Genomnachweis von PCV2 mittels PCR aus Gewebeproben

Bei n=60 Tieren wurde Material des Inguinallymphknotens und bei n=22 Tieren zu-sätzlich Nieren- und Hautgewebeproben zum Nachweis auf PCV2 untersucht.

Die bei der Sektion entnommenen und dann bei -20° C gelagerten Gewebeproben (inguinaler Lymphknoten, Niere, Haut) wurden mittels Polymerase-Chain-Reaction (PCR) auf Genomfragmente von PCV2 untersucht.

Zur DNA-Extraktion wurde der Nucleospin C+T-Extraktionskit (Machery-Nagel, Dü-ren) verwendet. Dazu wurden 25mg Gewebe einer Probe mittels einer sterilen Skal-pellklinge vorzerkleinert und in ein 1,5ml safe-locked Eppendorf-Gefäß gegeben.

Hierzu wurden 180µl T-Lysispuffer und 25µl Proteinase-K-Lösung pipettiert und dies dann für 3 bis 12 Stunden bei 56°C unter ständigem Schütteln bis zur Lysis inkubiert.

Die Zugabe von 200µl Puffer B3 setzt die Nukleinsäuren frei. Nach dem Schütteln der Probe wurde diese für 10 Minuten bei 70°C inkubiert. Anschließend führte die Zugabe von 210µl Ethanol (96%) zur Präzipitation der DNA. Der Inhalt des Cups wurde dann in den Filtereinsatz der Extraktionskolumnen überführt und dies dann bei 6000g für eine Minute zentrifugiert. Der Filter, der die genomische DNA adsorbiert, wurde anschließend zweimal mit jeweils 500µl Puffer B5 gewaschen. Dazu wurde die Probe jeweils bei 6000g für eine Minute zentrifugiert und das Filtrat jeweils verwor-fen. Zur Beseitigung von Waschpufferresten wurde die Probe nochmals für zwei Minuten bei 6000g zentrifugiert und dann der Filtereinsatz in ein 1,5ml safe-locked Cup gegeben. Danach wurden 100µl des 70°C warmen Elutionspuffers BE auf den Filtereinsatz gegeben und dieses für eine Minute bei 70°C inkubiert, um die DNA aus

56 dem Filter in die Lösung zu überführen. Die Zentrifugation bei 6000g für eine Minute beschleunigte diesen Vorgang.

Anschließend wurde der Master-Mix unter sterilen Bedingungen mit dem Taq Core Kit (Quiagen GmbH, Hilden) und den nach MOROZOV et al. (1998) PCV2-spezifischen Primern

• PCV75 (GGG TGT TCA CGC TGA ATA ATC CTT CGG) und

• PCV1073 (CCA GGA CTA CAA TAT CCG TGT AAC C)

(MWG-Biotech AG, Ebersbach) hergestellt. 45 µl Mastermix enthielten folgende Substanzen:

5µl 10 fach Taq Puffer 5µl MgCl 2

0,5µl DNTP Mix 25mM

1µl Primer PCV 75 10 pm / µl 1µl Primer PCV 1073 10 pm / µl 0,5µl Taq Polymerase 5u / µl 32µl Wasser

Für die Polymerase Chain Reaction (PCR) wurde diese Lösung zur Template-DNA hinzugefügt und dann in den Thermocycler GeneAmp PCR System 9700 der Firma PE Applied Biosystems (Norwalk, USA) verbracht. Für 20 Sekunden erfolgte eine Denaturierung bei 94°C, Annealing für 20 Sekunden bei 62°C und Extension für 45 Sekunden bei 72°C. Nach 30 Zyklen folgte eine Extension von 7 Minuten. Die Aus-wertung erfolgte über Gelelektrophorese mit anschließender Photodokumentation.

Dabei wurde die Bande mit der DNA-Leiter (DNA Molecular Weight Marker No. 6;

0,15-2,1 kbp / Boehringer, Mannheim) verglichen. Eine Bande von circa 1020 Ba-senpaare (bp) zeigte den Nachweis des gesuchten Genomfragments an (TSCHACHTSCHAL 2000) (Abb. 4).

57 3.2.2. Bakteriologische Untersuchungen

Die bakteriologische Untersuchung wurde im Rahmen der Routinediagnostik in der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule in Bakum durchgeführt.

Bei Hinweisen auf das Vorliegen von bakteriellen Infektionen wurden gegebenenfalls Tupfer- und Organproben entnommen. Diese sind standardgemäß auf vier Fertig-nährböden, nämlich

1. Kochblutagar (144e) 2. Columbia-Blutagar (109e)

3. Columbia-Blutagar mit CNA (383e) 4. Gassner-Agar (154e)

der Firma heipha Dr. Müller GmbH (Heidelberg) ausgestrichen und für 16 bis 18 (aerob) bzw. für 48 Stunden (Kochblutagar mikroaerophil) bei 37°C bebrütet worden.

Anschließend fand eine Keimbestimmung nach den üblichen biochemischen und serologischen Methoden statt.

Bei allen Tieren mit Nierenveränderungen wurde eine kulturell-mikrobiologische Untersuchung der Niere durchgeführt. Bakteriologische Untersuchungen anderer Organe (Lunge, Darm, Gelenk, Harnblase) wurden bei entsprechenden Organverän-derungen eingeleitet.

Bei den meisten Tieren wurde routinemäßig – wie es im Untersuchungzeitraum an der Außenstelle für Epidemiologie üblich war, um einen Überblick hinsichtlich des Salmonellenvorkommen zu gewinnen - eine Untersuchung auf Salmonellen mittels Anreicherungsverfahren (nach ISO 6579 modifiziert) durchgeführt. Dazu wurden die entnommenen Organteile (Gallenblase, Leber und mesenterialer Lymphknoten) von einem oder mehreren Tieren (wenn aus einem Bestand) zur Voranreicherung für 16 bis 18 Stunden in einer Verdünnung von 1:10 in gepuffertem Peptonwasser (CM 05099 B, Oxoid, Wesel) angesetzt. Danach wurde die Selektivbouillon Rappaport-Vassiliadis (CM 0866 B, Oxoid, Wesel) im Verhältnis 1:100 mit dem Peptonwasser beimpft und 16 bis 18 Stunden bei 42°C inkubiert. Diese Lösung wurde auf die Se-lektivnährböden RAMBACH-Agar (1.13108.0001; Merck, Darmstadt) und

Xylose-58 Laktose-Dextrose-Agar (152e,heipha, Heidelberg) abgeimpft und bei 37°C bis zu 48 Stunden bebrütet. Anschließend fand eine Keimdifferenzierung nach den üblichen serologischen und biochemischen Methoden statt.

Bei Verdacht auf eine Infektion mit Lawsonia intracellularis wurde ein entsprechend verändertes Darmstück entnommen und zur immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchung (BONITZ 2001) an die Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover weitergeleitet.

Der Übersichtlichkeit halber werden sowohl makroskopisch sichtbare Nieren- und Hautveränderungen wie auch die Veränderungen der Lnn. inguinales superficiales in einem Zahlenschlüssel angegeben, der im Folgenden kurz dargestellt wird:

Grad und Qualität der Nierenveränderungen:

1= bilateral geringgradig vergrößert und von sehr fester Konsistenz

2= bilateral geringgradig vergrößert und petechiale Blutungen im Bereich der Nieren-rinde

3= bilateral geringradig vergrößert und ödematisiertes Nierenbecken

4= bilateral geringgradig vergrößert und petechiale Blutungen im Bereich der Nieren-rinde und ödematisiertes Nierenbecken

5= bilateral mittelgradig vergrößert und petechiale Blutungen im Bereich der Nieren-rinde und ödematisiertes Nierenbecken

6= bilateral hochgradig vergrößert und petechiale Blutungen im Bereich der Nieren-rinde und ödematisiertes Nierenbecken

Ausbreitung der Hautveränderungen:

0= ohne besonderen Befund

1= geringgradige Haut- und Unterhautblutungen (perianal)

2= mittelgradige Haut- und Unterhautblutungen (perianal und Hintergliedmaßen;

Hintergliedmaßen und Vordergliedmaßen; Hintergliedmaßen und Ohren)

59 3= hochgradige Haut- und Unterhautblutungen (gesamte Körperoberfläche; Vorder-gliedmaßen und HinterVorder-gliedmaßen und Ohren; VorderVorder-gliedmaßen und Hinterglied-maßen und Gesäuge und Ohren)

4= hochgradige Haut- und Unterhautblutungen mit fokal oder flächenhaften nekroti-schen Arealen

Veränderungen der Lymphknoten:

0= ohne besonderen Befund

1= generalisierte Lymphknotenhyperplasie

2= generalisierte Lymphknotenhyperplasie und -hämorrhagie