Untersuchungsverfahren

3.3.3.1.1 Gewinnung von gewaschenen Zellen

Da die Gewinnung von gewaschenen Zellen aus dem peripheren Blut zur Durchführung des funktionellen in-vitro-Testes (FIT) an anderer Stelle ausführlich dargestellt wurde (KAUL

1998; BRUENNLEIN 2001; GEIBEN 2003), wird nachfolgend nur die Aufreinigung der Zellen aus der BAL beschrieben.

Zur Entfernung von vorhandenen Schleimfäden und größeren Zellwandabschilferungen wurde die bei der bronchoalveolären Lavage (3.2.1.6) aufgefangene Zellsuspension durch ein Gewebe (3.3.2.1) in 50 ml-Zentrifugenröhrchen filtriert. Die Filtrierung durch Nylon-Netze verändert im Gegensatz zur Filtrierung durch Gaze nur den absoluten Zellgehalt, nicht aber die prozentuale Zusammensetzung der Zellen (HEWSON u. VIEL 2002). Da u. a.

vorhandenes freies Histamin und nicht zellgebundene Antikörper das Testergebnis verfälschen können, wurden die Zellen gewaschen: Nach Zentrifugation bei 100 g (ohne Bremse) und 10 °C für 10 min. zur Anreicherung der Zellen wurde der Überstand bis auf das Zellpellet vorsichtig abgenommen und ein Teil davon bei – 20 °C in kleinen Aliquots zur Histaminbestimmung asserviert. Die BAL-Zellen wurden in wenig PBS (3.3.2.2) resuspendiert, in ein Röhrchen überführt und mit PBS auf 50 ml aufgefüllt. Die zugesetzte

PBS-Lösung enthielt zusätzlich Ovalbumin (3.3.2.2) und EDTA (3.3.2.2), so dass final Konzentrationen von 2,5 mg / ml (Ovalbumin) bzw. 0,9 mg / ml (Na2EDTA) erreicht wurden.

Nach Zentrifugation bei 100 g und 10 °C für 10 min. wurde der Überstand abgenommen und die Zellen erneut in PBS mit EDTA- und Ovalbumin-Zusatz resuspendiert. Dieser Waschvorgang wiederholte sich zweimal, beim letzten Waschen allerdings ohne Zusatz von EDTA, um nicht später beim Histamin-Release Ca²⁺ und Mg²⁺ abzufangen. Nach dem letzten Waschvorgang wurden die Zellen vorerst nur auf ca. 10 ml resuspendiert (in PBS ohne EDTA-Zusatz), die Gesamtzahl lebender Leukozyten bestimmt (3.3.3.1.3) und anhand des Ergebnisses eine Zellzahl von 1 · 10⁶ lebenden Zellen / ml eingestellt.

Bei einigen Proben wurde ein Teil der Überstände aus der BAL bzw. von den Waschdurchgängen eins bis drei zur Bestimmung des Gesamt-IgG-Gehaltes im ELISA bei - 20 °C asserviert.

3.3.3.1.2 Bestimmung des Gesamt-IgG-Gehaltes im Überstand der BAL bzw. in den Aufreinigungsüberständen

Mit Hilfe eines Sandwich-ELISA wurden die Überstände der bronchoalveolären Lavage bzw.

die Überstände der Waschlösungen auf ihren Immunglobulin-Gehalt überprüft. Der ELISA wurde in Anlehnung an das von WAGNER (1993) beschriebene Verfahren durchgeführt, die einzelnen Arbeitsschritte können dem Protokoll in Tabelle 15 entnommen werden. Die Durchführung erfolgte – soweit nicht anders angegeben – bei Raumtemperatur auf einem Schüttelgerät (3.3.1) bei 400 rpm. Während der Inkubationszeiten wurden die ELISA-Platten (3.3.2.1) mit einer speziellen Klebefolie (3.3.2.1) abgedeckt.

Als Positivkontrolle diente equines Serum in unterschiedlichen Verdünnungsstufen (3.3.2.5.3). Die Negativkontrollen setzten sich aus einer A- und einer B-Puffer-Kontrolle zusammen. Anhand dieser Kontrollen kann später überprüft werden, inwiefern es zu unspezifischen Bindungen des Detektionssystems gekommen ist. Die A-Puffer-Kontrolle besteht aus A-Puffer (ohne Coating-Antikörper, 3.3.2.3.3) mit Zugabe der Probe, die B-Pufferkontrolle besteht in einer Reihe Coating-Antikörper mit B-Puffer (3.3.2.3.3) ohne

Probenzugabe und dient als Konjugat-Kontrolle. Es werden immer Duplikat-Bestimmungen angesetzt.

Das Nachweissystem besteht aus einem polyklonalen Peroxidase-gekoppelten Antikörper (3.3.2.5.3), der schwere Ketten von equinen IgG-Immunglobulinen und leichte Ketten aller Immunglobulin-Isotypen in den Überständen erkennt. Die an die Detektions-Antikörper gekoppelte Peroxidase reagiert mit Wasserstoffperoxid im Substrat, der freigesetzte Sauerstoff oxidiert den Farbindikator Tetramethylbenzidin (TMB) und die Reaktion wird als Farbumschlag des TMB von farblos über blassblau nach tiefblau sichtbar. Nach Stoppen der Reaktion mit Schwefelsäure (bewirkt einen Farbumschlag von blau nach gelb) kann das Ergebnis photometrisch ausgelesen werden. Die Auswertung der gemessenen Extinktionen erfolgte über eine einfache positive / negative Bewertung, wobei zuvor von allen gemessenen Extinktionen die Extinktion für die unspezifische Bindung der B-Puffer-Kontrolle abgezogen wurde. Abbildung 11 zeigt den Aufbau des ELISA schematisch.

Abbildung 11: Schematischer Aufbau des ELISA zur Bestimmung des IgG-Gehaltes in den Überständen der BALF bzw. den Waschüberständen.

Da nicht bekannt ist, welche Immunglobulin-Isotypen von dem hier verwendeten konjugierten Detektions-Antikörper überhaupt und wie repräsentativ erkannt werden, ist eine reelle Gesamt-Immunglobulinbestimmung fraglich. Daher ist als „Gesamt”-Immunglobulin-Bestimmung nur die Erfassung derjenigen Immunglobulin-Isotypen zu verstehen, die vom eingesetzten Detektions-Antikörper gebunden werden.

Tabelle 15: Darstellung der einzelnen Arbeitsschritte des ELISA zum Nachweis equiner Immunglobuline in den Überständen der BAL und der Waschlösungen

1. Beschichtung („Coating“) der ELISA-Platte mit gαh IgG (H + L)-Antikörper, 3.3.2.5.3 (bei A-Puffer-Kontrolle nur Zugabe des A-Puffers ohne Antikörper):

50 ng Antikörper / ml in A-Puffer, 100 µl pro well, 30 min. bei RT, über Nacht bei 4 °C 2. Waschen der Mikrotiterplatten mit Hilfe eines automatischen Waschgerätes (3.3.1),

ersetzen des A-Puffers durch B-Puffer:

5 Zyklen à 250 µl B-Puffer (3.3.2.3.3) pro well

3. Inkubation der BAL- und Waschüberstände und der Positivkontrolle:

Verdünnung der Proben: 1 : 10 bis 1 : 10.000 in 10-er Verdünnungsschritten Verdünnung des Referenzserums: 3 : 10³ bis 1 : 10⁸ in 10 -Verdünnungsschritten bei Negativ- und B-Puffer-Kontrolle nur B-Puffer-Zugabe

50 µl pro well, 60 min. bei RT

4. Erneutes Waschen (siehe 2.): Entfernen von nicht-gebundener Probenlösung 5. Zugabe des Detektions-Antikörpers (gαh IgG (H + L), Peroxidase-gekoppelt,

0,1 µg Antikörper / ml in B-Puffer, 3.3.2.5.3):

50 µl pro well, 60 min. bei RT

6. Erneutes Waschen (siehe 3.): Entfernen von überschüssigen Antikörpern

7. Substratzugabe (3.3.2.3.3): 50 µl pro well, 20 min., RT, im Dunkeln ohne Schütteln 8. Stoppen der Umsetzungsreaktion durch Absenkung des pH mit 1 N Schwefelsäure:

50 µl pro well

9. Messung im ELISA-Plattenphotometer (3.3.1) im Dualmodus bei einer Wellenlänge von 450 nm (Testfilter) und 570 nm (Referenzfilter)

3.3.3.1.3 Bestimmung des Anteils „lebender“ Leukozyten

In einem Eppendorf-Cup wurden 900 µl Trypanblau-Lösung (0,1 % (w/v) in PBS, 3.3.2.2) vorgelegt, 100 µl der gewaschenen BAL-Zellsuspension aus 3.3.3.1.1 hinzugefügt und durch vorsichtiges Schwenken gemischt. In einer BÜRKER-Zellzählkammer (3.3.1) unter dem Lichtmikroskop (3.3.1) wurden jeweils die lebenden (hell leuchtenden) und toten Leukozyten (Zytoplasma blau aufgrund von Zellwandschäden) gezählt.

3.3.3.1.4 Durchführung der Histaminfreisetzungen

Alle Histaminfreisetzungen aus basophilen Granulozyten bzw. Mastzellen erfolgten aus Zellen des peripheren Blutes bzw. BAL-Zellen nach Vorbehandlung („Waschen“, 3.3.3.1.1) und Einstellen entsprechender Zellzahlen (3.3.3.1.3). Konnten die Blutproben nicht sofort nach der Entnahme weiterverarbeitet werden, wurden sie bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur gelagert. Die Aufarbeitung der BAL-Zellen erfolgte ca. eine Stunde nach Durchführung der bronchoalveolären Lavage. Bis dahin wurde die Suspension auf Eis (+ 4 °C) gelagert.

Nach KAUL (1998) muss die Histaminfreisetzung auf spezifische Agenzien bzw. Allergene jeweils auf die zu diesem Zeitpunkt maximal freisetzbare Histaminkonzentration bezogen werden, die je nach Individuum entweder durch physikalische Freisetzung oder durch die Zugabe von gαh-Antikörpern erreicht werden kann. Die detaillierte Durchführung der Histamin-Freisetzung aus den Zellen des peripheren Blutes ist dort ebenfalls beschrieben.

Bei der physikalischen Freisetzung werden die Zellen im Freisetzungspuffer durch Hitze zerstört, um so das in ihnen enthaltene Histamin freizusetzen und eventuell vorhandene Histaminase zu inaktivieren. Hierzu wurden 200 µl gewaschene Zellsuspension mit 800 µl Pipes B in einem Eppendorf-Cup (3.3.2.1) gemischt, dessen Deckel mit einer Kanüle für den später notwendigen Druckausgleich perforiert wurde. Die Probe wurde im Wasserbad für 10 min. gekocht und anschließend bei 8300 g 3 min. zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und für die Histaminbestimmung im RIA bei – 20 °C eingefroren. Da bei der physikalischen Freisetzung ein anderes Verdünnungsverhältnis der Zellsuspension als bei den anderen Freisetzungen verwendet wird, wird die im RIA gemessene Histaminkonzentration später mit dem Faktor 2,5 korrigiert.

Für alle anderen Histamin-Freisetzungen wurden in einem Eppendorf-Cup jeweils 250 µl der gewaschenen Zellensuspension zu 250 µl des jeweiligen Freisetzungsagens, gelöst in Pipes B, hinzugefügt, vorsichtig geschwenkt und für 60 min. bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Freisetzungsreaktion 20 min. auf Eis gestoppt und anschließend die Zellsuspension bei 700 g für 10 min. bei + 4 °C zentrifugiert. Die Überstände wurden bis zur Durchführung der Histaminbestimmung bei –20 °C eingefroren.

Die spontane Histamin-Freisetzung dient als Kontrolle, wie viel Histamin nur durch die mechanische Behandlung bei der Aufarbeitung ohne die Zugabe eines Stimulans freigesetzt wird. Hierbei besteht der Freisetzungspuffer nur aus Pipes A, dem Calcium und Magnesium hinzugefügt wurden (= Pipes B, siehe 3.3.2.3.1), um die zuvor durch EDTA gebundenen Ionen zu ersetzen. Die Finalkonzentration dieser Ionen betrug jeweils 1 mmol / l. Ca²⁺ und Mg²⁺ sind für den Release-Mechanismus von Histamin aus basophilen Granulozyten und Mastzellen unbedingt notwendig (MAGRO et al. 1987). Liegt der spontane Histamin-Release über 6 % des maximal freigesetzten Histamins, sollte die Probe nicht ausgewertet werden.

Diese Grenze ergab sich aus den Untersuchungen von KAUL (1998) und beruht auf dem Mittelwert aller gemessenen Spontanfreisetzungen zuzüglich der dreifachen Standardabweichung.

Bei der Antikörper-induzierten Freisetzung wird die Histaminfreisetzung durch eine Kreuzvernetzung der IgG bzw. der IgE auf der Zelloberfläche erreicht, indem der Zellsuspension Ziege anti Pferd IgG (H+L)-Antikörper (engl.: goat anti horse, gαh) bzw.

monoklonale Maus anti IgE-Antikörper (anti-IgE), gelöst in Pipes B, zugesetzt werden.

Hiermit erhält man Auskunft über die „generelle Sensibilisierung“ der pulmonalen Mastzellen ohne Kenntnis der Antigenspezifität der sensibilisierenden Antikörper. Diese Ansätze dienen als Positivkontrollen für das Testsystem.

Bei der Allergen-vermittelten Freisetzung werden die in der Suspension enthaltenen Zellen mit potenziellen Allergenen im Freisetzungspuffer (ebenfalls Pipes B) konfrontiert. Diese binden spezifisch an Epitope eventuell vorhandener Antikörper auf der Zelloberfläche und bewirken so durch eine Kreuzvernetzung von mindestens zwei IgE (ggf. auch IgG) eine Aktivierung der basophilen Granulozyten / Mastzellen und damit eine Histamin-Freisetzung.

Alle eingesetzten Allergene wurden in mindestens zwei Verdünnungsstufen (meist 50 µg / ml bzw. 5 µg / ml, Culicoides nubeculosus in 15 µg / ml bzw. 5 µg / ml) getestet.

Durch Zusatz von sonstigen Freisetzungsstimulantien wie Concanavalin A (Finalkonzentrationen 5 µg / ml bzw. 10 µg / ml) und einem Calcium-Ionenkanalblocker (Calcium-Ionophor A 23187; Finalkonzentrationen 1 µM bzw. 5 µM) sollte geprüft werden, inwieweit überhaupt die Reaktionskaskaden funktionieren.

Die Reaktion einer Stufe der entsprechenden Allergen- / Antikörper- / Stimulans-Verdünnungen galt als „positiv“, wenn die durch das Allergen vermittelte Histamin-Freisetzung mehr als 10 % der maximal möglichen Histamin-Freisetzung erreichte und die Probenserie nicht aufgrund einer zu hohen spontanen Freisetzung (> 6 % der Maximalfreisetzung) verworfen werden musste. War ein Release-Ansatz nur in der ersten von zwei Verdünnungsstufen positiv, wurde er mit „1+“ bewertet, war er dagegen in beiden Verdünnungsstufen positiv mit „2+“.

3.3.3.1.5 Bestimmung von Histamin im Radioimmunoassay (RIA) 3.3.3.1.5.1 Hintergrund

Histamin ist ein ubiquitärer Bestandteil in lebenden Organismen und weist in allen Lebewesen die gleiche Struktur auf. Daher werden gegen natives Histamin keine Antikörper gebildet. Um Histamin nachweisen zu können, muss es chemisch umgewandelt werden, z. B. durch Acylierung der Aminogruppe. Durch Vergrößerung der Seitenkette des Histamins verändert sich die räumliche Struktur des Moleküls und das Immunsystem ist in der Lage, Antikörper zu bilden. Das im Testsystem eingesetzte Antiserum stammt von Ziegen und enthält gegen acyliertes Histamin gerichtete Antikörper. Das in den untersuchten Proben enthaltene Histamin wird während der Testdurchführung acyliert und kann so erkannt werden.

3.3.3.1.5.2 Prinzip

Der Histamin-Nachweis beruht auf einem kompetitiven Radioimmunoassay zur Bestimmung von acyliertem Histamin. Neben den einzelnen acylierten Proben werden auch Standard-Histaminlösungen mit radioaktiv markiertem Histamin versetzt und zusammen mit Ziege anti N-Acyl-Histamin Serum inkubiert. Das unmarkierte Histamin aus den Proben konkurriert mit dem radioaktiv markierten Histamin um eine limitierte Anzahl von Antikörper-Bindungsstellen und es stellt sich ein dynamisches Gleichgewicht ein. Durch Zugabe eines gegen Ziegen-IgG gerichteten Antikörpers können die entstandenen Histamin-Antikörper-Komplexe gefällt und der Überstand mit dem überschüssigen Histamin entfernt werden. Die Aktivität der gefällten Komplexe wird im Gamma-Counter bestimmt. Aufgrund der Konkurrenz zwischen markiertem und unmarkiertem Histamin verhält sich die Aktivität der Probe reziprok zur Histaminkonzentration der Proben. Mit Hilfe der Standardkurven kann aus der Anzahl der registrierten Gamma-Zerfälle die Histamin-Konzentration der Proben berechnet werden. Es wurden immer Duplikatbestimmungen angesetzt.

3.3.3.1.5.3 Durchführung des Radioimmunoassay Acylierung der Proben:

Die Überstände aus der Histamin-Freisetzung (3.3.3.1.4) wurden aufgetaut und jeweils 100 µl in Polystyrol-Röhrchen (3.3.2.1) pipettiert. Jeweils 50 µl der Histamin-Standards in HCl (3.3.2.3.2) sowie je 50 µl 0,1 N HCl für B0-Bestimmung (Aktivität einer histaminfreien Probe) und NSB-Bestimmung (Aktivität der Nicht-spezifischen Bindung) wurden ebenfalls in Röhrchen pipettiert und zu diesen je 50 µl Pipes B hinzugefügt.

Das NHS-Biotin zur Acylierung (50 µl je Probe) wurde erst unmittelbar vor Gebrauch verdünnt (3.3.2.3.2), gut gemischt und zu allen Röhrchen hinzugefügt. Der Inhalt wurde gut vermischt und 30 min. bei Raumtemperatur inkubiert.

Radioimmunoassay:

In zwei leere Röhrchen (für die Bestimmung der Totalaktivität T) und zu den acylierten Proben wurde je 50 µl ¹²⁵Jod-Histamin-Tracer (3.3.2.3.2) gegeben. Mit Ausnahme der NSB- und T-Röhrchen wurde in jedes Röhrchen je 50 µl des N-Acyl-Histamin-Antiserums (3.3.2.3.2) pipettiert, wiederum gut gemischt und 16 bis 20 Stunden bei + 4 °C stehen

gelassen. Zur Fällung der gebildeten Immunkomplexe wurde 1 ml des + 4 °C kalten Esel anti Ziege IgG-Antikörpers hinzugefügt (außer zu T), die Röhrchen wurden gut gemischt, 15 min.

bei + 4 °C inkubiert und anschließend bei 1500 g 15 min. zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert (außer bei T) und anschließend die Aktivität (Anzahl der radioaktiven Zerfälle pro Minute) der Präzipitate im Gamma-Counter (3.3.1) gemessen.