Effekte von ESR8-MO, ESR9-MO und ESR10-MO auf die neuronale Differenzierung

Um herauszufinden, welche Auswirkungen die Hemmung der Translation von ESR8, ESR9 und ESR10 auf die Embryonalentwicklung, speziell die neuronale Differenzierung hat, wurden ESR8-MO, ESR9-MO und ESR10-MO in Xenopus-Embryonen injiziert und die Effekte auf die N-tubulin-Expression mittels wmISH in verschiedenen Embryonalstadien untersucht (Abb.2-30; Tab.2-11).

Infolge der Mikroinjektion von 20 ng des jeweiligen Morpholino-Oligonukleotids pro Zelle bzw. Embryo wurde eine unterschiedlich starke Reduktion N-tubulin positiver Zellen in St.15-Embryonen gefunden (Abb.2-30B; Tab.2-11). Die Anzahl N-tubulin-positiver Zellen wurde durch ESR8-MO verringert, allerdigs erinnerte die verbliebene N-tubulin-Expression an ein früheres Entwicklungsstadium (Abb.2-30B1). ESR9-MO hemmte hingegen die Expression von N-tubulin vollständig (Abb.2-30B3), während ESR10-MO einen etwas schwächeren Effekt als ESR9-MO hatte (Abb.2-30B2). Somit konnte infolge der Injektion vergleichbarer Mengen von ESR8-MO, ESR9-MO und ESR10-MO ein stärkerer Effekt bei geringerer Spezifität der Morpholino-Oligonukleotide, vermutlich aufgrund einer Kreuzhybridisierung von ESR9-MO und ESR10-MO, und bei höherer Anzahl alleler Varianten, möglicherweise infolge einer Genduplikation von ESR9 (siehe Abschnitt 2.3.1.2), beobachtet werden.

Im weiteren wurden die Auswirkungen von unterschiedlicher Mengen von ESR8-MO, ESR9-MO und ESR10-MO in späteren Entwicklungsstadien untersucht (Abb.2-30C;

Tab.2-11). Dabei zeigte sich, dass die Injektion von 20ng ESR8-MO, 10ng ESR10-MO und 5ng ESR9-MO nicht unterscheidbare Phänotypen mit Veränderungen der neuralen und neuronalen Entwicklung im Stadium 18 und 30 zur Folge hatte (Abb.2-30C1-3,5-7).

Geringere MO-Mengen hatten weitaus schwächere bis keine Effekte (Tab.2-11). Im Stadium 18 konnte eine deutliche Verzögerung der Neurulation beobachtet werden, die mit einer an ein jüngeres Stadium erinnernden N-tubulin-Expression einherging (Abb.2-30C1-3). Während St.30-Embryonen äußerlich unauffällig waren (Abb.2-30C5-7a,b), zeigten Vibratom-Querschnitte des Gehirns dieser Embryonen eine deutliche Expansion des neuralen Gewebes begleitet von einer verringerten, sowie diffuseren N-tubulin-Expression (Abb.2-30C5-7c). In den ESR9-MO injizierten Embryonen wurde außerdem eine verminderte N-tubulin-Expression im Auge (Abb.2-30C7a,b) und eine veränderte Augenmorphologie (Abb.2-30C7d) festgestellt. Die Erhöhung der ESR9-MO-Dosis auf 10ng war ausreichend, um eine nahezu komplette Hemmung der N-tubulin-Expression im St.15 (Abb.2-30D1), St.18 (Abb.2-30C4) und St.30 (Abb.2-30C8) zu verursachen. Zudem

war in St.30-Embryonen das Längenwachstum stark beeinträchtigt und verursachte eine Krümmung der Embryonen in Richtung der injizierten, kürzeren Seite (Abb.2-30C8a,b).

Der Versuch, den Effekt von ESR9-MO auf die primäre Neurogenese durch die Überexpression von ESR9 im Rahmen einer Funktionswiederherstellung abzuschwächen oder zu verhindern, war nicht erfolgreich (Abb.2-30D; Tab.2-11), was darauf hindeuten könnte, dass ESR9-MO unspezifisch die Synthese anderer Proteine, wie z.B. ESR10, hemmt oder/und dass eine Funktionswiederherstellung durch eine ubiquitäre und zeitlich nicht regulierte Proteinexpression nicht möglich ist.

Zusammenfassend läßt sich sagen, dass ESR8-MO, ESR9-MO und ESR10-MO, die eine Hemmung der Proteinsynthese von ESR8, ESR9 und ESR10 bewirken, in jeweils unterschiedlich starker Ausprägung die Neurulation verzögern, eine Expansion von neuralen Geweben bedingen und die Anzahl differenzierter Neuronen reduzieren.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Funktion der einzelnen, untereinander sehr ähnlichen bHLH-O-Proteine nicht durch andere Proteine kompensiert werden kann, und deuten darauf hin, dass definierte Proteinmengen von ESR8, ESR9 und ESR10 für eine normale Entwicklung und Abgrenzung des Neuroektoderms und seiner Derivate, und somit auch für die rechtzeitige, stadientypische Differenzierung primärer Neuronen benötigt werden.

Diese mögliche weitere, die frühe Entwicklung betreffende Funktion von ESR8, ESR9 und ESR10 ist von den zuvor beschriebenen späteren Funktionen, wie der Hemmung der neuronalen Determinierung und Differenzierung, die bei Funktionsverlust, wie die im Midgastrulastadium induzierten DNA-Bindungsmutanten, eine erhöhte Anzahl differenzierter Neuronen hätten erwarten lassen, abzugrenzen.

2. Ergebnisse 91

Abb.2-30: ESR8-MO, ESR9-MO und ESR10-MO verzögern die Neurulation, bedingen eine Expansion von neuralen Geweben und vermindern die neuronale Differenzierung.

Auswirkungen der Injektion von ESR8-MO, ESR9-MO und ESR10-MO auf die Expression von N-tubulin in Xenopus laevis-Embryonen analysiert mittels wmISH. (A) Schematische Darstellung der experimentellen Strategie. MOs (siehe 30B) wurden im animalen, polnahen Bereich in eine Blastomere des Zwei-Zell-Stadiums (St.2) von Xenopus laevis-Embryonen injiziert. Diese wurden bis zum Stadium 15, 18 oder 30 kultiviert und mittels wmISH analysiert. (B-D) wmISH-Analyse nach Injektion von ESR8-MO, ESR9-MO und ESR10-MO. (B) Jeweils gleiche Mengen der drei MOs (20ng/Embryo) bewirken eine unterschiedlich starke Reduktion N-tubulin positiver Zellen in St.15-Embryonen, wobei der Effekt von ESR8-MO (1) über ESR10-MO (2) zu ESR9-MO (3) zunimmt. (C1-3,5-7) Unterschiedliche Mengen von ESR8-MO (20ng), ESR9-MO (5ng) und ESR10-MO (10ng) haben ähnliche Veränderungen hinsichtlich der neuralen und neuronalen Entwicklung im St.18 und St.30 zur Folge. (C1-3) Die Einfaltung der Neuralplatte zur Bildung des Neuralrohres ist auf der MO-injizierten Seite gegenüber der nicht-injizierten Kontrollseite von St.18-Embryonen verzögert (besonders deutlich im anterioren Bereich), auch die N-tubulin-Expression erinnert an ein jüngeres Stadium (schwarze Pfeilspitzen). (C5-7) Im St.30 sind äußerlich kaum Unterschiede zwischen injizierter und nicht-injizierter Seite erkennbar (C5-7a,b). In transversalen Schnitten auf Höhe des Mittelhirns wird allerdings infolge der MO-Injektion eine deutliche Expansion des neuralen Gewebes sichtbar (weiße, gepunktete Linie), die von einer verringerten, sowie diffuseren N-tubulin-Expression begleitet wird (weiße Pfeilspitzen) (C5-7c). Die mit ESR9-MO injizierten Embryonen zeigen zudem noch eine verminderte N-tubulin-Expression im Auge (C7a,b), sowie eine veränderte Augenmorphologie (C7d) (schwarze Pfeile). (C4,8) 10ng ESR9MO verursachen eine nahezu komplette Hemmung der N-tubulin-Expression im St.18 (C4) und St.30 (C8) (schwarze Pfeile und Pfeilspitzen), wobei die St.30-Embryonen insgesamt, vor allem aber auf der injizierten Seite stark verkürzt sind, was zu einer Krümmung führt (C8a,b). (D) Die Hemmung der N-tubulin-Transkription durch ESR9-MO identische Embryonen; (C5-7c) Ausschnittsvergrößerungen von transversalen Vibratomschnitten (30µm) auf Höhe des Mittelhirns, (C7d) gesamter Querschnitt von (C7c) durch Mittelhirn und Augen. Abkürzungen: is, injizierte Seite; nis, nicht-injizierte Seite.

injiziertes MO ESR8MO ESR9MO ESR10MO

Menge (ng) 20 20 20

injiziertes MO ESR8MO ESR9MO ESR10MO

Menge (ng) 20; 10; 5 10; 5 10; 5

Abkürzungen und Symbole: MO, Morpholino-Oligonukleotid; Anzahl N-tubulin, Anzahl der mittels wmISH (N-tubulin-Expression) analysierten Embryonen; =, Expression unverändert; ↓, Reduktion der positiven Zellen (im St.18 einhergehend mit einem größeren Abstand der lateralen Expressionsdomänen zur Mittellinie); ↑, mehr positive Zellen in Expressionsdomäne; a, animal; ++, sehr stark; +, stark.