Molekularbiologischer Nachweis von Dichelobacter nodosus

3.2.4.1 Probennahme

Der molekularbiologische Nachweis von D. nodosus erfolgte durch eine nested PCR, entwickelt 2007 von BELLOY und Mitarbeitern. Die Probennahme wurde am umgesetzten Tier durchgeführt. Jedes Tier wurde an einer Gliedmaße beprobt. Mittels eines Zahnstochers (PAP STAR GmbH, Kall) konnte das Probenmaterial unter dem

Asbach) überführt werden. Zeigten die Tiere keine Unterminierungen des Klauenhorns, wurde eine Probe aus dem interdigitalen Spalt entnommen. Die mit der Tierkennzeichnung versehenden Probenröhrchen wurden bis zur Untersuchung bei 7 °C aufbewahrt.

3.2.4.2 DNA Isolierung

Für den Nachweis von D. nodosus musste zunächst die DNA aus den Proben, unter Verwendung des DNeasy^® Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Hilden), extrahiert werden.

Im ersten Schritt wurden in jedes Probenröhrchen 500 µl phosphatgepufferte Salz-lösung (PBS, Herstellung: Labor Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik) pipettiert und im Vortexer (Genie 2^®, Scientific Industries GmbH, New York, USA) 30 s gemischt. 200 µl der Lösung wurde zusammen mit je 20 µl Proteinase K (QIAGEN, Hilden) in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (QIAGEN, Hilden) überführt. Weitere 200 µl des Buffer AL (QIAGEN, Hilden) wurden der Lösung beigefügt und im Anschluss auf dem Vortexer gemischt. In einem Wasserbad-schwenker (GFL^®, Burgwedel) inkubierten die Proben für 10 min bei 56 °C. Danach wurden je 200 µl Ethanol (96 %ig, Roth, Karlsruhe) der Lösung zugegeben und im Vortexer zu einer Suspension gemischt. Der Inhalt des Eppendorf-Reaktionsrefäßes wurde mit einer Pipettierhilfe (Eppendorf, Hamburg) in 2 ml Tubes (QIAGEN, Hilden) überführt, die eine mobile DNeasy Mini Säule enthielten. Die Säulen wurden bei 6.000 g 60 s zentrifugiert, in neue Tubes gesteckt und der Überstand verworfen.

Danach wurden jeweils 500 µl Buffer AW1 (QIAGEN, Hilden) auf die Säulen gegeben und bei 6.000 g 60 s zentrifugiert. Die Säulen wurden in neue Tubes überführt, auf die 500 µl einer Waschlösung (Buffer AW2, QIAGEN, Hilden) gegeben wurde und 3 min bei 20.000 g zentrifugiert. Abschließend wurden die Säulen in neue 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt, jeweils 200 µl Buffer AE (QIAGEN, Hilden) hinzugefügt und 60 s bei 6.000 g zentrifugiert.

Die beschrifteten Proben wurden bei -18 °C bis zur weiteren Untersuchung aufbewahrt.

3.2.4.3 Nested PCR

Die nested PCR wurde an den zuvor unter Raumtemperatur aufgetauten Proben durchgeführt. Die Anfertigung des Mastermix erfolgte unter einer Sterilbank (Hera Safe, Heraeus, Hanau). Die aufgetauten Reagenzien wurden mittels eines Vortexer (MS2 Minishaker, IKA, Staufen) gemischt und im folgenden Verhältnis für den ersten Mastermix angesetzt:

5 x Buffer (7,5 mM MgCl2, Finnzymes, Vantaa, Finnland) 5,0 µl dNTP Mix (10 mM, Finnzymes, Vantaa, Finnland) 0,5 µl DN Primer (5’ AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3’,)

(Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf) 0,5 µl DN Primer (5’ AGA GTT TGA TAC TGG CTC AG-3’)

(Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf 0,5 µl DNA Polymerase (Phire Hot Start II, Finnzymes, Vantaa, Finnland) 0,125 µl Wasser für die Molekularbiologie (ad 22 µl, Roth, Karlsruhe) 15,375 µl Gesamtvolumen 22 µl

Zusätzlich zu den Probenansätzen wurden vier bis fünf Ansätze für eine Positiv- und Negativkontrolle sowie für zwei Wasserkontrollproben vorbereitet. Die einzelnen Volumina für den Mastermix wurden in ein 2 ml Tube (Sarstedt, Nümbrecht) pipettiert.

Für jede Probe wurde ein 0,2 ml Tube (Sarstedt, Nümbrecht) bereitgestellt, in welches 22 µl Mastermix pipettiert wurde. Anschließend wurden in die beiden Tubes der Wasserkontrollen 3 µl des entsprechenden Reagenz pipettiert. Die anderen Kontrollproben wurden erst in einem späteren Pipettiervorgang beschickt und beinhalteten zunächst nur den Mastermix. Die Minitubes wurden verschlossen, beschriftet und für die weitere Untersuchung von der Sterilbank in einen gesonderten Raum (Cyclerraum) transportiert. Es wurden in jedes gekennzeichnete Tube 3 µl der zugehörigen DNA pipettiert. Die Positiv- und Negativkontrollproben wurden ebenfalls mit 3 µl des entsprechenden Reagenz beschickt. Die PCR erfolgte mittels eines Thermocyclers (Mastercycler 96, Eppendorf, Hamburg) gemäß folgendem Programm:

1. 98 °C 30 s (Denaturierung) 2. 35 Zyklen:

94 °C 5 s (Denaturierung) 56° C 5 s (Hybridisierung) 72 °C 30 s (Extension) 3. 72° C 60 s (Extension) 4. 6° C hold

Das Produkt zählte nach dem ersten PCR-Zyklus 1400 bp. Die abgekühlten Proben wurden nach Beendigung des Programms aus dem Thermocycler entnommen und bei 7 °C vorübergehend aufbewahrt.

Währenddessen wurden die Reagenzien für den zweiten Mastermix unter der Sterilbank im folgenden Verhältnis angesetzt:

5 x Buffer (7,5 mM MgCl2, Finnzymes, Vantaa, Finnland) 5,0 µl dNTP Mix (10 mM, Finnzymes, Vantaa, Finnland) 0,5 µl DN Primer (5’ CGG GGT TAT GTA GCT TGC 3’)

(Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf) 0,5 µl DN Primer (5’ TCG GTA CCG AGT ATT TCT ACC CAA-CA CCT 3’)

(Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf 0,5 µl DNA Polymerase (Phire Hot Start II, Finnzymes, Vantaa, Finnland) 0,125 µl Wasser für die Molekularbiologie (ad 24 µl, Roth, Karlsruhe) 17,375 µl Gesamtvolumen 24 µl

Die Volumina der Reagenzien multipliziert mit der Probenanzahl aus dem ersten Zyklus ergab das Gesamtvolumen des Mastermix, das auf sterile 0,2 ml Tubes entsprechend der Anzahl an Proben zuzüglich der zwei Wasser-, der Positiv- sowie der Negativkontrollproben verteilt wurde. Mit Ausnahme der zweiten Wasserkontrollprobe wurden alle Tubes verschlossen und beschriftet, bevor sie von der Sterilbank in den Cyclerraum transportiert wurden. In jedes Probentube wurde 1 µl des entsprechenden PCR Produktes aus dem ersten Zyklus bzw. in das Tube der zweiten Wasserkontrollprobe 1 µl Wasser für die Molekularbiologie pipettiert und

danach in den Thermocycler überführt. Der zweite Durchgang im Thermocycler lief gemäß folgendem Programm:

1. 98 °C 30 s (Denaturierung) 2. 35 Zyklen

94° C 5 s (Denaturierung) 61 °C 5 s (Hybridisierung) 72° C 30 s (Extension) 3. 72 °C 60 s (Extension) 4. 6° C hold

Das endgültige PCR Produkt enthielt 781 bp.

3.2.4.4 Agarose-Gelelektrophorese

Bei der Gelelektrophorese fand eine Auftrennung der DNA Moleküle aus der PCR nach ihrer Ladung und Länge statt.

Zunächst erfolgte die Herstellung eines 1 %igen Agarose Gels. Hierfür wurden 1,6 g Agarose (Biozym, Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf) abgewogen und in einem Erlenmeyerkolben in 160 ml 1 x TBE-Puffer gelöst. Der TBE-Puffer war zuvor aus 108 g TRIS Pufferan^®, 55 g Borsäure, 9,3 g EDTA Dinatriumsalz Dihydrat (alle Roth, Karlsruhe) sowie Aqua bidest. (eigene Herstellung) ad 1000 g hergestellt und steril filtriert (Steritop™, 0,22 µm, Millipore Corporation Bedford, Massachusetts, USA) worden. Das Gemisch wurde mehrfach in einem Mikrowellenherd (SHARP, 800 Watt, Osaka, Japan) erhitzt. Die kochende Lösung wurde unter Schwenken des Erlenmeyerkolbens unter fließendem, kaltem Wasser auf 60 °C abgekühlt.

Abschließend wurde der Lösung 16 µl Gelstar^® (Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf) hinzugefügt. Die Lösung wurde unter Vermeidung der Entstehung von Blasen in die vorbereitete Elektrophoresekammer (Com Phor Midi, Bioplastics, Landgraaf, Niederlande) gegossen, wo sie langsam polymerisierte. Mit Eintritt in die feste Phase konnten die Kämme entfernt und das Gel vollständig mit 1 x TBE-Puffer

Anschließend wurden den PCR-Produkten 2 µl eines glycerinhaltigen Farbmarkers (eigene Herstellung; für 6 ml Farbmarker: 3 ml 0,1 %ige Bromphenolblau-Stamm-lösung, 2 ml Glycerin und 1 ml TE-Puffer) hinzugefügt. Jeweils 20 µl des Proben-Farbmarker-Gemisches wurden in die Geltaschen pipettiert. Zusätzlich wurde eine im Verhältnis 1 zu 3 mit TBE-Puffer (s.o.) verdünnte 100 bp DNA Leiter (Roth, Karlsruhe) als Marker (Längenstandard) aufgetragen. Für 60 min wurde eine Spannung von 100 Volt (V) angelegt (Biometra^® Standard Power Pack, biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen), die eine Wanderung der negativ geladenen DNA Moleküle in Richtung Anode bewirkte. Unter ultraviolettem Licht (254 nm) konnten die fluoreszierenden DNA Banden dargestellt werden.

Photographien des Gels wurden mittels Photosystem E.A.S.Y. RH-3 und des Programms Gel Pro Analyzer^® (Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA) angefertigt und abgespeichert.