Untersuchungsmethoden

6.1.2.1 Klinische Untersuchungsparameter

Bei der täglichen Untersuchung ist die Beobachtung und Beurteilung des Aktivitätsverhaltens der Tiere ein wichtiger Parameter, der aussagekräftige Hinweise auf den Allgemeinzustand gibt. Voraussetzung sind definierte Untersuchungszeitpunkte während der Aktivitätsphase und ohne Manipulation, die zu Stress bei den Tieren führt und somit das Verhalten verändert. Bei der Bewertung wird das Interesse an Artgenossen und an der Umwelt sowie Schläfrigkeit berücksichtigt und bei eingeschränkter Aktivität auch Reaktionen auf Zuwendung (VAN GRIENSVEN et al. 2002a).

Ein weiterer Parameter der täglichen Visite ist die Körperinnentemperatur, welche die Homöostase erfasst und ein Indikator für die Stoffwechselaktivität ist. Eine erhöhte Temperatur lässt auf eine Steigerung des Stoffwechsels durch Inflammation oder gesteigerte Aktivität schließen. Wichtig ist hierbei, dass die Temperatur vor der weiteren Manipulation, wie das Wiegen der Tiere, stattfindet, um nicht durch möglichen Stress veränderte Werte zu erhalten. Ein Polytrauma kann zu einer Erniedrigung der Körpertemperatur führen. Bei herabgesetzter Körpertemperatur sind die Kapazitäten des Körpers zur Thermoregulation erschöpft. Eine Hypothermie ist ein wichtiger Prognosefaktor für die Letalität (MALONE et al. 2001; HILDEBRAND et al. 2004).

Bereits kleinste Einschränkungen des Wohlbefindens spiegeln sich auch im Fressverhalten wider. Da eine diesbezügliche Veränderung jedoch aufgrund der

Ad-Libitum-Fütterung schwierig zu beobachten ist, wurde die Körpergewichtsentwicklung kontrolliert. Hierdurch konnte eine herabgesetzte Nahrungsaufnahme bzw. ein krankheitsbedingter Katabolismus erfasst werden.

6.1.2.2 Kapilläre Permeabilität der Lunge

Es existieren verschiedene Methoden, um den Grad der Lungenschädigung quantitativ zu erfassen. Die Bestimmung des relativen Proteingehaltes der BAL bezogen auf den Proteingehalt im Plasma in Kombination mit der Quantifizierung der neutrophilen Granulozyten mit Hilfe histologischer Präparate gilt gegenwärtig als Standard. Die Kombination von zwei unterschiedlichen Methoden ist dabei ausreichend, um eine pathophysiologisch signifikante Veränderung der endothelialen Permeabilität nachzuweisen (PETERSON 1992). Die Quantifizierung des genannten BAL/Plasma-Proteinverhältnisses (relativer Proteingehalt der BAL) ist in Kleintier- und Großtiermodellen hinreichend validiert (KLAUSNER et al. 1989; SEEKAMP u.

WARD 1993).

6.1.2.3 Auswertung der histologischen Präparate

Die histologische Untersuchung der Organe erfolgte anhand fixierter 5 µm dicker Paraffinschnitte, die unterschiedlichen Färbemethoden unterzogen wurden. Die repräsentativen Präparate von Lunge, Leber, Milz und Niere wurden mit einer Übersichtsfärbung mit H.E. gefärbt und mit Hilfe eines etablierten semiquantitativen Bewertungssystems ausgewertet (VAN GRIENSVEN 1999). Jeder fünfte Gehirnschnitt wurde ebenfalls einer H.E.-Färbung unterzogen. Sie diente hierbei der Übersicht und morphologischen Beurteilung sowie der Bestimmung der relativen Cortexdicke zur Quantifizierung eines möglichen Gehirnödems. Für die Auswertung der weiteren Gehirnpräparate wurden eine Nissl- bzw. GFAP-Färbung durchgeführt und die Schnitte anschließend lichtmikroskopisch untersucht. Die Nissl-Färbung dient der Übersicht über die neuronale Zellstruktur. Es wurde eine qualitative Auswertung trauma- bzw. hypoxiebedingter Schädigungen durchgeführt (HICKS et al. 1993).

GFAP, die Hauptkomponente des Zytoskeletts differenzierter Astrozyten, stellt einen empfindlichen Marker dar, um die umfassende Reaktion des Gehirns auf eine fokale

Verletzung in Bezug auf progressive degenerative und regenerative Prozesse zu beurteilen (DIETRICH et al. 1999). Nach traumatischer Hirnschädigung nehmen Astrozyten, die durch Zytokine und Wachstumsfaktoren aktiviert werden, in der Phase der Gewebereparation eine zentrale Stellung ein. Experimentelle Untersuchungen zeigten eine vorübergehend erhöhte Expression des Intermediärfilaments GFAP, wobei die Aktivitätserhöhung bereits vier bis 24 Stunden nach Trauma nachweisbar und nach drei Tagen sehr deutlich ausgeprägt war (DIETRICH et al. 1999). Die immunhistochemische Anfärbung von GFAP stellt in diesem Zusammenhang den Ausdruck einer traumatisch induzierten Astrozytenaktivierung dar. Um diese zu quantifizieren, wurde sowohl auf der ipsilateralen als auch auf der kontralateralen Seite im Cortex und im Hippocampus die Anzahl der angefärbten Astrozyten pro Fläche ausgezählt. In diesen Bereichen sind traumainduzierte astrozytäre Reaktionen beschrieben worden (SMITH et al.

1995; DIETRICH et al. 1999). Bei der Interpretation der GFAP-positiven Astrozyten ist zu beachten, dass es in der Literatur keine einheitliche Beschreibung über die Normalverteilung im Cortex gibt. Um eine repräsentative Aussage zu erhalten, wurden jeweils drei Schnitte aus dem Bereich der maximalen Traumaausprägung bzw. der entsprechenden Gehirnregion bei den Fraktur-Schock-Tieren für die Auswertung ausgewählt. Im Cortex wurden pro Gehirnschnitt drei charakteristische Bereiche in den mittleren bis tiefen Cortexschichten (Lamina pyramidalis externa bis Lamina multiformis) definiert. Dadurch wurde erreicht, dass die astrozytären Reaktionen, die bei schwächer ausgeprägter Gliose vornehmlich in den tiefsten Schichten am Übergang zur weißen Substanz vorzufinden waren, Berücksichtigung fanden. Die definierten Regionen umfassten das Cingulum, einen Bereich deutlich ausgeprägter Astrogliose im medialen Randgebiet, eine Fläche auf Höhe der Capsula interna im lateralen Randbereich und eine Region mittig zwischen den anderen, um damit einen möglichst großen und repräsentativen Teil des Cortex abzudecken. Im Hippocampus wurden jeweils vier definierte Bereiche berücksichtigt, die sowohl die CA1-, CA2- und CA3-Regionen als auch den Gyrus dentatus umfassten, um die astrozytäre Reaktion, die teilweise den gesamten Hippocampus

betraf, zu erfassen. Für diese Regionen ist eine Astrogliose nach Schädelhirntrauma beschrieben (CORTEZ et al. 1989; SMITH et al. 1995; HILL et al. 1996).

Die mittlere Astrozytenzahl pro mm² diente der Quantifizierung und statistischen Auswertung. Bei dieser Form der Beurteilung ist zu beachten, dass jeglicher GFAP-positive Astrozyt gezählt wurde. Dieses Verfahren wurde so gewählt, da die Färbung der Präparate in mehr als einer Färbeprozedur keine komplett einheitlich starke Anfärbung der Astrozyten gewährleisten konnte. Aus diesem Grund wurde auf eine Berücksichtigung der Hypertrophie innerhalb der astrozytären Gliareaktion verzichtet.

Als Grundlage zur Quantifizierung der reaktiven Gliose diente daher die Hyperplasie.

6.1.2.4 Typ-IV-Reaktion

Das Auslösen und die quantitative Erfassung einer Kontakthypersensibilitätsreaktion (Typ-IV-Reaktion) dient im Tierversuch als Maß für die Aktivierung des Immunsystems. Hierzu wurde die Ödematisierung des Ohres (Ohrdickenzunahme) 24 Stunden nach Zweitkontakt mit dem Allergen DNFB (2,4-Dinitrofluorobenzen) bestimmt. Es handelt sich hierbei um ein etabliertes Verfahren, das mittlerweile weite Verbreitung gefunden hat (PHANUPHAK et al. 1974; DHABHAR u. MCEWEN 1997).

6.1.2.5 Durchflusszytometrie

Die Zellanalyse mit Hilfe der Durchflusszytometrie hat einen alltäglichen Platz sowohl in der Klinik als auch in der Forschung eingenommen und konzentriert sich derzeit auf die Detektion von antigenspezifischen T-Zellen und dendritischen Zellen sowie zirkulierenden metastatischen Tumorzellen. Die Immunophänotypisierung von Lymphozytensubpopulationen anhand spezifischer Oberflächenantigene ist der am meisten genutzte Multiparametertest innerhalb der Durchflusszytometrie (MARTI et al. 2001). In der vorliegenden Arbeit wurde dieses Verfahren angewendet, um verschiedene Lymphozytensubpopulationen (CD4⁺-, CD8⁺-, CD4⁺CD8⁺-T-Zellen und NK-Zellen) in der Milzsuspension zu bestimmen.

Neben der Untersuchung bestimmter Zellen ist es inzwischen auch möglich, Zytokine mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, indem sie an spezifische „Capture-Beads“ koppelt werden, welche durchflusszytometrisch detektierbar sind.

Unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaften der verschiedener „Beads“ ermöglichen es, mehrere Zytokine gleichzeitig in einer Probe zu messen. Dies führt dazu, dass für die Messung diverser Zytokine insgesamt ein relativ kleines Probenvolumen erforderlich ist (CHEN et al. 1999), was insbesondere bei der vorliegenden Studie an der Spezies Maus von Bedeutung war. Die Sensitivität eines solchen Tests ist dabei mit einem herkömmlichen ELISA vergleichbar. Mit Hilfe dieser Methode in Form eines standardisierten „Cytometric Bead Arrays“ wurden die Konzentrationen von sechs verschiedenen Zytokinen (TNF-α, MCP-1, IL-6, IL-10, IL-12p70, IFN-γ) im Plasma der Mäuse bestimmt.

Die Bestimmung systemischer Zytokinspiegel ist nicht unumstritten. Kurze Halbwertszeiten und variable Bioverfügbarkeiten müssen bei der Interpretation der Daten berücksichtigt werden. Manche Autoren greifen deswegen auf die Zytokinproduktion bestimmter Zellen zurück (JAWA et al. 2006). Aber auch hier müssen Einflussfaktoren wie die Manipulation bei der Isolierung der Zellen als auch die Art ihrer Stimulation bedacht werden. Die Bestimmung systemischer Zytokinkonzentrationen ist daher weiterhin in Klinik und Forschung eine verbreitete Methode zur Einschätzung der Inflammationsreaktion.

6.2 Diskussion Ergebnisse