Histologische Aufbereitung

Die nach der Organentnahme in 4%igem gepufferten Formalin fixierten Organe (Lunge, Leber, Milz, Niere und Gehirn) wurden in entsprechende Einbettkassetten (Roth, Karlsruhe) verbracht und über Nacht mit Hilfe eines Einbettautomaten mit Einkammersystem (Shandon, Frankfurt) in Paraffin (Gewebeeinbettmittel, Vogel-Histo-Comp^, Vogel, Gießen) eingebettet. Mit einem Microtom (HM 355, MICROM GmbH, Walldorf) wurden Schnitte mit einer Dicke von 5 µm angefertigt.

Dabei wurden die Gehirne vom Übergang des Bulbus olfactorius zum Cerebrum bis zum Erreichen des Cerebellums in Serien von jeweils fünf Objektträgern angefertigt, bei denen alternierend zweimal zwei Gehirnschnitte pro Objektträger aufgenommen wurden, während dazwischen außer in der Traumaregion, die etwa zwischen Bregma -0,7 mm und Bregma -2,9 mm lag, ungefähr 30 Schnitte verworfen wurden.

Alle aufgenommenen und verworfenen Gehirnschnitte wurden in einer Tabelle dokumentiert. Bei den restlichen Organen wurden jeweils zwei bis drei repräsentative Schnitte aufgenommen. Die Schnitte wurden dabei vorsichtig mit einem Pinsel von dem Messer abgelöst und zum Strecken in ein auf knapp 40°C beheiztes Wasserbad (GFL^® Typ 1052, GFL, Burgwedel) überführt. Von dort wurden sie mit einem Objektträger (Super Frost Plus, Menzel Gläser, Braunschweig) aufgenommen und zum Trocknen in eine verschließbare Präparatemappe gelegt.

Nach einer Trocknungszeit von mindestens 24 Stunden wurden die Präparate gefärbt. Dabei wurden Lunge, Leber, Milz und Niere mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, das Gehirn sowohl einer H.E.- als auch einer Nissl-Färbung mit Kresylviolett und einer immunhistochemischen GFAP-Färbung unterzogen. Bei allen Färbungen wurden die Präparate zum Entfernen des Paraffins zweimal für zehn Minuten in Xylol

(J.T. Baker, Deventer, Niederlande) verbracht. Die Rehydrierung erfolgte mit Hilfe einer absteigenden Alkoholreihe.

4.4.2.1 H.E.-Färbung

Hämatoxylin ist ein natürlicher, aus Blauholz gewonnener Pflanzenfarbstoff und der am meisten benutzte Kernfarbstoff. Er färbt Zellkerne blau bis dunkelblau. Die Gegenfärbung zu Hämatoxylin ist im Allgemeinen Eosin, ein zur Fluorescein-Gruppe gehörender schwach saurer Farbstoff, der das Zytoplasma kräftig rot färbt.

Sowohl jeder fünfte Gehirnschnitt, als auch alle Lungen-, Milz-, Nieren- und Leberschnitte wurden mit H.E. gefärbt. Nach erfolgter Entparaffinierung mit Xylol und Rehydrierung mit Hilfe der absteigenden Alkoholreihe wurden die Präparate gewässert. Es schloss sich eine dreiminütige Färbung mit Hämatoxylin (Thermo Harris Hämatoxylin, Thermo Shandon, Pittsburgh, USA) an. Dann verblieben die Schnitte wieder für einige Minuten zum Bläuen in fließendem Leitungswasser. Es folgte ein Differenzierungsschritt für eine Sekunde in mit Salzsäure versetztem Ethanol. Nach einigen Minuten in fließendes Leitungswasser und danach in destilliertem Wasser, folgte eine zweiminütige Färbung mit Eosin (Thermo Eosin Instant, Thermo Shandon, Pittsburgh, USA) und danach noch einmal zwei Bäder in destilliertem Wasser, bevor die aufsteigende Alkoholreihe begann. Zum Schluss wurden die Präparate noch dreimal in Xylol verbracht und danach mit Hilfe von Entellan (Schnelleindeckmittel, Merck, Darmstadt) mit einem Deckglas (Menzel Gläser, Braunschweig) eingedeckt. Das exakte Färbeprotokoll befindet sich im Anhang.

4.4.2.2 Nissl-Färbung

Mit Hilfe der Nissl-Färbung wurden selektiv die Neuronen dargestellt. Durch elektropolare Anlagerung des basischen Farbstoffs Kresylviolett an die sauren Gruppen der Nukleinsäuren werden hierbei die Kerne und Nisslschollen (rauhes endoplasmatisches Retikulum) der Nervenzellen angefärbt.

Eine Anleitung zur Herstellung der für die Färbung benötigten Kresylviolettlösung (Kresylechtviolett, Waldeck GmbH, Münster) sowie das Färbeprotokoll befinden sich

im Anhang. Nach Entparaffinierung in Xylol und Rehydrierung in der absteigenden Alkoholreihe verblieben die Präparate für zwei Minuten in destilliertem Wasser.

Darauf folgte die Färbung in 0,5%iger auf 39°C erhitzter Kresylviolettlösung für sechs Minuten und eine Differenzieren für 90 Sekunden in ein Gemisch aus Essigsäure und destilliertem Wasser (1:1000). Anschließend wurden die Objektträger für jeweils fünf Minuten in 70%iges bzw. 96%iges Ethanol verbracht und danach erneut für 90 Sekunden in einer Mischung aus Essigsäure und 96%igem Ethanol (1:1000) differenziert. Zum Schluss verblieben sie je zweimal für fünf Minuten in 100%igem Isopropanol (Merck, Darmstadt) bzw. Xylol, bevor sie mit einem Deckglas und Entellan eingedeckt wurden.

4.4.2.3 GFAP-Färbung

Eine Verletzung des Zentralnervensystems (ZNS) führt zu einer Hypertrophie und Hyperplasie der Astrozyten und zu einem erheblichen Anstieg des Gehaltes an saurem Gliafilamentprotein (GFAP), einer der Hauptkomponenten des Zytoskeletts differenzierter Astrozyten (ENG 1985). GFAP fand daher als spezifischer Marker für reaktive Astrozyten Verwendung.

Für die immunhistochemische GFAP-Färbung folgten der Entparaffinierung und Rehydrierung drei Spülschritte mit PBS (Phosphate Buffered Saline). Zum Blockieren der endogenen Peroxidase, die zu Hintergrundfärbungen führen könnte, verblieben die Objektträger im Dunkeln für 15 Minuten in mit 0,6% Wasserstoffperoxid (H₂O₂) versetztem Methanol. In den darauf folgenden Spülschritten wurde dem PBS 0,1% Tween^ (Tween^ 20 Detergent, Merck, Darmstadt) zur Reduktion der Oberflächenspannung beigemischt. Anschließend wurden die Objektträger in Shandon-Clips (Shandon, Pittsburgh, USA) eingeklemmt und PBS mit 5% Schweine-Normalserum (Swine Serum (Normal), DakoCytomation X0901) darauf pipettiert. Das Normalserum dient der Absättigung von elektrostatischen Ladungen der Proteine im Untersuchungsgut, was zu einer Reduzierung der unspezifischen Adsorption von Antikörpern am Gewebe führt, um letztendlich unspezifische Anfärbungen zu verhindern.

Nach 20 Minuten folgte ein 60-minütiger Inkubationsschritt mit dem Primärantikörper aus Kaninchen (Polyclonal Rabbit Anti-Cow-GFAP, DakoCytomation Z 0334) in einer Verdünnung von 1:400. Dem PBS wurde bei diesem Schritt 1% BSA (bovines Serumalbumin, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) zugesetzt. Nach dreimaliger Spülung mit Tween^-haltigem PBS folgte die Inkubation mit dem biotinylierten Sekundärantikörper aus Schweinen (Polyclonal Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/Biotinylated, DakoCytomation E0353) in einer Verdünnung von 1:500. Diesmal wurden dem PBS 1,5% Schweine-Normalserum und 5% Mäuse-Normalserum (Mouse Serum (Normal), DakoCytomation X0910) beigemischt.

Nach 60-minütiger Inkubation folgte eine erneute Spülung mit Tween^-haltigem PBS.

Danach wurde für 30 Minuten der StreptABComplex/HRP (Streptavidin-Biotin-Komplex/Horseradish Peroxidase, DakoCytomation K 0377) aufgetragen. Man nutzt hierbei die starke Affinität von Streptavidin zu Biotin. Der Enzymkomplex entsteht durch Bindung des Enzyms Merrettichperoxidase über Biotin an das Streptavidin, wobei eine Bindungsstelle frei bleibt, die dann der Kopplung an den biotinmarkierten Sekundärantikörper dient.

Nach drei Spülschritten wurde unter dem Abzug für fünf Minuten das mit Wasserstoffperoxid versetzte Chromogen DAB (3,3-Diaminobenzidin, DakoCytomation S3000) aufgetragen. Nun wurden die Objektträger, nachdem sie erneut mit PBS gespült worden waren, in Färbeschiffchen verbracht und kurz in Leitungswasser gespült. Daran schloss sich eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin (Thermo Harris, Thermo Shandon, Pittsburgh, USA) an. Ein detailliertes Fäbeprotokoll befindet sich im Anhang.