Die Embryobank des DKFZ verfügt heute über mehr als 95000 kryokonservierte Embryonen von 180 Linien, deren Kryokonservierung abgeschlossen ist, und von 50 weiteren Linien, die in Bearbeitung sind. In dieser Arbeit verwendete Liniendaten wurden über einen Zeitraum von Mai 1996 bis März 2006 Jahren erhoben. Es handelt sich um 169 Linien: 136 transgene Überexprimierer, 29 homologe Rekombinanten, 2 spontane Mutanten und 2 nicht transgene Hintergrundlinien.
Davon sind 28 Linien homozygot und 141 Linien heterozygot bzw. hemizygot transgen. Homozygot transgen sind diejenigen Linien, deren Tiere die Mutation auf beiden Chromosomen tragen. Heterozygot transgene Linien tragen die Mutation auf nur einem der beiden Allele. Hemizygot transgene Linien haben die Mutation auf einem Allel, während das entsprechende Gen auf dem zweiten Allel nicht vorhanden ist.
Da viele dieser transgenen Tiere bisher nicht publiziert wurden, sind in der Regel Liniennamen durch anonyme Nummern ersetzt. Der genetische Hintergrund der transgenen Tiere ließ sich wie folgt aufteilen: C57BL/6 37 %, B6D2Fn 15 %, FVB/N, CBA, C3H und NMRI jeweils circa 5 %. Die restlichen Prozente verteilten sich auf Tiere, deren genetischer Hintergrund nicht genau bekannt oder gemischt war. Die Embryobank musste sich bei den Angaben zum genetischen Hintergrund auf die Experimentatoren verlassen, deren Aussagen nicht überprüft werden konnten.
Zur Beantwortung der in der Einleitung beschriebenen Fragestellungen wurden jeweils unterschiedliche Linien herangezogen. Angaben über die verwendete Zahl der Linien, Vaginalpfropf positive Spendertiere (VP+-Spendertiere) und Embryonen sind im Ergebnisteil den jeweiligen Themen zugeordnet.
Die im DKFZ gezüchteten Tiere wurden im Alter von etwa vier Wochen vom Muttertier getrennt, mit Ohrenmarken oder Ohrlochungen gekennzeichnet, sowie genotypisiert (siehe unten). Weibliche Tiere wurden auch von der Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld, zugekauft. Bei Lieferung waren sie fünf bis sechs Wochen alt und frei von bestimmten nagerpathogenen Mikroorganismen, auf die sie nach den Empfehlungen der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) untersucht wurden (NICKLAS et al. 2002). Nach einer Eingewöhnungsphase von einer Woche im jeweiligen Haltungsbereich wurden die Tiere im Alter von circa 6 Wochen superovuliert.
Transgene männliche Tiere wurden mit weiblichen Tieren der gleichen transgenen Linie oder eines gleichen oder zumindest ähnlichen Wildtyps verpaart. Die männlichen Tiere wurden bis zu zehn Mal verpaart, in der Regel in einem Alter von drei bis sechs Monaten. Hier musste die Verfügbarkeit der männlichen Tiere der jeweiligen transgenen Linien berücksichtigt werden.
3.1.1 Nachweis der Transgenität
Die Tiere wurden in der Regel beim Absetzten vom Muttertier mit der aus einer Schwanzbiopsie extrahierten DNA genotypisiert. Der Nachweis erfolgte in den meisten Fällen mittels PCR oder Southern Blot Analyse, alternativ durch eine Reaktion von markierten Antikörpern mit peripheren Blutlymphozyten (PBL), die dann im Zytometer untersucht wurden. Die Genotypisierungen wurde von den Arbeitsgruppen durchgeführt, welche für die Tiere verantwortlich waren. Nicht transgene weibliche Geschwistertiere konnten in bestimmten Fällen zur Verpaarung mit Transgen positiven männlichen Tieren für die Kryokonservierung genutzt werden. Es wurden nur Tiere der gleichen Linie verpaart, um durch falsch negativ genotypisierte weibliche Tiere eine genetische Kontamination zu vermeiden. Auch blieb im Hinblick auf einen eventuell gestörten Rückkreuzungsverlauf im Einzelfall zu entscheiden, ob eine Verpaarung mit diesen weiblichen Tieren sinnvoll war.
3.1.2 Tierhaltung
Die zur Kryokonservierung bestimmten Tiere stammten aus sechs spezifiziert pathogenfreien (SPF) Haltungen (Barrieren), mehreren Isolatoren und zwei konventionellen Haltungen des DKFZ, sowie einer konventionellen Haltung des Tierlabors im Theoretikum der Universität Heidelberg. Die einzelnen Daten der Umweltbedingungen in den Haltungsbereichen, wie zum Beispiel Temperatur und relative Luftfeuchte, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Der überwiegende Teil an transgenen Versuchstieren wird im DKFZ in Barrieren gehalten, welche gasdicht von einander und von der Umwelt abgeschlossen sind.
Benötigtes Material gelangt über einen Autoklaven oder durch eine desinfizierende Materialschleuse in den Haltungsbereich. Es sind mehrere Tierlabore vorhanden, welche wiederum über jeweils ein eigenes Hochleistungsschwebstofffilter belüftet werden und eine eigene Klimaanlage besitzen. Die Barrieren bilden geschlossene Systeme mit eigenem Personal und einer Zutrittsbefugnis für einen eingeschränkten Personenkreis. Es werden spezifiziert pathogenfreie Tiere gehalten, die ebenfalls nach den oben bereits erwähnten FELASA–Richtlinien regelmäßig untersucht werden. Sie unterscheiden sich in der für ihre Haltung spezifischen mikrobiellen Flora, im DKFZ handelt es sich dabei überwiegend um unterschiedliche Pasteurellenstämme. Mitte 2004 wurde in einem SPF-Haltungsbereich eine murine Parvovirusinfektion festgestellt, worauf in einer Fragestellung in dieser Arbeit gesondert Bezug genommen wird (Kapitel 4.7).
Isolatoren sind Zelte, die nur über spezielle sterile Werkbänke zugängig sind und entweder mit Überdruck arbeiten, um ein Eindringen von Krankheitserregern in das Zelt zu verhindern oder bei kontaminierten Tieren mit Unterdruck belüftet sind, um ein Austreten der Erreger zu vermeiden. Sie bieten die Möglichkeit einer Quarantänehaltung zum Beispiel nach Embryotransfer vor dem Einschleusen in die Zielhaltung. Zum Zwecke der Kryokonservierung findet die Isolatorhaltung trotz der aufwändigen Technik bei sehr empfindlichen, keimfreien oder kontaminierten Tieren Verwendung. Im DKFZ werden Isolatoren der Firma Metall + Plastic, Radolfzell verwendet.
Tabelle 1: Umweltbedingungen der Haltungsbereiche im DKFZ (Angaben der Abteilung Technik)
Temperatur (C°) 22 ± 2
relative Luftfeuchte (%) 55 ± 5
Luftwechsel/h 15
Tag / Nacht (h) 12 / 12 (6-18Uhr / 18-6Uhr) Lichtintensität Tag (Lux) 1-9
Lichtintensität Nacht (Lux) 0
In den Tierhaltungsbereichen der konventionellen Haltung bestehen keine besonderen technischen und hygienischen Sicherheitsvorkehrungen gegen das Einschleppen von Infektionen von außen. Die Räumlichkeiten sind den Experimentatoren frei zugänglich. Um eine Standardisierung der Tierzucht dennoch zu gewährleisten, sind die Räume mit einer Beleuchtungsanlage, einer Klimaanlage sowie einer Luftbe- und -Entfeuchtung ausgestattet.
3.1.3 Käfige
Zur Haltung der weiblichen Tiere fanden Makrolonkäfige der Typen II (Fläche: 360 cm²) mit maximal 3 Tieren und Typ III (Fläche: 810 cm²) mit maximal 10 Tieren Verwendung. Die Käfige (siehe Abbildung 1) verfügen über einen Drahtdeckel mit Futterraufe und einer Tränkeflasche. Die männlichen Tiere wurden in der Regel allein in Typ II Käfigen gehalten.
Abb. 1 : Makrolonkäfig (Typ III) mit Futterraufe. Tränkeflaschen und Futter wurden der Übersichtlichkeit wegen vor dem Fotografieren entnommen.
Als Einstreu diente steriles Weichholzgranulat (Firma Altromin GmbH, Lage), welches ein- bis zweimal wöchentlich gewechselt wurde.
Zur Untersuchung Pheromon bedingter Effekte wurde ein Makrolonkäfig des Typs III verwendet. Der Drahtdeckel verfügt über zwei Futterraufen, Einsatzmöglichkeiten für zwei Tränkeflaschen und über ein angeschweißtes Gitter, welches den Käfig in geschlossenem Zustand in zwei gleich große Kompartimente aufteilt (Abbildung 2).
Abb. 2 : Trenngitterkäfig mit zwei Futterraufen. Tränkeflaschen und Futter wurden der Übersichtlichkeit wegen vor dem Fotografieren entnommen.
3.1.4 Futter und Tränke
Die Tiere erhielten eine pelletierte Standarddiät (Altromin 1324 N Forti, Firma Altromin GmbH, Lage) und Wasser ad libitum.
3.1.5 Definition der Spendertiere
Als Spendertiere sind diejenigen weiblichen Tiere zu verstehen, welche am Tag 0,5 p.c. einen Vaginalpfropf trugen und damit am Tag 2,5 p.c. zum Zwecke der Kryokonservierung getötet wurden. Im Folgenden werden Vaginalpfropf positive Spendertiere mit VP+-Spendertiere abgekürzt.