Vergleichbarkeit von kultureller Untersuchung und nested PCR

Das vielseitige Spektrum an Nachweisverfahren wurde von WANI und SAMANTA (2006) in einer retroperspektiven Studie zusammengefasst. Darin zeichnet sich der Trend zur Weiterentwicklung hoch sensitiver PCR Techniken ab, die in Zukunft als anerkannte Detektionsmethoden in nationalen Sanierungsprogrammen zur Verfügung stehen könnten. Statt auf Basis einer begrenzt sensitiven sowie zeitaufwändigen kulturellen Untersuchung wäre die Identifikation der Serogruppe und deren Pathogenität somit innerhalb von 24 Stunden durchführbar.

Bei 34 der 122 Proben (27,87 %) wurden in der kulturell-mikrobiologischen Untersuchung Isolate des Erregers D. nodosus gewonnen. Die geringe Sensitivität der bakteriologischen Untersuchung, die in zahlreichen Studien aufgeführt wird (JELINEK et al. 2001; MOORE et al. 2005; BELLOY et al. 2007; DHUNGYEL et al. 2008; AZIZI et al. 2011; KUHLEMANN 2011; FROSTH et al. 2012), konnte in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Abgeleitet aus den Ergebnissen der vorherigen Untersuchungen liegt die Nachweisrate in Abhängigkeit von der Probennahme und dem verwendeten Medium bei maximal 55,8 % (MOORE et al. 2005). Dass insbesondere die Entnahmetechnik den Erfolg einer kulturellen Untersuchung von D. nodosus beeinflusst, wurde ab dem dritten Versuchsdurchgang beobachtet.

Während in den ersten beiden Versuchsdurchgängen lediglich bei sieben Tieren (n = 47) der Nachweis gelang, trat mit der Gewinnung des Probenmaterials aus dem interdigitalen Spalt eine Steigerung der Erfolgsrate ein. Daraufhin wurde im dritten Durchgang bei jedem vierten Schaf (25 %) und im letzten Versuchsdurchgang bei fast der Hälfte der entnommenen Proben (48,6 %) D. nodosus isoliert. Jedoch setzt diese Form der Probengewinnung voraus, dass im interdigitalen Spalt nur wenige Partikel aus der Umwelt bzw. sonstige Bakterien haften, die die Sensitivität der Nachweisemethode beeinflussen könnten. Als weiterer Ursachenkomplex für die niedrige Erfolgsrate ist laut DHUNGYEL et al. (2008) der Transport des Bakteriums unter aeroben Bedingungen und die Unerfahrenheit des Laborpersonals in der Anzucht des anspruchsvollen Erregers anzusehen, insofern könnte die Zunahme der

Nachweisraten im Verlauf der Versuche auch den Erfahrungsgewinn bei der kulturellen Isolierung von D. nodosus widerspiegeln.

Im Vergleich zur kulturell-mikrobiologischen Untersuchung stellte sich die nested PCR, wie bei BELLOY et al. (2007), als hoch sensitive Detektionsmethode dar. Die nested PCR lieferte im Vergleich zur kulturellen Untersuchung eine höhere Nachweisrate des Erregers. Die von BELLOY et al. (2007) beschriebene hohe Sensitivität von 100 % wurde in der vorliegenden Studie nur um 2,4 % verfehlt.

Obwohl die Gefahr einer Kontamination der Proben durch die Verwendung von Holzstäbchen minimiert wurde, bestand das Risiko, dass bei der Entnahme nicht ausreichend Material für die Untersuchung gewonnen werden konnte.

Mögliche Ursachen für die Ermittlung von drei falsch negativen Ergebnissen wären unter Umständen bei der DNA Isolierung von D. nodosus zu suchen, die nur nach einer sorgfältigen Durchführung verwertbares Probenmaterial für die anschließende Vervielfältigung der Zielgensequenzen bereitstellt (BELLOY et al. 2007).

Im Weiteren konnte in einer zusätzlichen Probennahme belegt werden, dass die hohe Sensitivität nicht mit einer niedrigen Spezifität der nested PCR einhergeht. Während BELLOY et al. (2007) aufgrund eines falsch positiven Ergebnisses die Spezifität auf 94,4 % (n = 18) festlegten, wurden in der vorliegenden Studie in keiner der Proben von 25 klauengesunden Schafen Genomsegmente von D. nodosus nachgewiesen.

Zusammengefasst steht aktuell in Deutschland mit der nested PCR von BELLOY et al. (2007) eine zuverlässige Methode zum Nachweis von D. nodosus zur Verfügung.

Alternativ besteht die –weniger sensitive- Möglichkeit der kulturell-mikrobiologischen Untersuchung des Erregers auf Blut Eugon Agar. Hierfür wird empfohlen von mindestens vier klinisch erkrankten Tieren Probenmaterial aus dem interdigitalen Spalt zu entnehmen, sofort vor Ort auf Blut Eugon Agar auszustreichen und unverzüglich anaerob zu bebrüten oder die Gliedmaßen frisch verendeter Tiere Vakuum-verpackt an das Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zu senden.

Der Stellenwert, den eine hoch sensitive Nachweismethode in einem nationalen Sanierungsprogramm einnimmt, kommt in den zukünftigen skandinavischen Moder-hinkesanierungsmodellen zum Ausdruck (VATN et al. 2012; STAMPHØJ 2012). Im

Gegensatz zum australischen Modell (New South Wales) findet in Dänemark keine Unterscheidung bezüglich der Pathogenität der Stämme statt. Die dänische praktizierende Tierärztin Inga Stamphøj berichtete auf dem Kongress der DVG-Fachgruppe für Krankheiten der kleinen Wiederkäuer im Mai 2012, dass die Sanierung großer Herden durch einmalige Gabe von Gamithromycin möglich wäre.

Den Erfolg der Behandlung überprüfte sie mit Hilfe von Klauentupfern, die mittels PCR auf Genomsequenzen von D. nodosus untersucht wurden. Nach Ausbruch der Moderhinke beprobte sie zunächst acht ausgewählte Tiere einer Herde. Bestätigte sich im Anschluss die Verdachtsdiagnose in der real-time PCR musste die gesamte Herde einmalig mit Gamithromycin in der Dosierung von 6 mg/kg KGW behandelt werden. Vier Wochen nach der Behandlung sowie sechs Monate später wurden Klauentupfer zur Kontrolle des Behandlungserfolgs an ein Untersuchungslabor geschickt. Die betroffenen Betriebe erhielten den Status „Moderhinkefrei“ jedoch erst ab dem Zeitpunkt, an dem zwei aufeinanderfolgende negative Befunde von jeweils acht beprobten Tieren vorlagen. In jährlichen Abständen wurde mittels real-time PCR der Status der Herde kontinuierlich überprüft, welches insbesondere der Detektion von klinisch unauffälligen Trägertieren diente.

In der schwedischen Studie von FROSTH et al. (2012) wurde die real-time PCR zum einen der konventionellen PCR nach LA FONTAINE et al. (1993) und zum anderen der kulturell-bakteriologischen Untersuchung (STEWART u. CLAXTON 1993) gegenübergestellt. FROSTH et al. (2012) setzten als untere Nachweisgrenze für die real-time PCR 3,9 fg genetischen Materials von D. nodosus fest, die in ihrer Untersuchung sowohl zur Ermittlung einer 100 %igen Sensitivität als auch Spezifität ausreichend waren. Die Überlegenheit dieser Detektionsmethode zeigte sich im direkten Vergleich der Untersuchungsergebnisse. Insgesamt war die real-time PCR um 54,8 % sensitiver als die kulturell-bakteriologische Untersuchung und wies im Vergleich zur PCR nach LA FONTAINE et al. (1993) eine um 7,6 % höhere Nachweisrate auf. In diesem Zusammenhang stellt sich jedoch die Frage, ob eine Kontrolluntersuchung vier Wochen nach der Behandlung, aufgrund der hohen Sensitivität, nicht zur Ermittlung falsch positiver Ergebnisse beiträgt. Diese Hypothese

STAMPHØJ (2012) widerlegt. Demnach wurden bei 28 von 29 zuvor Moderhinke positiven Herden vier Wochen später in der real-time PCR keine Genomsegmente des Bakteriums mehr nachgewiesen.

5.2.2 Genotypisierung

Die genetische Selektion auf Moderhinketoleranz ist in Neuseeland eine anerkannte Kontrollmaßnahme. Auf Basis des Footrot Gene Marker Tests (FGMT) wählt ca. ein Viertel (24,7 %) der Merinozüchter ihre Schafböcke aus, um bei den Nachkommen eine kontinuierliche Senkung der Moderhinke-Prävalenz zu erzielen (ABBOTT et al. 2007). Jedoch wird im Vergleich zu Neuseeland das Angebot der Beurteilung des DQA2 Genotyps nur von wenigen europäischen Schafzüchtern angenommen (GREEN et al. 2011), was vorwiegend darin begründet ist, dass der FGMT nur in den für ihn entwickelten Schafrassen auch zu einem aussagekräftigen Ergebnis führen kann (BENNETT u. HICKFORD 2011).

In diesem Kontext wurden 123 Blutproben von Schafen einheimischer Rassen bzw.

Kreuzungen zur Analyse und Bewertung der Allelkombination nach Neuseeland verschickt. Ein Vergleich der Ergebnisse zu vorangegangenen Untersuchungen von LOTTNER (2006) und KUHLEMANN (2011) war nicht durchführbar. In diesen beiden Studien wurden die Häufigkeitsverteilungen der Allelkombinationen in deutschen Schafrassen bestimmt, während in der vorliegenden Untersuchung eine numerische Bewertung (Footrot Rating) der ermittelten DQA2 Allele vorlag.

Von insgesamt 12 der 22 (54,5 %) untersuchten Heidschnucken konnten die ermittelten Allelkombinationen des DQA2 Gens im Hinblick auf die genetische Moderhinketoleranz nicht beurteilt werden. Lediglich ein Tier müsste gemäß den Empfehlungen von HICKFORD (o. Jg.) sicher den Betrieb verlassen, obwohl die Unterminierungen am Sohlen- und Ballenhorn nach der Klauenbadbehandlung vollständig abheilten. Dieses singuläre Beispiel aus dem ersten Tierversuch verdeutlicht, dass keine allgemeingültige Aussage anhand des Genotypisierungs-ergebnisses über den Heilungsverlauf getroffen werden kann. Vielmehr ist nur die prozentuale Wahrscheinlichkeit der Nachkommen an der progressiven Form der Moderhinke zu erkranken anhand des „Footrot Ratings“ schätzbar (siehe Tab. 3).

Allerdings könnte dieses Ergebnis darauf hindeuten, dass bei nicht ausreichender Wirkung des Antibiotikums auf D. nodosus die Gefahr eines Rezidivs aufgrund mangelnder Immunantwort bei diesem Tier wahrscheinlich wäre. Demgegenüber steht eine große Spannweite an ermittelten Genotypen bei den Kreuzungstieren aus dem zweiten und dritten Versuchsdurchgang. Im Vergleich zu den Heidschnucken des ersten Versuchsdurchgangs konnte nur bei einem Tier der Genotyp nicht bewertet werden. Im weiteren zeigte sich, dass eine wesentlich größere Anzahl an Tieren (n = 23) schlechte bis sehr schlechte „Footrot Ratings“ aufwies. Bei vier Schafen blieb die Entscheidung offen, ob der Züchter diese Tiere zur weiteren Remontierung einsetzen sollte. Zusammengefasst würde die Umsetzung der Empfehlungen von HICKFORD (o. Jg.) in diesem Betrieb eine drastische Reduzierung der Bestandsgröße zur Folge haben, denn lediglich 24 der 64 Schafe (37,5 %) gäben mit hoher Wahrscheinlichkeit die genetisch determinierte Anlage einer Moderhinke-toleranz an ihre Nachkommen weiter. Wie bereits bei den Heidschnucken des ersten Versuchsdurchgangs und den Kreuzungstieren des zweiten und dritten Versuchsdurchgangs beschrieben, zeigte sich auch im letzten Versuchsdurchgang bei den Schwarzköpfigen Fleischschafen, dass in deutschen Schafpopulationen bisher nicht nachgewiesene DQA2 Genotypen auftreten. Hierbei könnte es sich um Kombinationen zwischen DQA2 ähnlichen Sequenzen und echten DQA2 Allelen handeln. Bereits in der Studie von LOTTNER (2006) wurde auf das Vorhandensein von unbekannten DQA2 ähnlichen Sequenzen in deutschen Schafherden hingewiesen (B3/E), was im Anschluss KUHLEMANN (2011) in ihren epidemiolo-gischen Untersuchungen bestätigten konnte. Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie stellt die Genotypisierung der Rasse Schwarzköpfiges Fleischschaf eine aufschlussreiche Managementmaßnahme zum Aufbau einer Moderhinketoleranten Herde dar. Einerseits, wie zuvor aufgeführt, wurden die Genotypen von 97,1 % der Schafe vollständig ermittelt und zum anderen könnte der Tierhalter mit der Mehrheit seiner Schafe (74,3 %, n = 26) weiterzüchten. Sowohl die Heidschnucken als auch die Kreuzungstiere konnten nicht gleichzeitig diese beiden Bedingungen erfüllen. Die Erkenntnis, dass im vorliegenden Fall der Schäfer nur etwa ein Viertel seiner Tiere

(25,7 %) merzen müsste, ist eine wichtige Voraussetzung um ihn vom Einsatz des genetischen Markers zu überzeugen.

Als Zweites wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft, ob ein Zusammenhang zwischen den erhobenen Klauen- bzw. Locomotion Scores (TWDS) und den „Footrot Ratings“ besteht. In der Korrelationsanalyse konnte zwischen den Variablen kein Zusammenhang festgestellt werden. Diese Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen einer britischen Studie (CONINGTON et al. 2008). CONINGTON et al. (2008) ermittelten einerseits bei den Rassen Texel und Schwarzköpfiges Fleischschaf eine große Variabilität am DQA2 Genort und wiesen andererseits nach, dass der erhobene Klauenbefund nicht vom Genotyp abhängig war.

Die Empfehlung zur genetischen Selektion einer Herde sollte nur im Rahmen von Sanierungsprogrammen und in Kombination mit anderen Kontrollmaßnahmen, wie z. B. Einhaltung einer Quarantäne von zwei Wochen bei Zukäufen, regelmäßige Vakzinierung im Abstand von vier bis fünf Monaten, tägliche Erhebung der Lahmheitsprävalenz einer Herde, erfolgen (CONINGTON et al. 2008; ENNEN et al. 2009; WINTER 2009). Im Weiteren muss der Tierhalter darauf hingewiesen werden, dass sich ein sichtbarer Erfolg erst im Verlauf von mehreren Generationen einstellen wird.

5.2.3 Vergleich der Antibiotika untereinander und mit der topischen Therapie