3. MATERIAL UND METHODEN
3.2. Bearbeitung des Probenmaterials
3.2.4. Immunhistochemische Untersuchungen
3.2.4.3. Untersuchungsmethodik am Paraffinschnitt
Die Darstellung der von IgA, IgG und IgM erfolgte indirekt mittels der Avidin-Biotin-Komplex Methode (ABC-Methode).
Zunächst war eine Entparaffinisierung und Rehydrierung der Schnitte erforderlich, die mit drei Schritten für je fünf Minuten in Rotihistol, dann in Isopropanol, 96%igem sowie 70%igem Ethanol durchgeführt wurde. Zur Verhinderung übermäßiger Hinter-grundfärbung durch unspezifische Reaktionen mit dem Farbstoff wurden die Schnitte in mit 0,5%igem H2O2 versetztes 70%iges Ethanol verbracht. Die gewebeeigenen endogenen Peroxidasen werden hierbei durch den Überschuss an H2O2 irreversibel gehemmt.
Die Fixierung in Formalin und die anschließende Einbettung in Paraffin führt häufig zu einer Maskierung von Antigenen. Durch übermäßige Aldehydvernetzungen, Dena-turierungsvorgänge, die eine Strukturänderung des Antigens bewirken und Bildung
67 von Hydroxymethylenbrücken zwischen den basischen Aminosäuren der Epitope, kann eine Erkennung des Epitops durch den Antikörper verhindert werden. Um diese Effekte der Fixierung rückgängig zu machen, ist eine für jeden Antikörper spezifisch zu ermittelnde Vorbehandlung erforderlich. Bei den hier verwendeten Primärantikör-pern erfolgte die Vorbehandlung zur Demaskierung mit einer 0,05%igen Pronase-E-Lösung bei 37°C im Brutschrank. Den einzelnen Reaktionsschritten folgte jeweils dreimaliges Spülen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
Durch elektrostatische Anziehung kann es zu unspezifischen Bindungen von Protei-nen an bestimmte Gewebeelemente wie etwa stark geladene Bindegewebsbestand-teile kommen. Die damit einhergehende unspezifische Hintergrundfärbung kann durch Inkubation mit Normalserum, das bei 56°C 30 Minuten inaktiviert wurde, ver-mindert werden. Das Normalserum stammte von der Spezies, in der der sekundäre Antikörper hergestellt worden war (hier wurde Ziegenserum für IgA, IgG und IgM verwendet). Direkt im Anschluss folgte die Inkubation mit dem primären Antikörper, der in PBS mit 1%igem Zusatz von bovinem Serumalbumin (BSA) verdünnt wurde.
Durch das bovine Serumalbumin wurde wiederum Protein für unspezifische Bindun-gen zugeführt. Die VerdünnunBindun-gen der einzelnen Antikörper sind dem Anhang zu entnehmen. Die negative Kontrolle wurde mit Kaninchenserum (Verdünnung 1:4000 in PBS mit 1% BSA) überschichtet. Nach der spezifischen Reaktion zwischen gen und Primärantikörper erfolgte die Kopplung eines biotinylierten sekundären Anti-körpers an das Fc-Segment des primären AntiAnti-körpers. Der dann hinzugefügte Avi-din-Biotin-Peroxidase-Komplex bindet an das Biotinmolekül des sekundären Antikör-pers. Die im ABC-Komplex enthaltene Peroxidase fällt unter Zugabe des Elektronen-donors Wasserstoffperoxid (H2O2; Fa. Riedel-de-Haen, Seelze) das Chromogen 3,3‘-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB; Fa. Buchs, Schweiz) zu einem braunen Farbniederschlag aus. Dieses Reaktionsprodukt ist sehr stabil und lagert sich in unmittelbarer Nähe zum Antigen ab, so dass eine genaue lichtmikroskopische Zu-ordnung möglich ist.
Die Gegenfärbung erfolgte mit Hämalaun nach Mayer. Eingedeckt wurden die Schnitte mit Rotikit (Fa. Roth, Karlsruhe).
Eine Übersicht zur Durchführung der ABC-Methode findet sich im Anhang.
68 3.2.5. Nierenfunktionsprüfung
3.2.5.1. Untersuchungsmethodik
Von den lebend angelieferten PDNS-Tieren (n=32) wurden bei Anlieferung zunächst Blutproben (jeweils eine EDTA- und eine Serumprobe) genommen. Unmittelbar da-nach wurden die Tiere mittels Elektrozange getötet, die Bauchhöhle eröffnet und direkt aus der Harnblase eine sterile Harnprobe gewonnen. Analog dazu wurden bei sieben Tieren, die pathomorphologisch keine Veränderungen wie bei PDNS aufwie-sen, in gleicher Weise Blut- und Harnproben gewonnen. Diese sieben Tiere dienten als Kontrollgruppe. In der Tabelle 1 sind die in Blut, Plasma und Harn analysierten Meßgrößen mit der jeweiligen Untersuchungsmethodik sowie dem Variationskoeffi-zienten (Vk) für den methodischen Fehler zusammengestellt. Bezüglich der Harnauf-bereitung ist zu ergänzen, dass vor dem Zentrifugieren der Harn mit 0,36normaler Perchlorsäure im Verhältnis 1:6 angesäuert wurde (Auflösen von mineralischem Sediment).
Tabelle 1: In Blut, Plasma und Harn analysierte Messgrößen, dazugehörige Untersu-chungsmethodik und Variationskoeffizienten (Vk)
Messgröße Methodik Firma, Ort Vk (%)
Blut
HTK Mikrozentrifugation 1,0
Hb Cyanhämiglobin,
Kreatinin enzym. Farbtest,
Kreatininase, Kreatinin PAP*
Labor u. Technik, Berlin 7,5
Harnstoff Urease** Labor u. Technik, Berlin 1,3
Natrium Flammenphotometer Bayer Diagnostics,
Fernwald
0,78
69 Fortsetzung Tab. 1
Messgröße Methodik Firma, Ort Vk (%)
Kalium Flammenphotometer Bayer Diagnostics,
Fernwald
0,66
Kalzium o-Kresolphtalein* Roche, Mannheim 4,8
Phosphor Molybdänblau* Labor u. Technik, Berlin 4,9
Harn
Kreatinin enzym. Farbtest,
Kreatininase, Kreatinin PAP*
Labor u. Technik, Berlin 7,5
Natrium Flammenphotometer Bayer Diagnostics,
Fernwald
0,78
Kalium Flammenphotometer Bayer Diagnostics,
Fernwald
0,66
Kalzium o-Kresolphtalein* Roche Diagnostics,
Mannheim
4,8
Phosphor Molybdänblau* Labor u. Technik, Berlin 4,9
GGT enzym. Farbtest,
Glycylgly-cin*
Labor u. Technik, Berlin 8,5
Protein Teststreifen, Combur-9-Test Roche Diagnostics, Mannheim
Spez. Gewicht Refraktometrie ≤ 0,1
*Spektralphotometer Uvikon 930, Bio-Tek, Bad Friedrichshall
**Reflotron, Roche Diagnostics, Mannheim
3.2.5.2. Auswertung
Die endogene Kreatininclearance wurde durch Schätzung der renalen Exkretion des Kreatinins (ohne quantitative Harnsammlung) und Bestimmung der Plasma-Kreatinin-Konzentration (Pl-Creat) ermittelt. Unter der Annahme einer konstanten Kreatininfreisetzung aus der Muskulatur in das Plasma und einer ausschließlich renalen Kreatininelimination aus dem Plasma kann ohne die aufwendige Messung des Harnzeitvolumens (Vu) die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) als endogene
Krea-70 tininclearance, das Vu und damit auch die renale Clearance und Ausscheidung an-derer Substanzen (Exkretion (E)) geschätzt werden, wenn E-Kreat der betreffenden Tierart und Alters- bzw. Gewichtsgruppe bekannt ist und Plasma (Pl)- sowie Harn (U)-Konzentrationen der betreffenden Substanzen bestimmt werden (WALDMANN et al. 1991):
GFR = E-Kreat/Pl-Kreat (µl/min/kg)
Vu = E-Kreat/U-Kreat (µl/min/kg)
Clr-Na = (E-Kreat/U-Kreat) x (U-Na/Pl-Na) (µl/min/kg)
E-Na = (E-Kreat/U-Kreat) x U-Na (nmol/min/kg)
E-Kreat wurde als gewichtsabhängige Konstante (in Tabelle 2 dargestellt) geschätzt und sowohl das Harnzeitvolumen als auch die GFR daraus ermittelt. Die entspre-chende Formel für diese Schätzung wurde aus einer Arbeit an 79 Schweinen im Gewichtsbereich zwischen 1,5 und 230 kg, in der eine enge Korrelation zwischen E-Kreat und dem Körpergewicht bewiesen werden konnte, übernommen (WALDMANN et al. 1991):
E-Kreat (nmol/min/kg) = 83,6 x lg (Gewicht(kg)) + 86,1
In einer Untersuchung an ausschließlich ausgewachsenen Sauen ließ sich eine der-artig gewichtsabhängige Kreatinin-Exkretion nicht nachweisen (WENDT 1992). Für Schweine ab 100 kg Körpermasse kann demnach eine konstante mittlere Kreatinin-Exkretion von 250 nmol/min/kg angenommen werden.
Da das genaue Gewicht der zur Sektion gelieferten Schweine nicht bestimmt werden konnte, wurden diese nach Gewichtklassen (Absetzferkel 7-25 kg; Vormasttiere 25-50 kg; Mittelmasttiere 25-50-70 kg; Endmasttiere 70-110 kg; Sauen 120-225-50 kg)
einge-71 teilt und für die Schätzung das in Tabelle 2 angegebene Bezugskörpergewicht ver-wendet.
Tab. 2: E-Kreat für unterschiedliche Gewichtsklassen
Gewichtsklasse (kg) Bezugskörpergewicht (kg) E-Kreat (nmol/min/kg)
Absetzferkel (7-25) 15 184
Vormast (25-50) 35 215
Mittelmast (50-70) 60 235
Endmast (70-110) 80 245
Sauen (120-250 kg) 250
Darüber hinaus wurde für Wasser sowie Harnstoff, Na, K, Ca und P die fraktionelle Exkretion (FE), das heißt der Anteil im Harn ausgeschiedener Menge an glomerulär filtrierter Substanz, unabhängig von E-Kreat und Vu berechnet:
FE-Wasser = (Pl-Kreat/U-Kreat) x 100 (%)
FE-Na = (Pl-Kreat/U-Kreat) x (U-Na/Pl-Na) x 100 (%)
Außerdem wurde bei einigen der Tiere (n= 17) Gamma-GT im Harn bestimmt. Aus dem Verhältnis von U-GGT und U-Kreat kann auf eventuell vorhandene Tubulo-pathien geschossen werden (PRICE 1982).
Zur Auswertung der im Rahmen dieser Nierenfunktionsprüfung gewonnenen Daten wurden insgesamt drei Gruppen von Tieren zusammengestellt. Bei allen Tieren mit der Diagnose PDNS (n=32) wurde eine Einteilung in akute (n=11) und chronische (n=21) Nierenveränderungen vorgenommen. Die dritte Gruppe setzte sich aus soge-nannten Kontrolltieren (n=7), die zwar PCV2-positiv, aber sowohl makroskopisch wie auch histologisch keine Veränderungen in den Nieren aufwiesen, zusammen. Von akuten Nierenveränderungen wird in dieser Untersuchung dann ausgegangen, wenn
72 es sich nicht um sklerosierende Veränderungen handelt, analog dazu handelt es sich um chronische Nierenveränderungen, wenn Sklerosen auftreten.
Es wurden alle quantitativen Parameter auf ihre Normalverteilung hin überprüft. Pa-rameter, die logarithmisch normalverteilt waren, sind entsprechend gekennzeichnet.
Um die Gruppen vergleichen zu können, erfolgte die Bestimmung der entsprechen-den Mittelwerte und Standardabweichungen sowie die Durchführung einer hierarchi-schen Varianzanalyse (SACHS 1968).
73