2-Transkripten im Stadium 11 bei der RT-PCR-Analyse (Abb.2-4, St.11).

2. Ergebnisse 29

Abb.2-5: XHes2 wird in entstehenden Sinnesorganen und im späteren ZNS von Xenopus exprimiert.

Räumlich-zeitliche Expressionsanalyse von XHes2 in Embryonalstadien von Xenopus laevis mittels wmISH. (A-C) XHes2-Transkripte sind bis zum späten Blastula-Stadium in der animalen Hälfte detektierbar. (D,E) Gastrulation. Im St.10 sind XHes2-Transkripte nicht nachweisbar (D), im St.11 dagegen sind kurzfristig einzelne XHes2-positive Zellen im animalen Ektoderm vorhanden (E). (F-S,U) Frühe Innenohrentwicklung (schwarze Pfeilspitzen). Ab St.13,5 sind XHes2-Transkripte in der Ohrplakode sichtbar (F-K,S), in späteren Stadien sind sie im dorsalen Teil des Ohrvesikels zu finden (L-R,U). (G-I) XHes2-Expression in anteriorer (graue Pfeilspitzen) und posteriorer (graue Pfeile) Neuralplatte. Ab St.14,5 erscheinen XHes2-positive Zellen in zwei dünnen Streifen jeweils zwischen Mittellinie und Ohrplakode auf Höhe der Ohrplakodenexpression in der anterioren Neuralplatte (G,I). In der posterioren Verlängerung der anterioren Expressionsdomänen sind ab St.14,5 schmale Streifen XHes2-positiver Zellen am lateralen Rand der posterioren Neuralplatte und nahe der Mittellinie detektierbar, die entsprechend der Neuralplatteneinfaltung in Richtung der Mittellinie wandern (G,H). (J-R,W) Retinogenese. XHes2 wird ab St.21 in Retina-Vorläuferzellen und dann in der gesamten undifferenzierten neuralen Retina exprimiert (J-N). Ab St.35 sind XHes2-Transkripte vorwiegend in der peripheren Region der neuralen Retina detektierbar (O-R,W). (K) XHes2 wird im St.25 auch in der Riechplakode (weiße Pfeilspitze) exprimiert. (K) Weitere XHes2-positive Zellen durchziehen fadenartig das Hirn (graue Pfeilspitze). (J) Die anteriore XHes2-Expression in Form eines umgekehrten Ypsilons im St.21 ähnelt der Schlupfdrüse, liegt vermutlich aber unter dem Oberflächenektoderm (graue Pfeilspitze). (M,N,P-R,T,V) XHes2-Expression in Hinterhirn und Vorderhirn (schwarze Pfeile). XHes2-Transkripte sind im St.33 in einer stark abgegrenzten Region in der subventrikularen Zone des ventralen Hinterhirns anterior und posterior zum Ohrvesikel detektierbar (M,N,T,V). Im St.38 wird XHes2 sowohl im Vorderhirn, als auch in dorsalen Zellen des Hinterhirns exprimiert (P-R). (O) Auch im ventralen Rückenmark im St.35 sind XHes2-positive Zellen zu erkennen (grauer Pfeil). (P,Q) Ab St.38 wird XHes2 im entstehenden Seitenliniensystem exprimiert (weiße Pfeilspitzen).

Abkürzungen: lat./ dors./ ant., laterale/ dorsale/ anteriore Ansicht; a, animal (A-E) bzw. anterior; v, vegetativ (A-E) bzw. ventral; p, posterior; d, dorsal; transv., transversal; op, Ohrplakode; ant./ post.ov, anterior/ posterior zum Ohrvesikel; St., Entwicklungsstadium. (N) Geklärter Embryo, (R) Vergrößerung von (Q), (S-W) 30µm Vibratom-Schnitte.

Die XHes2-Expression während der Neurulation und Organogenese ist komplex und wird daher im folgenden nicht nach Stadien, sondern nach Expressionsdomänen beschrieben.

Eine Region im Embryo, in der XHes2 besonders stark exprimiert wird, liegt im Bereich der Ohrplakode und später im dorsalen Anteil des Ohrvesikels, aus denen Teile des Innenohres entstehen. Bereits im frühen Neurulastadium (Stadium 13,5) können erste XHes2-Transkripte in zwei schmalen Domänen am lateralen Rand der Neuralplatte detektiert werden, die auf beiden Seiten ungefähr in der Mitte der Neuralplatte in antero-posteriorer (rostro-caudaler) Orientierung verlaufen und vermutlich im Bereich der Ohrplakode liegen (Abb.2-5F). Die XHes2-Expression in diesen beiden Domänen, die sich infolge der Zellbewegungen mit beginnender Einfaltung der Neuralplatte im Stadium 14,5 bereits weiter anterior befinden, wird stärker (Abb.2-5G) und ist auch in späteren Stadien sehr prominent (Abb.2-5I-K). In Stadium 21 und 25 befinden sich die beiden Expressionsdomänen lateral des sich entwickelnden Hinterhirns im Bereich der Ohrplakode (Abb.2-5J,K,S). Ab Stadium 30 sind XHes2-positive Zellen ausschließlich im dorsalen Ohrvesikel zu finden (Abb.2-5L-R,U).

XHes2 wird zudem in Zellen der sich einfaltenden Neuralplatte exprimiert. Ab Stadium 14,5 erscheinen XHes2-positive Zellen in zwei dünnen Streifen jeweils zwischen Mittellinie und Ohrplakode auf Höhe der Ohrplakodenexpression in der anterioren Neuralplatte (Abb.2-5G,I). Ihre Spezifität und ihr Schicksal sind unbekannt und bisher nicht beschrieben. Aufgrund der Lage könnten sie später im Hinterhirn lokalisiert sein. In der posterioren Verlängerung der anterioren Expressionsdomänen sind ab Stadium 14,5 schmale Streifen XHes2-positiver Zellen am lateralen Rand der posterioren Neuralplatte und nahe der Mittellinie detektierbar, die entsprechend der Neuralplatteneinfaltung in Richtung der Mittellinie wandern (Abb.2-5G,H). Diese Zellen sollten später im Rückenmark zu finden sein. Auch ihre Spezifität und ihr Schicksal sind unbekannt und bisher nicht beschrieben.

Eine weitere charakteristische Expressionsdomäne von XHes2 stellt die sich entwickelnde Retina dar. Ab Stadium 21 sind XHes2-Transkripte in Vorläuferzellen der späteren Retina zu finden (Abb.2-5J). Die Expression bleibt in der gesamten undifferenzierten neuralen Retina mit sich teilenden Retinoblasten erhalten (Abb.2-5K-N). Ab Stadium 35 wird XHes2 vorwiegend in der peripheren Region der neuralen Retina, die sich teilende Vorläuferzellen enthält, exprimiert (Abb.2-5O-R,W).

Im Stadium 23 und 25 sind XHes2-Transkripte auch in den Riechplakoden nachweisbar.

Außerdem durchziehen in diesen Stadien XHes2-positive Zellen unbekannter Spezifität fadenartig das sich ausbildende Hirn (Daten nicht gezeigt, Abb.2-5K). Die anteriore XHes2-Expression in Form eines umgekehrten Ypsilons im Stadium 21 dagegen ähnelt

2. Ergebnisse 31

der Schlupfdrüse, scheint aber tiefer als diese unter dem Oberflächenektoderm im dorsalen, anterioren Neuralrohr zu liegen (Abb.2-5J).

Später wird XHes2 auch in Vorder- und Hinterhirn, sowie im Rückenmark exprimiert.

XHes2-Transkripte sind im Stadium 33 in einer sehr kleinen Region in der subventrikularen Zone des ventralen Hinterhirns anterior und posterior zum Ohrvesikel detektierbar (Abb.2-5M,N,T,V). Die Spezifität dieser Zellen ist unklar. Im Stadium 35 wird XHes2 in ventralen Zellen des Rückenmarks exprimiert (Abb.2-5O). Im Stadium 38 sind XHes2-positive Zellen im Vorderhirn und in dorsalen Zellen des Hinterhirns vorhanden (Abb.2-5P-R). Zusätzlich können XHes2-Transkripte ab Stadium 38 im entstehenden Seitenliniensystem nachgewiesen werden (Abb.2-5P,Q).

Zusammenfassend läßt sich sagen, dass XHes2 in entstehenden Sinnesorganen, wie Auge, Ohr, Nase und Seitenliniensystem, von Xenopus laevis exprimiert wird, vor allem in deren frühen Entwicklungsphasen und in solchen Regionen, in denen Zellen proliferieren.

Im sich ausbildenden ZNS sind XHes2-Transkripte nur in einigen, sehr spezifischen Zellen vorhanden, ob es sich bei ihnen um proliferierende oder um bereits differenzierende Zellen handelt, ist unklar.

Somit hat die wmISH-Expressionsanalyse zum einen die RT-PCR-Expressionsanalyse bestätigen können und gezeigt, dass XHes2-Transkripte in fast allen Embryonalstadien vorhanden sind, zum anderen konnte mittels wmISH das dynamische und komplexe Muster der XHes2-Expression nachgewiesen werden.