der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Embryobank des
Deutschen Krebsforschungszentrums Heidelberg
Optimierung der Embryonenzahl für die Kryokonservierung transgener Mäuse
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Anna Schwab aus Heidelberg
Hannover 2006
PD Dr. J. Schenkel
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. H. Hackbarth
2. Gutachter / Gutachterin: Univ. Prof. Dr. S. Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2006
Die Dissertation wurde durch das Bundesinstitut für Risikobewertung (ZEBET)
und meine vier Eltern
1 Einleitung und Problemstellung ... 1
2 Literatur ... 5
2.1 Entwicklung der Kryokonservierung ... 5
2.2 Die Bedeutung von Mausmutanten für das Verständnis genetischer Prinzipien... 6
2.3 Generierung transgener Mäuse... 8
2.3.1 Vorkerninjektion ... 9
2.3.2 Homologe Rekombination, Gene Targeting... 9
2.3.3 Viraler Gentransfer... 10
2.4 Sexualzyklus der Maus ... 11
2.4.1 Zyklusphasen ... 12
2.4.2 Auswirkung von Stress auf die Reproduktion... 14
2.5 Stress und Wohlbefinden ... 15
2.6 Superovulation der Maus ... 15
2.7 Pheromone... 17
2.7.1 Die Bedeutung der pheromonalen Beeinflussung des ovariellen Zyklus bei der Maus ... 18
2.7.2 Pheromon bedingte Effekte... 19
2.7.2.1 Lee-Boot-Effekt (Zyklussuppression) ... 19
2.7.2.2 Whitten-Effekt (Zyklussynchronisation) ... 21
2.7.2.3 Vandenbergh Effekt (Beschleunigung der sexuellen Reife) ... 22
2.7.2.4 Bruce Effekt (Hemmung der Gravidität durch die Anwesenheit eines unbekannten Männchens)... 23
2.8 Die Bedeutung der Sicherung transgener Mauslinien und die Notwendigkeit der Optimierung bestehender Methoden ... 24
3 Tiere, Material und Methoden... 25
3.1 Tiere, transgene Linien... 25
3.1.3 Käfige ... 28
3.1.4 Futter und Tränke... 30
3.1.5 Definition der Spendertiere... 30
3.2 Material ... 31
3.2.1 Medien ... 31
3.2.1.1 PBS-Lösung... 31
3.2.1.2 M2-Medium ... 31
3.2.1.3 Einfriermedium ... 31
3.2.1.4 Verdünnungsmedium ... 32
3.3 Methoden ... 34
3.3.1 Präparation von Mausembryonen ... 34
3.3.1.1 Superovulation weiblicher Tiere ... 34
3.3.1.2 Präparation der VP+-Spendertiere ... 36
3.3.1.3 Gewinnen und Waschen der Embryonen... 37
3.3.1.4 Selektion intakter Embryonen ... 38
3.3.2 Kryokonservierung ... 38
3.3.2.1 Beladen einer Paillette ... 39
3.3.2.2 „two step freezing“... 40
3.3.3 Lagerung ... 42
3.3.4 Revitalisierung... 43
3.3.5 Vergleich der Zahl erhaltener Zygoten je VP+-Spendertier zweier Tierhaltungen ... 43
3.3.6 Experimente zur Erhöhung der Embryonenzahl durch die Ausnutzung Pheromon bedingter Effekte ... 44
3.3.6.1 „Lee-Boot-Effekt“ ... 44
3.3.6.2 „Whitten-Effekt“... 45
4.1 Embryonen je Spendertier... 49
4.1.1 Erhaltene kryokonservierbare Embryonen je VP+-Spendertier aller Linien ... 50
4.1.2 Erhaltene kryokonservierbare Embryonen je VP+-Spendertier homozygoter Linien ... 52
4.2 Einfluss des genetischen Hintergrundes ... 53
4.3 Vergleich von Zucht und Embryonengewinnung zur Kryokonservierung . 55 4.4 Einfluss der Haltungssysteme auf die Embryonenspender ... 56
4.5 Einfluss des Haltungsbereiches auf Embryonenspender ... 58
4.6 Jahreszeitlicher Verlauf ... 61
4.6.1 Zur Kryokonservierung erhaltene Embryonen im Jahr 2003 ... 63
4.6.2 Vergleich des jahreszeitlichen Verlaufs erhaltener Zygoten zur Mikroinjektion in zwei getrennten Tierhaltungen... 64
4.7 Embryonenspender aus virusinfizierten Tierhaltungen... 67
4.8 Verpaarungsfrequenz der männlichen Tiere ... 70
4.9 Einfluss Pheromon bedingter Effekte ... 72
4.9.1 Der „Lee-Boot-Effekt“ ... 72
4.9.1.1 Kryokonservierbare achtzellige Embryonen je Spendertier... 74
4.9.1.2 Erhaltene Vaginalpfropf-positive Tiere im Lee-Boot-Experiment 75 4.9.1.3 Vergleich erhaltener achtzelliger Embryonen zu übrigen Eileiterstadien... 76
4.9.1.4 Anteil der einzelnen Entwicklungsstadien am Tag 2,5 p.c... 76
4.9.1.5 Embryonen, die das Achtzellstadium erreichen ... 80
4.9.2 Der „Whitten-Effekt“ ... 82
4.9.2.1 Trenngitterkäfig-Experiment... 82
4.9.2.2 Einstreu-Experiment... 83
4.9.2.3 Erhaltene Vaginalpfropf-positive Tiere im Whitten-Experiment .. 85 4.9.2.4 Vergleich erhaltener achtzelliger Embryonen zu
4.9.3 Vergleich der untersuchten Pheromon bedingten Effekte ... 92
4.9.3.1 Vergleich der erhaltenen Zahl an achtzelligen Embryonen in verschiedenen Pheromonexperimenten... 92
4.9.3.2 Vergleich der erhaltenen VP+-Tiere in verschiedenen Pheromonexperimenten... 94
4.10 Revitalisierung achtzelliger kryokonservierter Embryonen ... 94
5 Diskussion ... 95
5.1 Erhaltene Zahl achtzelliger Embryonen je Spendertier... 95
5.2 Genetischer Hintergrund ... 95
5.3 Vergleich von Zucht und Embryonengewinnung zur Kryokonservierung . 96 5.4 Einfluss der Haltungssysteme und Haltungsbereiche ... 96
5.5 Jahreszeitlicher Verlauf ... 99
5.6 Einfluss einer MPV-Infektion auf die Embryonenspender ... 101
5.7 Verpaarungsfrequenz männlicher Tiere ... 103
5.8 Pheromoneffekte ... 104
5.8.1 Der „Lee-Boot-Effekt“ ... 104
5.8.2 Der „Whitten-Effekt“ ... 107
6 Zusammenfassung ... 111
7 Summary ... 113
8 Literaturverzeichnis ... 115
Danksagung ... 129
Erklärung ... 131
°C Grad Celsius
C.l. Corpus luteum, Gelbkörper
cm Zentimeter
DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg
DMSO Dimethylsulfoxid
eCG equines Choriongonadotropin
EMMA European Mouse Mutant Archive
ES embryonale Stammzellen
et al. et alii, et alteri, und andere
FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations FSH Follikel stimulierendes Hormon
FZK Forschungszentrum Karlsruhe
GnRH Gonadoliberin
hCG humanes Choriongonadotropin
ICSI intracytoplasmatische Spermieninjektion
i.p. intraperitoneal
IVF in vitro Fertilisation
LH Lutropin
M molar
M2 Medium zur in vitro-Kultivierung embryonaler Präimplantationsstadien
min Minute
ml Milliliter
MPV Murines Parvo Virus
µl Mikroliter
SD Standardabweichung
shRNA kleine, haarnadelförmige RNA siRNA kleine interferierende RNA SPF spezifiziert pathogenfrei
tg transgen
VP+ Vaginalpfropf positiv
1 Einleitung und Problemstellung
Transgene Tiere sind einmalige Mutanten von großem wissenschaftlichem Wert, die man nur mit erheblichem Aufwand generieren und charakterisieren kann. Diese wertvollen Tiere mittels Erhaltungszucht vor dem Aussterben zu schützen, ist jedoch nur in Ausnahmefällen sinnvoll. Die Zucht transgener Tiere ist oftmals schwierig, da eine Linie nur von einem einzigen Tier abstammt. Bei homozygoten Linien sind Bruder-Schwester Verpaarungen notwendig, welche nicht selten zu Inzuchteffekten oder Infertilität führen können. Weiterhin kann sich das Transgen negativ auf das Wohlbefinden des Tieres auswirken. Eine Zucht birgt zusätzlich stets die Gefahr eines Hygieneeinbruchs oder anderer Unfälle. Gerade in den letzten Jahren findet ein reger Austausch transgener Mäuse zwischen verschiedenen, mit transgenen Tieren arbeitenden Laboren statt, der die Gefahr einer Infektion der Zielinstitution mit bisher dort nicht vorhandenen Erregern mit sich bringt.
Die Kryokonservierung bietet die Möglichkeit der Sicherung von Linien, die sich in keinem Experiment befinden. Weiter können zur Bearbeitung einer neuen Fragestellung Linien problemlos in ein anderes Labor verbracht werden und Sanierungen nach Infektionseinbrüchen vorgenommen werden. Es ist möglich Eizellen, Embryonen und Spermien von Mäusen in flüssigem Stickstoff über einen nahezu unbegrenzten Zeitraum aufzubewahren, ohne die Risiken einer Zuchthaltung, einer Gendrift oder die Gefahr von Verlusten eingehen zu müssen.
Zudem erlaubt die Technik der Kryokonservierung eine Einsparung von Versuchstieren in erheblichem Maße gegenüber einer Erhaltungszucht, zu deren Sicherung ca. 200 Tiere pro Jahr und Linie nötig wären.
Von der Embryobank des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ) in Heidelberg wurden in den letzten Jahren mit über 95000 Embryonen die Kryokonservierung von 180 transgenen Linien im Achtzellstadium abgeschlossen, weitere 50 transgene Linien werden derzeit eingefroren. Dafür werden aus superovulierten, Vaginalpfropf-positiven Spendertieren am Tag 2,5 p.c. achtzellige
Embryonen gewonnen und nach einer modifizierten Version der „Slow-Procedure“
nach WHITTINGHAM et al. (1972) und LEIBO et al. (1986) eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert.
WAYSS et al. (2005) publizierten anhand von Daten der Embryobank des DKFZ im Mittel 7,26 achtzellige Embryonen, die je trächtiges Spendertier zur Kryokonservierung gewonnen wurden. Die Studie zeigt die Problematik einer erheblichen Schwankungsbreite um den Faktor zehn auf. In dieser Dissertation sollen die möglichen Ursachen der multifaktoriell bedingten Schwankungsbreite erörtert werden, mit dem Ziel, Möglichkeiten zur Erhöhung der Zahl gewonnener achtzelligen Embryonen je Spendertier für die Kryokonservierung von Mausmutanten zu finden.
Es werden folgende Faktoren erfasst, bearbeitet und diskutiert:
• Übersicht aller an der Embryobank des DKFZ im Achtzellstadium kryokonservierter Embryonen
• Einfluss des genetischen Hintergrundes
• Vergleich von Zucht- und Kryokonservierungsdaten
• Einfluss der Haltungssysteme auf Embryonenspender
• Einfluss des Haltungsbereiches auf Embryonenspender
• Jahreszeitlicher Verlauf der Ausbeuten an Embryonen je Spendertier
• Embryonenspender aus virusinfizierten Tierhaltungen
• Verpaarungsfrequenz der männlichen Tiere
• Einfluss Pheromon abhängiger Effekte
• Revitalisierung als Kontrolle
der Versuchstiere zu reduzieren. Der Forderung „reduction“ nach Russell und Burch`s bekannter „3-R“-Systematik (1959) kann hiermit nachgekommen werden.
2 Literatur
2.1 Entwicklung der Kryokonservierung
Von jeher bestand der Wunsch Erbgut sichern und transportieren zu können. Nicht wissenschaftlich dokumentierte Erzählungen über die erste künstliche Besamung gehen auf Araber zurück, die mit Hilfe eines Schwammes Sperma aus einer gerade gepaarten fremden Stute stahlen, um ihre eigenen Stuten zu besamen (CRABO 2001). IWANOFF (1907) arbeitete in Russland auf weit wissenschaftlichere Weise an Möglichkeiten der künstlichen Insemination. Weiter studierten er sowie andere Wissenschaftler die Reaktion von Zellen auf Temperaturen unterhalb des Gefrierpunktes (SHERMAN 1969). Es standen zu Beginn der Arbeiten (zum Verständnis von Tiefkühlprozessen und deren Auswirkung auf Zellen) vor allem Pflanzen, Bakterien und Protozoen im Mittelpunkt (SMITH 1961). Dabei wurde klar, dass es bei Vorgängen des Einfrierens und Auftauens zu zellulären Veränderungen kommt und Eiskristallen eine zentrale Rolle der Zellschädigung zuzuschreiben ist.
POLGE et al. (1949) entdeckten die protektive Wirkung von Glycerin bei der Kryokonservierung von Geflügelsperma. Bald fand man heraus, dass der Zusatz von Glycerin zum Gefriermedium von Bullensperma sich bei dessen Kryokonservierung positiv auf die Qualität der revitalisierten Spermien auswirkt (O’DELL und ALMQUIST 1957). In der heutigen Tierzucht sind die daraufhin entstandenen Samenbanken weithin zu finden und sind von großem wirtschaftlichem Nutzen. Sie ermöglichen die Aufbewahrung von Sperma wertvoller männlicher Tiere über lange Zeiträume, erlauben den Transport zwischen Tierhaltungen, eine künstliche Insemination zum optimalen Zeitpunkt und senken das Infektionsrisiko der Muttertiere mit unerwünschten Erregern.
Erst 1972 gelang es, Eizellen und Embryonen von Mäusen erfolgreich zu kryokonservieren und über einen längeren Zeitraum in flüssigem Stickstoff zu lagern. Nach erfolgter Revitalisierung und nach einem Embryotransfer wurden lebende Junge geboren (WHITTINGHAM et al. 1972). Diese Technik, das so genannte „langsame Einfrieren“, wurde in der folgenden Zeit modifiziert und auf
andere Spezies übertragen. Dies war der Beginn der Kryokonservierung von Eizellen sowie verschiedener früher Embryonalstadien (WILLADSEN 1977).
Neueste Daten der European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) zeigen im Jahr 2002 in Europa 57162 registrierte Fälle, bei denen kryokonservierte Embryonen (Präimplantationsstadien) transferiert wurden sowie 171789 intrauterine Inseminationen. Im Vergleich zum Vorjahr 2001 wurde ein leichter Rückgang der Eingriffe verzeichnet, jedoch sind die Schwankungen zwischen den einzelnen Ländern in Europa sehr hoch (ANDERSEN et al. 2006).
2.2 Die Bedeutung von Mausmutanten für das Verständnis genetischer Prinzipien
Mitte des 16. Jahrhunderts durchging die Biologie einen Wandel von der bisher rein beschreibenden Wissenschaft zur Versuchskunde. William Harvey nutzte vermutlich als erster 1623 die Maus als Versuchstier zur Erforschung der Reproduktion und Kreislaufbiologie (RITTER VON TÖPLY 1910).
Erst um 1900 begann man genau definierte Mäuse zu versuchstierkundlichen Zwecken zu nutzen. Die „DBA/2“- Maus ist die älteste Inzuchtlinie, welche von C.C.
Little 1909 etabliert wurde. Er züchtete auf Homozygotie der Fellfarbe und kreuzte die Genloci non-agouti, brown und dilute. Zehn Jahre später folgte eine weitere Inzuchtlinie von Abbie E. C. Lathrop, die durch Kreuzen der schwarzen Nachkommen ihrer Maus „57“ die Linie C57BL/6 etablierte. Ihre Mäuse verkaufte sie schon damals unter anderem an wissenschaftlich arbeitende Labore. Weiter etablierte der in der Krebsforschung tätige Genetiker L.C. Strong die Stämme C3H und CBA (STRONG 1978).
Zum Verständnis der grundlegenden Mechanismen der molekularen Genetik begann man Mitte des letzten Jahrhunderts mit prokaryontischen Mutanten zu arbeiten (STREHLER 1950). Diese wurden unter anderem durch die Infektion von Bakterien mit Bakteriophagen gewonnen, die das gewünschte Gen in die Zelle
ursprüngliche Bakterienkultur zurückzuerhalten. Schon damals suchte man nach Möglichkeiten die erarbeiteten Mutanten zu sichern, ohne sie weiter kultivieren zu müssen. Brauchte man diese gerade nicht für ein Experiment, so bedeutete die weitere Kultivierung stets das Risiko einer unerwünschten Infektion, zusätzliche Arbeit sowie einen unnötigen (finanziellen) Aufwand. Es gelang die Tiefgefrierung der Mutanten in flüssigem Stickstoff sowie in flüssigem Helium, als Kryoprotektivum dienten Dimethylsulfoxid (DMSO) und Glycerin. So ließen sich einmalige Mutanten sichern. Den prokaryontischen Mutanten folgte bald die eukaryontische Genetik in Form der Zellkulturtechnik an Hefen (MARQUARDT und BAUTZ 1955), eukaryontischen Zellkulturen (zum Beispiel HeLa-Zellen) oder niedrigen eukaryontischen Organismen, z.B. der Fruchtfliege Drosophila melanogaster (SCHERER et al. 1953).
1980 gelang es erstmals mittels Mikroinjektion klonierte DNA in den Vorkern von Mauszygoten einzubringen und daraus ein transgenes Säugetier zu erhalten (PALMITER et al. 1982). In der modernen biomedizinischen Forschung ist die Maus das meist genutzte Modell. Aufgrund ihres kurzen Sexualzyklus von vier bis fünf Tagen und der kurzen Tragezeit von 19-21 Tagen, sowie der einfachen Haltung und wenig aufwändigen Fütterung, ist die Zucht der Maus weit einfacher zu handhaben als die der meisten anderen Säugetiere. Auch ist es bisher nur bei der Maus (als Labortier) zuverlässig gelungen, embryonale Stammzellen (ES-Zellen) in vitro zu kultivieren und erfolgreich in eine sich entwickelnde Blastocyste zu injizieren. Die DNA-Sequenz der 30000 Mausgene ist inzwischen bekannt (WATERSTON et al.
2002) und steht der Forschung zum Vergleich mit anderen Säugetieren, dem Verständnis ihrer Funktion, aber auch für Krankheitsmodelle zur Verfügung. In naher Zukunft dürfte es für jedes Mausgen eine Ausfallsmutante geben, hinzukommen Doppelmutanten, überexprimierende und andere transgene Linien, so dass man davon ausgeht, dass in wenigen Jahren weltweit ca. 100000 mutante Mauslinien beschrieben sein werden (WIESTLER persönliche Mitteilung 2005). Auf Grund der genannten Vorteile wie dem kurzen Sexualzyklus, der Vielzahl vorhandener Mutanten und des allgemein großen Wissens wird die Maus mehr und mehr zum generellen Modellorganismus, was aus genetischer Sicht sicherlich sehr
vernünftig, aus versuchstierkundlicher Betrachtung aber nicht immer sinnvoll ist, da die Maus nicht für alle Fragestellungen das optimale Versuchstier ist, zum Beispiel für humane Autoimmunkrankheiten (TAUROG et al. 1988).
Aufgrund ihres unschätzbaren Wertes für die biomedizinische Forschung bedürfen diese einmaligen Mutanten einer Sicherung gegen Verlust. Eine reine Erhaltungszucht ist aus vielerlei Gründen nicht sinnvoll, sei es die Gefahr eines Hygieneeinbruches, die Gefahr der genetischen Drift oder auch aus Tierschutzaspekten, wie der sich hieraus ergebende hohe, unnötige Tierverbrauch, Platzbedarf und die eventuell negative Auswirkung des Transgens auf das Wohlbefinden der Maus. Die Kryokonservierung bietet die Möglichkeit wertvolle Linien ohne Erhaltungszucht zu sichern. Darüber hinaus weist sie eine Menge anderer Vorteile auf, wie die Sanierung von Tierbeständen nach einer Infektion und das relativ einfach zu handhabende Versenden von Embryonen oder Sperma zu einem anderen Forschungslabor. Die mikrobielle Flora der Tiere ist von enormer Wichtigkeit für die Standardisierung von Tierversuchen. Es ist daher unabdingbar, die Gefahr einer Kontamination so minimal wie möglich zu halten und bei Kenntnis einer Infektion eine Sanierung des Tierhaltungsbereiches vorzunehmen (NICKLAS et al. 2002).
2.3 Generierung transgener Mäuse
Transgene Tiere sind Tiere, deren Genom gezielt mutiert wurde und die diese Mutation stabil an ihre Nachkommen weitervererben (SCHENKEL 2006). Hierzu wird entweder ein zusätzliches, fremdes Gen in das Genom eingefügt und oftmals (über-) exprimiert, oder ein Gen wird in seiner Funktion inaktiviert. Hierzu werden drei verschiedene Techniken angewandt, denen eine Superovulation der Spendertiere und eine Entnahme der Zygoten bzw. Embryonen vorausgeht (NAGY et al. 2003).
2.3.1 Vorkerninjektion
Hierbei wird ein gelöstes DNA-Konstrukt in den männlichen Vorkern von Zygoten, die am Tag 0,5 p.c. aus Spendertieren präpariert werden, mikroinjiziert (BRINSTER et al. 1985, JAENISCH 1988). Das Konstrukt besteht aus Protein-kodierenden und regulativen DNA-Sequenzen, die sich zufällig in das Zielgenom integrieren und stabil an die nachfolgenden Zellen weitergegeben werden. Nach Transfer der Embryonen in pseudogravide Ammen werden transgene („Founder Tiere“) sowie nicht transgene Junge („nontransgenic littermates)“ geboren. Aufgrund der nicht vorhersehbaren Insertionsstelle des DNA-Konstrukts erhält man mehrere parallele so genannte „transgenic founder lines“, zu deren weiteren Analyse der Aufbau einer kleinen Zucht erforderlich ist. Das Transgen wird abhängig von den regulativen Sequenzen des Konstruktes sowie von der Insertionsstelle im Genom (über-) exprimiert. Da nicht zwingend alle das Transgen tragende Tiere auch das kodierte Protein exprimieren und das Expressionsmuster von Linie zu Linie schwanken kann, ist eine sorgfältige Charakterisierung mutanter Linien sehr wichtig (NAGY et al. 2003).
Auf diese Weise ist es ebenfalls möglich, transgene siRNA oder shRNA exprimierende Tiere zu generieren, bei denen aufgrund der entstehenden RNA- Interferenz bereits transkribierte mRNA spezifisch inaktiviert wird. Dies wird als
„knock-down“ bezeichnet (HASUWA et al. 2002, HOUDEBINE 2002, WADHWA et al. 2004)
2.3.2 Homologe Rekombination, Gene Targeting
Für die Technik der homologen Rekombination werden Blastocysten am Tag 3,5 p.c. aus Spendertieren präpariert. Aus den Blastocysten werden wiederum ES- Zellen gewonnen, welche in vitro permanent als pluripotente Zellinien kultiviert werden können. Mit Hilfe eines Targeting Vektors lassen sich die in vitro kultivierten ES-Zellen mittels Elektroporation transfizieren, es werden entweder Gene inaktiviert, so dass „knock-out-Mutanten“ entstehen oder es werden Gene inseriert,
„Knock-in-Mutanten“. Eine Überexpression durch das Einfügen einer DNA-Sequenz an einer definierten Stelle im Genom ist ebenfalls möglich.
Nach Transfektion der ES-Zellen tritt die gewünschte homologe Rekombination jedoch nur in sehr geringer Frequenz auf (1:106 bis 1:109), so dass mittels positiver und negativer Selektion, Southern Blot und PCR-Verfahren eine Selektion auf die gewünschten Klone durchgeführt werden muss (SCHENKEL 2006). Die erhaltenen rekombinierten ES-Zellen werden expandiert und in Blastocysten einer anderen Linie injiziert. Das Ziel des nun folgenden Embryotransfers ist die Geburt von chimären Tieren, die zum Teil von den homolog rekombinierten ES-Zellen abstammen und zudem die Mutation in der Keimbahn tragen können, so dass eine Weitergabe dieser Mutation an die nächste Generation möglich wird. Eine vollständige Funktion der Mutation erfordert oftmals eine Zucht auf Homozygotie und es ist auch hier darauf zu achten, dass eine sorgfältige Charakterisierung der Linie durch die Analyse der Rolle des Transgens durchgeführt wird.
Die Technik der homologen Rekombination oder „Gene Targeting“ erlaubt eine sehr zielgerichtete Beeinflussung des Genoms (WILLIAMS 1990, ROBERTSON 1991, BABINET et al. 2001).
2.3.3 Viraler Gentransfer
Der Gentransfer durch Retrovirusvektoren hat heute aufgrund der ES-Zelltechnik an Bedeutung verloren. In früheren Arbeiten nutzte man die Möglichkeit der Integration von DNA-Sequenzen des Virus in zwei bis vier Tage alte Embryonen, mit dem Ziel der Zerstörung eines Gens oder der Einfügung eines weiteren Gens, welches zuvor in den viralen Vektor kloniert wurde. Auch bei dieser Technik werden die behandelten Embryonen in pseudogravide Ammen transferiert und von diesen ausgetragen. Die geborenen Jungen tragen die Mutation in Mosaikform. Unter der Bedingung, dass die Mutation ebenfalls in den Keimzellen integriert ist, kann die Zucht der Tiere etabliert werden (SORIANO et al. 1986). Während beim
Proteins als Nachteile angesehen werden, zeigen neuere Arbeiten mit Lentiviren weit bessere Ergebnisse. Lentiviren besitzen gegenüber klassischen Retroviren den Vorteil, auch sich nicht teilende, differenzierende und proliferierende Zellen zu infizieren und werden daher nach Integration in das Wirtsgenom an alle Tochterzellen weitergegeben. Man generiert mit Lentiviren hauptsächlich Überexprimierer, eine Inaktivierung von Genen durch RNA-Interferenz ist ebenfalls möglich. Aufgrund der separaten, das Transgen tragenden Vektorkonstrukte sind die Vektoren nicht in der Lage sich zu replizieren. Sie bieten daher eine große Sicherheit und können nur zur einmaligen Infektion verwendet werden. Diese geschieht durch die Injektion der Viruspartikel in den perivitellinen Raum. PFEIFER (2004) weist auf die hohe Effizienz des lentiviralen Gentransfers im Gegensatz zur DNA-Pronukleusinjektion hin, bei der Maus beträgt sie ungefähr das Vierfache, bei landwirtschaftlichen Nutztieren ist eine noch deutlichere Effizienz gegenüber der Pronukleusinjektion zu verzeichnen (HOFMANN et al. 2003).
2.4 Sexualzyklus der Maus
Mäuse erreichen die Geschlechtsreife im Alter von sechs bis sieben Wochen. Sie sind polyöstrisch und zeigen unter den Bedingungen einer Labortierhaltung keine jahreszeitliche Abhängigkeit auf (PARKES und BRAMBELL 1928). Ein Brunstzyklus dauert etwa vier bis fünf Tage und stellt eine spontane Abfolge immer wiederkehrender Ereignisse dar (ALLEN 1922).
Die Ovulation bei der Maus erfolgt spontan. Es wird ein neuroendokriner Stimulus (Stimulation der Cervix) benötigt (KENNEY et al. 1977), um eine vollständige Funktionsfähigkeit des C.l. zu erreichen, welche eine Implantation der Embryonen gewährleisten kann. Kommt es zu keiner Paarung, so folgt der Ovulation ein C.l. mit eingeschränkter Funktion und verkürzter Lebensdauer (DONNELLEY und HAU 1994). Somit ist der Zyklus der Maus relativ kurz und erlaubt einem einzelnen, nicht verpaartem Weibchen rasch den Östrus des Zyklus wiederzuerreichen. Nach erfolgter Kopulation bildet sich in der Vagina ein Pfropf aus koagulierten Proteinen der männlichen Samenflüssigkeit (Vaginalpfropf), welcher bis zu 24 Stunden sichtbar bleiben kann. Nach einer Tragezeit von 19-21 Tagen werden
durchschnittlich acht bis zehn Junge geboren. Die Anzahl der Nachkommen schwankt jedoch bei transgenen Labormäusen linienabhängig stark. Einige Tage vor der Geburt nimmt die Nestbauaktivität zu, und es werden große Nester aus Einstreumaterial vorbereitet. Nach der Geburt sollte das Muttertier für zwei bis drei Tage nicht gestört werden, da sonst die Gefahr besteht, dass es die Jungen frisst (FLECKNELL 1997). Mäusejunge sind bei der Geburt blind und unbehaart, wachsen jedoch sehr schnell heran und können frühestens im Alter von drei Wochen abgesetzt werden (NAGY et al. 2003).
2.4.1 Zyklusphasen
Die einzelnen Zyklusphasen des ovariellen Zyklus lassen sich durch mikroskopische Untersuchungen von Vaginalabstrichen untersuchen (INGLIS 1980):
• Proöstrus (18 h): Es sind Parabasalzellen und Intermediärzellen vorhanden, die sich teilweise in der Mitose befinden. Gegen Ende des Proöstrus sind vereinzelt Superfizialzellen erkennbar. Leukocyten und Schleim sind in dieser Zyklusphase nicht zu erwarten.
• Östrus (14 h): Der Vaginalabstrich zeigt in dieser Zyklusphase große, kernlose und keratinisierte Schollen. Selten sind einzelne kernhaltige Superfizialzellen erkennbar, andere Zellen sind nicht vorhanden.
• Metöstrus (36 h): Es ist ein gemischtes Zellbild aus einer großen Zahl Leukocyten und vereinzelnd auftretenden Intermediäzellen sowie keratinisierten Schollen zu sehen, die von reichlich Schleim umgeben werden.
• Diöstrus (48 h): Es sind wenige Zellen unterschiedlichen Zelltyps zu sehen, die alle der Degeneration unterliegen und Fragmente sichtbar werden lassen. Es handelt sich überwiegend um Leukocyten aber auch um
Weiter ist eine adspektorische Untersuchung der Vulva und Vagina möglich, um das Zyklusstadium zu beurteilen. Für die Tiere bedeutet diese Methode weniger Stress als bei die Entnahme eines Vaginalabstriches. Zudem führen wiederholte Abstriche in der Vagina zu einer vermehrten Verhornung des vaginalen Epithels (EMERY und SCHWABE 1936). Die mögliche Auslösung einer Pseudogravidität der Tiere, aufgrund der durch die Untersuchung hervorgerufenen Stimulation von Vagina und Cervix, muss ebenfalls bedacht werden (CASTRO-VASQUEZ und CARRENO 1981).
Beurteilung der Vulva und Vagina in den Phasen des Sexualzyklus (CHAMPLIN et al. 1972):
• Proöstrus(14 h): Ödematisierung der Vulva, die bis zum Ende des Proöstrus zunimmt. Die Schleimhäute der Vagina sind rötlich bis pink und feucht.
Mehrere longitudinale Falten sind am dorsalen und ventralen Schamwinkel (Commissura labiorum dorsalis beziehungweise ventralis) zu erkennen.
• Östrus (14 h): Die Vulva ist ödematisiert, die Schleimhäute zeigen sich jedoch in einem helleren rosa-pink und weniger feucht. Die Falten der Schamwinkel sind deutlich ausgeprägt.
• Metöstrus (36 h): Die Schleimhäute der Vagina sind blass und trocken, die Ödematisierung der Vulva nimmt deutlich ab. In der ersten Hälfte des Metöstrus ist der dorsale Schamwinkel im Vergleich zum ventralen Schamwinkel weniger ödematisiert. In der zweiten Hälfte des Metöstrus können weißliche Zellablagerungen in der Vagina gesehen werden. Eine Ödematisierung der Schamwinkel kann nicht mehr beobachtet werden.
• Diöstrus (48 h): Die Vulva zeigt eine sehr kleine Öffnung. Die Schleimhäute sind bläulich-rötlich und sehr feucht.
2.4.2 Auswirkung von Stress auf die Reproduktion
Eine Konsequenz von Stress ist das Risiko einer reduzierten Reproduktionsfähigkeit. Hierfür können eine Reihe verschiedener Stressoren verantwortlich gemacht werden, die das Wohlbefinden der Tiere beeinflussen (MOBERG 1985, BREAZILE 1987). Ein nicht zu unterschätzender Stressor ist die Handhabung und das Management der Tiere (MATTERI und MOBERG 1986). Da der Erfolg der Reproduktion von einer strikten Abfolge neuroendokriner Geschehnisse abhängig ist, kommt es bei einer Unterbrechung dieser direkt zu einem Verlust der Funktion. Die Follikelreifung sowie die folgende Ovulation sind hierbei besonders Stress-sensitive Phasen des ovariellen Zyklus (MOBERG 1991).
WIEBOLD et al. (1986) zeigten, dass wiederholter Stress zu einer geringeren Trächtigkeitsrate sowie zu kleinen Würfen führt. Zudem fanden sie bei einer Untersuchung der gestressten Tiere eine Abnahme der Zahl funktionstüchtiger C.l.
mit einer einhergehenden Abnahme der Serum-Progesteronkonzentration.
Stress verändert neuroendokrine Interaktionen der Hypothalamus–Hypophysen–
Achse auf verschiedenen Ebenen: Eine verminderte Sekretion von Gonadoliberin (GnRH) ist durch die Aktivität des Corticoliberin (CRH) auf der Ebene des Hypothalamus zu erwarten (RIVIER und VALE 1984, TSIGOS und CHROUSOS 2002). Darüber hinaus führt Stress in der Phase des Proöstrus auf Ebene der Hypophyse zu einer Unterdrückung der Ausschüttung der Gonadotropine Lutropin (LH) und dem Follitropin (FSH) und hemmt damit die Ovulation (ROOZENDAAL et al. 1995). Endogene Opioide werden durch Stress aktiviert und bewirken nach Bindung an Opioidrezeptoren im Hypothalamus letztendlich einen Abfall von LH (PETRAGLIA 1986). Weiter führen die durch Stress erhöhten Glucocorticoide zu einer Hemmung von Wachstum und Reproduktion auf der Ebene des Hypothalamus, der Hypophyse und der peripheren Hormone. Durch Änderung der Rezeptoren in den Zielgeweben der Sexualsteroide werden letztere gehemmt
2.5 Stress und Wohlbefinden
Die Frage nach dem Wohlbefinden und dem Stress eines Versuchstieres ist zum einen aus ethischen Gründen, zum anderen aber auch im Hinblick auf die Qualität der Tierversuchsergebnisse wichtig. Eine allgemein gültige Definition von Stress gibt es nicht. So definierten BROOM und JOHNSON (1993) Stress als Umwelteffekt auf ein Tier, welcher die Kontrollsysteme des Tieres überfordert und seine Fitness reduziert oder dazu tendiert diese zu reduzieren. Weiter definiert BROOM (1996) den Zusammenhang von Wohlbefinden und Stress: „bei jedem Auftreten von Stress ist das Wohlbefinden schlecht“. Er propagiert die Verwendung des Begriffes Stress ausschließlich im Zusammenhang mit einem schlechten Wohlbefinden, bei dem die Fähigkeiten eines Individuums sich einer Situation anzupassen nicht mehr gegeben sind. Dagegen sieht DAWKINS (1980) unter bestimmten Umständen Stress sogar als ein Zeichen von Wohlbefinden an.
Das Wohlbefinden eines Individuums definiert BROOM (1988) als die Fähigkeit sich situationsgemäß anzupassen und die Anforderungen seiner Umwelt zu bewältigen.
Eine Beeinträchtigung des Wohlbefindens entsteht in Folge längerfristig belastender Situationen, die das Anpassungsvermögen übersteigen. Diese kann auch ohne eine Reduktion der körperlichen Fitness des Tieres einhergehen. Das Tier kann immer noch in der Lage sein, Leistungen in Form von Nachwuchs und Wachstum zu erbringen (BROOM 1991, BROOM und JOHNSON 1993).
Der Begriff „Wohlbefinden“ geht im Tierschutzgesetz über das bloße Fehlen von Schmerzen, Leiden und Schäden hinaus. Wohlbefinden ist hier als ein Zustand „frei von negativen Empfindungen“ zu verstehen, welcher gekennzeichnet wird durch Gesundheit, Zufriedenheit, die Erfüllung sozialer und ethologischer Bedürfnisse sowie normales Verhalten (HACKBARTH und LÜCKERT 2002).
2.6 Superovulation der Maus
Um eine Synchronisation des sexuellen Zyklus und eine Erhöhung der Zahl ovulierter Oocyten zu erreichen, werden weibliche Mäuse superovuliert. Die Superovulation ermöglicht eine Verpaarung zu einem festgelegten Zeitpunkt und somit Gewinnung von Embryonen in einem definierten Entwicklungsstadium.
WHITTINGHAM (1971) erstellte das heute traditionell angewandte Schema zur Superovulation weiblicher Mäuse, bei dem die Tiere mit den Gonadotropinen eCG zur Stimulation der Follikelreifung und hCG zur Ovulationsauslösung behandelt werden. Bei einem Tag/Nacht Beleuchtungsrhythmus von jeweils 12 Stunden erfolgt hierbei die erste Injektion (eCG) zwei Stunden vor Beginn der Dunkelphase und wird circa 48 Stunden später von einer zweiten Gonadotropininjektion mit hCG gefolgt. Die Tiere werden nach der zweiten Hormongabe verpaart. Zur Gewinnung von Embryonen in Eileiterstadien ist die Superovulation von drei bis vier Wochen alten weiblichen Tiere, die erstmals verpaart werden, zu bevorzugen da mit einer höheren Zahl ovulierter Oocyten gerechnet werden kann (NAGY et al.). Wird die Superovulation jedoch mit dem Ziel späterer Embryonalstadien oder lebender Nachkommen durchgeführt, so sollte es sich um geschlechtsreife Tiere handeln, da die körperliche Reife wichtig für das Austragen der Feten ist.
Es ist zu beachten, dass Tiere verschiedenen genetischen Hintergrundes auf die Gabe exogene Gonadotropine unterschiedlich reagieren (BYERS et al. 2006).
HEFLER und GREGG (2002) zeigten, dass stammspezifische Gene die Prozesse der Superovulation mit Gonadotropinen mit beeinflussen. Während zum Beispiel bei NMRI Auszuchtmäuse mit einer deutlichen Erhöhung der Zahl gewonnener Embryonen am Tag der Entnahme gerechnet werden kann, zeigen weibliche Tiere des Inzuchtstammes CBA keine Erhöhung der erhaltenen Embryonenzahl (HEDRICH 2004). Insgesamt betrachtet sind Hybrid- und Auszuchttiere die besseren Oocyten beziehungsweise Embryonenspender (AUERBACH et al. 2003) Ein weiterer Einfluss nehmender Faktor ist die Phase des Sexualzyklus in dem sich die weiblichen Tiere zum Zeitpunkt der Injektion des Gonadotropins befinden. Die höchste Zahl ovulierter Oocyten wird erreicht, wenn sich die Tiere zum Zeitpunkt der ersten Gonadotropininjektion (eCG-Injektion) in der Phase des Östrus befinden.
Die niedrigste Zahl Embryonen wird bei einer ersten Gonadotropinbehandlung im Diöstrus der Tiere erhalten (TARIN et al. 2002 a).
Gonadotropinbehandlung in einer anderen Phase des Zyklus führt zu einer erhöhten Zahl nicht intakter ovulierter Oocyten. Die ovulierten Zellen sind beispielsweise zum Teil nicht von Cumuluszellen umgeben, ohne Polkörperchen und zeigen vermehrt intracytoplasmatische mitochondriale Aggregate. Am Deutlichsten ist dieser negative Effekt wiederum bei einer Behandlung der Tiere im Diöstrus zu beobachten (TARIN et al. 2002 b).
Alternativ zum bisher allgemein angewandten Superovulationsschema nach WHITTINGHAM (1971), zeigt WANG (2001), dass eine einmalige Injektion von Inhibin-Antiserum sowohl geschlechtsreifer weiblicher Tiere als auch 26 Tage alter Tiere vor der Geschlechtsreife, zur Superovulation der Tiere und einer normalen Entwicklung der Embryonen führt.
2.7 Pheromone
Das Wort „Pheromon“ wurde von KARLSON und LUSCHER (1959) geschöpft. Sie benutzten dafür die griechischen Worte „phéro“ (ich trage, übertrage) und „Hormon“
(zielgerichteter Reiz). Pheromone sind Stoffe, die von einem Individuum nach außen sezerniert werden, von einem zweiten Individuum der gleichen Art aufgenommen werden und dort eine spezifische Reaktion, z.B. ein bestimmtes Verhalten oder eine entwicklungsphysiologische Determination auslösen. Das Prinzip der Wirkung kleinster Mengen gilt auch hier (DRICKAMER 1984).
Pheromone sind klar abzugrenzen von Allohormonen, welche zwischen verschiedenen Arten wirken und einen Vorteil für den Produzenten bedeuten. Ein Beispiel hierfür sind Blüten, die Duftstoffe absondern, um Insekten zur Bestäubung anzulocken (KOENE und TER MAAT 2001).
WILSON und BOSSERT (1963) führten eine Einteilung der Pheromone in zwei Klassen ein:
• Releaserpheromone lösen eine direkte Verhaltensveränderung, zum Beispiel Kopulationsverhalten aus.
• Primerpheromone führen zu einer physiologischen Veränderung beim Empfänger, zum Beispiel zu hormonellen Veränderungen.
Für einen Pheromoneffekt ist es nicht notwendig, dass ein Individuum den Geruch bewusst wahr nimmt, der Reiz muss nur seine spezifische Reaktion auslösen (SINGER 1991). Die Aufnahme der Pheromone geschieht über den olfaktorischen Weg, das heißt über die Sinneszellen der Lamina cribosa des Os ethmoidale und unter Weiterleitung des Nervus olfactorius in das Rhinencephalon. Des Weiteren wird das Nasenbodenorgan (Organum vomeronasale) zur Aufnahme von Pheromonen genutzt. Es handelt sich hierbei um ein paarig ausgebildetes und mit Sinnesepithel ausgestattetes Schleimhautrohr, welches von dem Nasenbodenknorpel Cartilago vomeronasalis und einer knöchernen Hülle des Vomer gestützt wird. Das Nasenbodenorgan endet caudal blind und mündet rostral in den Ductus incissivus über den eine Verbindung mit der Mund- und Nasenhöhle besteht (NICKEL et al. 1992). Die olfaktorische Aufnahme von Pheromonen wird in der Literatur als klassischer Weg beschrieben, die chemischen Signale sind jedoch auch durch Körperkontakt übertragbar (COHN 1994). Pheromone werden an vielen Stellen des Körpers vermutet, so in der Haut und in einigen ihrer Drüsen, im Speichel, Urin, Vaginalsekret und der Faeces (SINGER 1991).
2.7.1 Die Bedeutung der pheromonalen Beeinflussung des ovariellen Zyklus bei der Maus
Ein in freier Wildbahn lebendes weibliches Tier, welches sich in der fertilen Phase seines Zyklus befindet, jedoch keine Möglichkeit zu einer Paarung hat, ist gezwungen einen weiteren ovariellen Zyklus abzuwarten, um erneut eine Chance zur Fortpflanzung zu erhalten. Der richtige Zeitpunkt der Paarung ist daher von großer Bedeutung, da eine nicht zustande gekommene Trächtigkeit den Verlust von Nachkommen und damit ein Verlust an Zeit und Energie bedeutet.
Über die Wahrnehmung chemischer Signale anderer weiblicher und männlicher Tiere sind weibliche Mäuse in der Lage ihre Reproduktionsfähigkeit den sozialen und physikalischen Gegebenheiten der Umgebung anzupassen, um so den
Zyklus reagieren, bis die äußeren Bedingungen vorhanden sind, um eine Trächtigkeit mit folgender Laktation und Aufzucht der Jungen zu gewährleisten.
Weibliche Tiere können chemische Signale fertiler männlicher Tiere dazu nutzen, ihre eigenen fertilen Phasen so zu steuern, dass sie mit der Anwesenheit eines männlichen Tieres und der Paarung zusammenfallen. Bei Abwesenheit eines fertilen männlichen Tieres und damit fehlender Aussicht auf Konzeption würde das Aufrechterhalten eines fertilen Zustandes das weibliche Tier unnötige Energie kosten (ANDERSON 1969).
2.7.2 Pheromon bedingte Effekte
Ein soziales Signal, das eine der folgenden Veränderungen hervorrufen kann, wird die Dauer des Zyklus und damit den Zeitpunkt der Ovulation verändern. Dieses Signal bietet somit die Möglichkeit den Zyklus zu verkürzen, zu unterdrücken oder zu synchronisieren (McCLINTOCK 1983). Dies bedeutet:
• Die Dauer der Follikelreifung ist verlängert oder verkürzt.
• Nach erfolgter Follikelreifung kann die Ovulation verspätet oder vorgezogen stattfinden.
• Die Lebensdauer des C.l. ist verlängert oder verkürzt.
Im Folgenden werden vier Pheromoneffekte beschrieben, die als
„Primerpheromone“ eine endogene Beeinflussung des ovariellen Zyklus der Maus zur Folge haben.
2.7.2.1 Lee-Boot-Effekt (Zyklussuppression)
Leben adulte weibliche Mäuse in Gruppen ohne männliche Tiere, so verlängert sich die Zeitdauer ihres ovariellen Zyklus (MA et al. 1998). Während die Regelmäßigkeit des Zyklus beibehalten wird, findet die Phase des Östrus mit zeitlicher Verzögerung statt. Man spricht daher von einer Zyklussuppression, welche nach VAN DER LEE und BOOT (1955) benannt wurde, die erstmals dieses Phänomen beschrieben.
Auslöser des Gruppeneffektes sind Pheromone im Urin der weiblichen Tiere.
Studien zeigen, dass ovariohysterektomierte Tiere diese chemischen Signale nicht aussondern und lassen eine Östrogenabhängigkeit der Produktion dieser Pheromone vermuten (PANDEY und PANDEY 1986).
Das Ausmaß der Suppression wird durch die Gruppengröße der gehaltenen Tiere bestimmt. Während sich die Zyklusdauer von zu zweit lebenden weiblichen Tieren nur geringfügig verlängert, kann bei einer Gruppengröße ab vier bis sechs Tieren eine deutliche Zunahme der Zyklusdauer verzeichnet werden (CHAMPLIN 1971). In der Regel beträgt die Zyklusdauer der in Gruppen gehaltenen Mäuse zwischen 11 und 14 Tagen (VAN DER LEE und BOOT 1955). Bei einer Gruppengröße von 30 weiblichen Tieren beschreibt WHITTEN (1959) einen vollständigen Anöstrus, während RYAN und SCHWARTZ (1977) dies nicht bestätigen und vielmehr an einer ausschließlichen Verlängerung des Zyklus festhalten, in der Vermutung WHITTEN habe die cornifizierten Zellen der Vaginalzytologie aufgrund der vermehrten Schleimproduktion und damit das Vorhandensein einer Zyklizität übersehen.
Zwei Effekte können zu einem zeitlich verzögerten Eintreten in die Phase des Östrus des ovariellen Zyklus und damit zu einer insgesamt verlängerten Zyklusdauer führen: Zum einen kann die Phase des Diöstrus, also die Lutealphase des C.l.verlängert sein (CHAMPLIN 1971, CLEE et al. 1975), zum anderen besteht die Möglichkeit einer Pseudogravidität mit einem bestehenden Corpus luteum pseudograviditatis, einhergehend mit einer Gewichtszunahme (DEWAR 1957, DEWAR 1963) und dem Wachstum des Gesäuges (MODY 1962). Beide Effekte resultieren letztendlich in einer verlängerten Aktivität des C.l.
CHOUDERY und GREENWALD (1969) konnten zeigen, dass die Aufrechterhaltung des C.l. in beiden Fällen auf einer Sekretion der Hormone Prolaktin und LH beruht.
Dabei wird jedoch die erhöhte Prolaktinsekretion als die primäre Reaktion auf die erhöhte Anzahl zusammenlebender Tiere angesehen. BRONSON (1976) zeigte mit
Gruppenhaltung der Tiere zu einem Anstieg des Prolaktin-Spiegels im Serum führt, während FSH- und LH-Serumspiegel unbeeinflusst bleiben.
Nach Trennung der Tiere von ihrer Gruppe wird binnen dreier Tage oder innerhalb eines Zyklus der Gruppeneffekt aufgehoben und ein normaler Zyklus begonnen (MARSDEN und BRONSON 1964).
2.7.2.2 Whitten-Effekt (Zyklussynchronisation)
Bei Nagern ist eine durch chemische Signale im Urin eines anwesenden männlichen Tieres ausgelöste Zyklussynchronisation möglich. Bedingung hierfür ist, dass die weiblichen Tiere zuvor einer Gruppenhaltung (DOMINIC und PANDEY 1979, PANDEY und PANDEY 1990) oder dem Urin von in Gruppen lebenden weiblichen Tieren (MARSDEN und BRONSON 1964) ausgesetzt wurden, um einen Östrus verzögerten oder unterdrückten Zyklus zu provozieren. Es muss ausgeschlossen sein, dass die weiblichen Tiere den Geruch männlicher Tiere aufnehmen können (WHITTEN 1959). Bei weiblichen Tieren, die zuvor keiner Zyklussuppression unterlagen, ist der synchronisierende Effekt weit geringer (WHITTEN 1959).
Wird ein männliches Tier in eine Gruppe von weiblichen Mäusen verbracht, so befinden sich die meisten von ihnen nach drei Tagen in der Phase des Östrus (WHITTEN 1958), spätestens jedoch nach sieben Tagen (DOMINIC und PANDEY 1979). Dies liegt daran, dass es bei den in Gruppen gehaltenen weiblichen Tieren in der gleichen Phase ihres Zyklus zu einer Verzögerung kommt und sie beim Auftreten des männlichen Tieres zeitgleich auf dessen Stimulation reagieren. Eine Exposition des weiblichen zum männlichen Tier von mindestens 48 h ist hierfür notwendig (WHITTEN und CHAMPLIN 1973), eine Stimulation des weiblichen Tieres lediglich durch den Urin des männlichen Tieres ist ebenfalls ausreichend (MARSDEN und BRONSON 1964). Innerhalb der ersten 24 h, in denen die weiblichen Tiere dem Geruch eines männlichen Tieres ausgesetzt werden, sinkt der Progesteron-Serumspiegel auf seinen Basalwert ab. Es folgt ein langsamer Anstieg der Östradiolkonzentration im Serum sowie einer Freisetzung von LH aus dem HVL.
Die maximale Serumkonzentration von LH wird 62 h nach dem Kontakt des
weiblichen Tieres mit den Pheromonen des männlichen Tieres erreicht und von der Ovulation gefolgt (RYAN und SCHWARTZ 1980).
In Folge der gesteigerten Synthese und Freisetzung von Östradiol aus dem Ovar, kommt es sekundär zu einer Unterdrückung der FSH- sowie Prolaktin-Freisetzung (BRONSON und MARUNIAK 1976, RYAN und SCHWARTZ 1980).
Die Produktion der Östrus induzierenden Pheromone im Urin männlicher Mäuse ist androgenabhängig (DOMINIC und PANDEY 1979).
2.7.2.3 Vandenbergh Effekt (Beschleunigung der sexuellen Reife)
Werden junge weibliche Mäuse vor der Geschlechtsreife dem im Urin fertiler männlicher Mäuse vorhandenen „puberty accelerating pheromon“ ausgesetzt, führt dies zu einer vorgezogenen beziehungsweise beschleunigten Entwicklung zur Geschlechtsreife (VANDENBERGH 1967, DRICKAMER 1983, PANDEY und PANDEY 1988, PRICE und VANDENBERGH 1992, MUCIGNAT-CARETTA et al.
1995a). Untersuchungen zeigen, dass der Kontakt in sehr frühen Säugestadien zwar Einfluss auf später auftretende Pheromon bedingte Reaktionen haben kann, aber keinen direkten Einfluss auf den Beginn der Geschlechtsreife nimmt (MUCIGNAT-CARETTA et al. 1995b). Der Effekt ist ebenfalls abhängig vom Alter des Spenders. Männliche Tiere sondern das Pheromon in ihrem Urin mit Beginn der Geschlechtsreife lebenslang ab. Der Effekt auf die weiblichen Tiere nimmt allerdings nach dem ersten Lebensjahr der männlichen Tiere kontinuierlich ab (DRICKAMER 1988). BRONSON und MARUNIAK (1976) zeigten dass sowohl die Aufnahme der männlichen Pheromone als auch ein sozialer Körperkontakt zwischen erwachsenem männlichen Tier und dem weiblichen Tier notwendig sind, um eine vorgezogene beziehungsweise beschleunigte Geschlechtsreife zu erreichen.
Noch nicht geschlechtsreife weibliche Tiere, die sich zuvor in einer Gruppe mit ausschließlich weiblichen Tieren befunden haben, reagieren bereits 30 min nach
der Östradiol-Konzentration, die sekundär die Ausschüttung von FSH unterdrückt und den Prolaktin-Serumspiegel leicht erhöht (BRONSON und MARUNIAK 1976).
2.7.2.4 Bruce Effekt (Hemmung der Gravidität durch die Anwesenheit eines unbekannten Männchens)
Setzt man ein verpaartes weibliches Tier dem Geruch des Urins eines unbekannten männlichen Tieres aus, so kommt es zum Abbruch der Trächtigkeit (BRUCE 1959).
Hingegen löst der bekannte Geruch des Paarungspartners keine derartige Reaktion aus (KUMAR und DOMINIC 1993). Dies liegt am olfaktorischen Erinnerungsvermögen des Bulbus olfactorius, welches während des Paarungsaktes durch das Organum vomeronasale aufgenommene Gerüche speichert (HALEM et al. 2001). Die Anwesenheit eines unbekannten Männchens führt in den ersten drei Tagen p.c. in 100 % der Fälle zu einem Abbruch der Gravidität, während in den darauf folgenden Tagen die Trächtigkeitsrate kontinuierlich ansteigt und ab dem siebten Trächtigkeitstag der beschriebene Effekt nicht mehr beobachtet werden kann (CHUNG et al. 1997). Allerdings zeigt die Trächtigkeitsrate eine Abhängigkeit zum genetischen Hintergrund der Embryonen, so zeigt sich beispielsweise in einer Verpaarung von weiblichen Tieren des Stammes Balb/c mit männlichen Tieren des gleichen Stammes und einer der Kopulation folgenden Exposition zu einem unbekannten männlichen Tier des Inzuchtstammes DKK einen Abbruch der Gravidität in 100 % der Fälle. Bei exakt gleicher Vorgehensweise mit Paarungspartnern anderer Mausstämme (C57BL/6Cr, CBA/J, C3H/HeN) wurden Trächtigkeitsraten zwischen 40 % bis 70 % erreicht (JAE CHUNG et al. 1999).
Die Nähe eines unbekannten Männchens verhindert den sonst in den ersten Tagen der Trächtigkeit stattfindenden Anstieg der Progesteron-Serumkonzentration. Es kommt nicht zur Ausbildung eines für die Gravidität erforderlichen C.l.graviditatis (FURUDATE et al. 1990).
2.8 Die Bedeutung der Sicherung transgener Mauslinien und die Notwendigkeit der Optimierung bestehender Methoden
Die Generierung transgener Tiere erfordert einen hohen Aufwand, dessen Ergebnis von unschätzbarem Wert für die biomedizinische Forschung ist. Diese wertvollen Tiere nach einer erarbeiteten Fragestellung nicht mehr zur Verfügung zu haben, wäre ein großer Verlust. Eine Zuchterhaltung ist dennoch aus den bereits genannten Gründen wie der Gefahr der genetischen Drift und Infektion, hohen Kosten, erhöhten Platzbedarfs sowie aus ethischen und tierschutzrelevanten Gründen nicht sinnvoll. Die Kryokonservierung bietet seit vielen Jahren die Gelegenheit der Sicherung von Mauslinien und ermöglicht darüber hinaus die Sanierung infizierter Haltungsbereiche sowie eine sichere und einfache Handhabe des Austausches von transgenen Mauslinien zwischen verschiedenen Forschungslaboren.
Dennoch gestaltet sich die Kryokonservierung bestimmter Mauslinien, deren Reproduktivität aufgrund ihres genetischen Hintergrundes eingeschränkt ist, schwieriger als die anderer Linien, und es bedarf einer genauen Überlegung, welche Kryokonservierungsmethode im Einzelfall die richtige ist.
Auch spielen Parameter der Umgebung eine wichtige Rolle. Haltungsbedingungen wie Raumtemperatur und -feuchte, verschiedene Haltungssysteme, Alter und Gesundheitszustand der Zuchttiere sowie „Handling“ und Management sind ernstzunehmende Parameter. Labormäuse reagieren sensibel auf Veränderungen ihrer Umwelt und Stressoren jeglicher Art wirken sich rasch in negativer Weise auf ihre Reproduktionsleistung aus, das gilt ausdrücklich auch für die Umweltbedingungen der Tierhaltung. Auch hier zeigen sich bestimmte Mauslinien sensitiver als andere. Um die Ausbeuten an Embryonen zu erhöhen und damit den Tierverbrauch deutlich zu verringern, ist eine Optimierung der angewandten Techniken und der Haltung der Tiere notwendig.
3 Tiere, Material und Methoden
Im Folgenden werden die an der Embryobank des DKFZ für die Kryokonservierung genutzten Tiere, benötigtes Material sowie das zur Kryokonservierung von achtzelligen Embryonen benutzte Verfahren beschrieben.
3.1 Tiere, transgene Linien
Die Embryobank des DKFZ verfügt heute über mehr als 95000 kryokonservierte Embryonen von 180 Linien, deren Kryokonservierung abgeschlossen ist, und von 50 weiteren Linien, die in Bearbeitung sind. In dieser Arbeit verwendete Liniendaten wurden über einen Zeitraum von Mai 1996 bis März 2006 Jahren erhoben. Es handelt sich um 169 Linien: 136 transgene Überexprimierer, 29 homologe Rekombinanten, 2 spontane Mutanten und 2 nicht transgene Hintergrundlinien.
Davon sind 28 Linien homozygot und 141 Linien heterozygot bzw. hemizygot transgen. Homozygot transgen sind diejenigen Linien, deren Tiere die Mutation auf beiden Chromosomen tragen. Heterozygot transgene Linien tragen die Mutation auf nur einem der beiden Allele. Hemizygot transgene Linien haben die Mutation auf einem Allel, während das entsprechende Gen auf dem zweiten Allel nicht vorhanden ist.
Da viele dieser transgenen Tiere bisher nicht publiziert wurden, sind in der Regel Liniennamen durch anonyme Nummern ersetzt. Der genetische Hintergrund der transgenen Tiere ließ sich wie folgt aufteilen: C57BL/6 37 %, B6D2Fn 15 %, FVB/N, CBA, C3H und NMRI jeweils circa 5 %. Die restlichen Prozente verteilten sich auf Tiere, deren genetischer Hintergrund nicht genau bekannt oder gemischt war. Die Embryobank musste sich bei den Angaben zum genetischen Hintergrund auf die Experimentatoren verlassen, deren Aussagen nicht überprüft werden konnten.
Zur Beantwortung der in der Einleitung beschriebenen Fragestellungen wurden jeweils unterschiedliche Linien herangezogen. Angaben über die verwendete Zahl der Linien, Vaginalpfropf positive Spendertiere (VP+-Spendertiere) und Embryonen sind im Ergebnisteil den jeweiligen Themen zugeordnet.
Die im DKFZ gezüchteten Tiere wurden im Alter von etwa vier Wochen vom Muttertier getrennt, mit Ohrenmarken oder Ohrlochungen gekennzeichnet, sowie genotypisiert (siehe unten). Weibliche Tiere wurden auch von der Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld, zugekauft. Bei Lieferung waren sie fünf bis sechs Wochen alt und frei von bestimmten nagerpathogenen Mikroorganismen, auf die sie nach den Empfehlungen der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) untersucht wurden (NICKLAS et al. 2002). Nach einer Eingewöhnungsphase von einer Woche im jeweiligen Haltungsbereich wurden die Tiere im Alter von circa 6 Wochen superovuliert.
Transgene männliche Tiere wurden mit weiblichen Tieren der gleichen transgenen Linie oder eines gleichen oder zumindest ähnlichen Wildtyps verpaart. Die männlichen Tiere wurden bis zu zehn Mal verpaart, in der Regel in einem Alter von drei bis sechs Monaten. Hier musste die Verfügbarkeit der männlichen Tiere der jeweiligen transgenen Linien berücksichtigt werden.
3.1.1 Nachweis der Transgenität
Die Tiere wurden in der Regel beim Absetzten vom Muttertier mit der aus einer Schwanzbiopsie extrahierten DNA genotypisiert. Der Nachweis erfolgte in den meisten Fällen mittels PCR oder Southern Blot Analyse, alternativ durch eine Reaktion von markierten Antikörpern mit peripheren Blutlymphozyten (PBL), die dann im Zytometer untersucht wurden. Die Genotypisierungen wurde von den Arbeitsgruppen durchgeführt, welche für die Tiere verantwortlich waren. Nicht transgene weibliche Geschwistertiere konnten in bestimmten Fällen zur Verpaarung mit Transgen positiven männlichen Tieren für die Kryokonservierung genutzt werden. Es wurden nur Tiere der gleichen Linie verpaart, um durch falsch negativ genotypisierte weibliche Tiere eine genetische Kontamination zu vermeiden. Auch blieb im Hinblick auf einen eventuell gestörten Rückkreuzungsverlauf im Einzelfall zu entscheiden, ob eine Verpaarung mit diesen weiblichen Tieren sinnvoll war.
3.1.2 Tierhaltung
Die zur Kryokonservierung bestimmten Tiere stammten aus sechs spezifiziert pathogenfreien (SPF) Haltungen (Barrieren), mehreren Isolatoren und zwei konventionellen Haltungen des DKFZ, sowie einer konventionellen Haltung des Tierlabors im Theoretikum der Universität Heidelberg. Die einzelnen Daten der Umweltbedingungen in den Haltungsbereichen, wie zum Beispiel Temperatur und relative Luftfeuchte, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Der überwiegende Teil an transgenen Versuchstieren wird im DKFZ in Barrieren gehalten, welche gasdicht von einander und von der Umwelt abgeschlossen sind.
Benötigtes Material gelangt über einen Autoklaven oder durch eine desinfizierende Materialschleuse in den Haltungsbereich. Es sind mehrere Tierlabore vorhanden, welche wiederum über jeweils ein eigenes Hochleistungsschwebstofffilter belüftet werden und eine eigene Klimaanlage besitzen. Die Barrieren bilden geschlossene Systeme mit eigenem Personal und einer Zutrittsbefugnis für einen eingeschränkten Personenkreis. Es werden spezifiziert pathogenfreie Tiere gehalten, die ebenfalls nach den oben bereits erwähnten FELASA–Richtlinien regelmäßig untersucht werden. Sie unterscheiden sich in der für ihre Haltung spezifischen mikrobiellen Flora, im DKFZ handelt es sich dabei überwiegend um unterschiedliche Pasteurellenstämme. Mitte 2004 wurde in einem SPF-Haltungsbereich eine murine Parvovirusinfektion festgestellt, worauf in einer Fragestellung in dieser Arbeit gesondert Bezug genommen wird (Kapitel 4.7).
Isolatoren sind Zelte, die nur über spezielle sterile Werkbänke zugängig sind und entweder mit Überdruck arbeiten, um ein Eindringen von Krankheitserregern in das Zelt zu verhindern oder bei kontaminierten Tieren mit Unterdruck belüftet sind, um ein Austreten der Erreger zu vermeiden. Sie bieten die Möglichkeit einer Quarantänehaltung zum Beispiel nach Embryotransfer vor dem Einschleusen in die Zielhaltung. Zum Zwecke der Kryokonservierung findet die Isolatorhaltung trotz der aufwändigen Technik bei sehr empfindlichen, keimfreien oder kontaminierten Tieren Verwendung. Im DKFZ werden Isolatoren der Firma Metall + Plastic, Radolfzell verwendet.
Tabelle 1: Umweltbedingungen der Haltungsbereiche im DKFZ (Angaben der Abteilung Technik)
Temperatur (C°) 22 ± 2
relative Luftfeuchte (%) 55 ± 5
Luftwechsel/h 15
Tag / Nacht (h) 12 / 12 (6-18Uhr / 18-6Uhr) Lichtintensität Tag (Lux) 1-9
Lichtintensität Nacht (Lux) 0
In den Tierhaltungsbereichen der konventionellen Haltung bestehen keine besonderen technischen und hygienischen Sicherheitsvorkehrungen gegen das Einschleppen von Infektionen von außen. Die Räumlichkeiten sind den Experimentatoren frei zugänglich. Um eine Standardisierung der Tierzucht dennoch zu gewährleisten, sind die Räume mit einer Beleuchtungsanlage, einer Klimaanlage sowie einer Luftbe- und -Entfeuchtung ausgestattet.
3.1.3 Käfige
Zur Haltung der weiblichen Tiere fanden Makrolonkäfige der Typen II (Fläche: 360 cm²) mit maximal 3 Tieren und Typ III (Fläche: 810 cm²) mit maximal 10 Tieren Verwendung. Die Käfige (siehe Abbildung 1) verfügen über einen Drahtdeckel mit Futterraufe und einer Tränkeflasche. Die männlichen Tiere wurden in der Regel allein in Typ II Käfigen gehalten.
Abb. 1 : Makrolonkäfig (Typ III) mit Futterraufe. Tränkeflaschen und Futter wurden der Übersichtlichkeit wegen vor dem Fotografieren entnommen.
Als Einstreu diente steriles Weichholzgranulat (Firma Altromin GmbH, Lage), welches ein- bis zweimal wöchentlich gewechselt wurde.
Zur Untersuchung Pheromon bedingter Effekte wurde ein Makrolonkäfig des Typs III verwendet. Der Drahtdeckel verfügt über zwei Futterraufen, Einsatzmöglichkeiten für zwei Tränkeflaschen und über ein angeschweißtes Gitter, welches den Käfig in geschlossenem Zustand in zwei gleich große Kompartimente aufteilt (Abbildung 2).
Abb. 2 : Trenngitterkäfig mit zwei Futterraufen. Tränkeflaschen und Futter wurden der Übersichtlichkeit wegen vor dem Fotografieren entnommen.
3.1.4 Futter und Tränke
Die Tiere erhielten eine pelletierte Standarddiät (Altromin 1324 N Forti, Firma Altromin GmbH, Lage) und Wasser ad libitum.
3.1.5 Definition der Spendertiere
Als Spendertiere sind diejenigen weiblichen Tiere zu verstehen, welche am Tag 0,5 p.c. einen Vaginalpfropf trugen und damit am Tag 2,5 p.c. zum Zwecke der Kryokonservierung getötet wurden. Im Folgenden werden Vaginalpfropf positive Spendertiere mit VP+-Spendertiere abgekürzt.
3.2 Material 3.2.1 Medien
Zur Kryokonservierung von Mausembryonen wurden verschiedene Medien verwendet, deren Funktion im Folgenden beschrieben wird. Ihre Zusammensetzung ist in Tabelle 2 aufgeführt.
3.2.1.1 PBS-Lösung
Zum Ausspülen der Embryonen aus dem Eileiter und zum Waschen der Embryonen wurde PBS-Lösung (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) ohne Albuminzusatz genutzt. Die Lösung wurde von der INVITROGEN GmbH, Karlsruhe bezogen und im Kühlschrank bei 4°C maximal bis zum Verfallsdatum gelagert. Angebrochene Flaschen wurden innerhalb einer Woche verbraucht.
3.2.1.2 M2-Medium
Zum Waschen der Embryonen und als Basismedium für das Einfriermedium sowie als Verdünnungsmedium wurde M2-Medium (Medium zur in vitro-Kultivierung embryonaler Präimplantationsstadien) genutzt (Quinn et al. 1982). Es handelt sich um eine modifizierte Krebs-Ringer Bikarbonatlösung, welche in der Zusammensetzung dem Whitten Medium (WHITTEN 1956) ähnelt.
Das Medium wurde von der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München bezogen. Stocklösungen wurden entsprechend der Empfehlung des Herstellers fraktioniert eingefroren (bei -20°C), der Bedarf für eine Woche wurde im Kühlschrank bei 4°C gelagert.
3.2.1.3 Einfriermedium
Zur Kryokonservierung der Embryonen wurde Einfriermedium angesetzt (Lagerung siehe Kapitel 3.2.1.2), bestehend aus dem Kulturmedium M2 und Glycerin (1.3 M, Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) als Kryoprotektivum:
1,4 g Glycerin ad 10 ml M2 Osmolarität: 1960-1980 mOsmol/kg
3.2.1.4 Verdünnungsmedium
Zur Revitalisierung wird ein Medium genutzt, welches im Auftauvorgang eine zu schnelle Rehydrierung und einen osmotischen Schock der Zellen verhindert.
Zusätzlich wird ein rasches Austreten des Kryoprotektivums aus den Zellen unterstützt und damit die zytotoxische Wirkung des Glycerins durch eine kürzere Einwirkzeit verringert (Lagerung siehe Kapitel 3.2.1.2):
3,2 g Saccharose + 9,1 ml M2 Osmolarität: 1700-1720 mOsmol/kg
Tabelle 2: Zusammensetzung der für die Kryokonservierung von achtzelligen Embryonen verwendeten Medien
Komponente
PBS (g/L)
M2 (g/L)
Einfrier- medium
(g/L)
Verdünnungs- medium
(g/L)
NaCl 75 5,532 5,532 5,532
Na2HPO4 32,7 - - -
CaCl2 x H2O - 0,251 0,251 0,251
MgSO4 - 0,165 0,165 0,165
KH2PO4 14,9 0,162 0,162 0,162
KCl - 0,356 0,356 0,356
NaHCO3 - 0,35 0,35 0,35
Albumin Bovine Fraktion V
- 4,0 4,0 4,0
D-Glucose - 1,0 1,0 1,0
HEPES - 5,43 5,43 5,43
Laktat x Na+ - 0,01 0,01 0,01
Pyruvat x Na+ - 0,036 0,036 0,036
Phenolrot x Na+ - 4,35 4,35 4,35
Glycerin - - 140 -
Saccharose - - - 34,34
Osmolarität:
(mOs/kg H20) 250-290 283 1960-1980 1700-1720
3.3 Methoden
3.3.1 Präparation von Mausembryonen
Im Folgenden wird die Behandlung der weiblichen Tiere zur Superovulation, die Verpaarung und Tötung, sowie die Präparation zum Erhalten von achtzelligen Embryonen beschrieben.
3.3.1.1 Superovulation weiblicher Tiere
Um eine Synchronisation des sexuellen Zyklus und möglichst hohe Zahlen an Embryonen zu erzielen, wurden die weiblichen Tiere mit exogenen Gonadotropinen behandelt. Es wurde ein Schema nach WHITTINGHAM (1971) angewandt, welches sich für die meisten In- und Auszuchtstämme bewährt hat (HEDRICH 2004). Die Tiere wurden mit einer intraperitonealen (i.p.) Gabe von equinem Choriongonadotropin (Intergonan®, Intervet GmbH, 47918 Tönisvorst) am Tag 1 sowie einer i.p. Gabe von humanem Choriongonadotropin (hCG: Primogonyl- 1000®, Schering-Deutschland GmbH, Berlin) am Tag 3 behandelt. Der Wochenbedarf an zentral eingekauften Hormonen wurde nach dem Ansetzen in 1 ml Fraktionen bei -20°C gelagert.
Tabelle 3: Superovulation.
eCG-Injektion hCG-Injektion
Stamm Uhrzeit I.U. Uhrzeit I.U.
CD-1 13.00 10 11.00 10
NMRI 11.00 10 11.00 10
C57BL/6 15.00 7 11.00 7
129 14.00 5 11.00 5
Balb/c 15.00 5 11.00 5
FVB 15.00 5 11.00 5
C3H 13.00 5 13.00 5
B6D2F1/F2 11.00 8 11.00 7
Angaben über Zeitpunkte und Dosierung der i.p. Hormoninjektion in Abhängigkeit des genetischen Hintergrundes. Die angegebenen Zeiten sollten nicht mehr als eine Stunde über bzw. unterschritten werden und gelten für einen Tag-/Nachtrhythmus von 6-18 Uhr. Internationale Einheiten sind mit I.U. abgekürzt.
Die für eine optimale Superovulation notwendige Hormondosis ist linienspezifisch (SCHENKEL 2006) und wurde dementsprechend appliziert (siehe Tabelle 4). Bei einem Tag- / Nachtzyklus von jeweils 12 Stunden (Lichtphase 6-18 Uhr, Dunkelphase 18-6 Uhr) wurde den Tieren zu einem ebenfalls linienspezifischen Zeitpunkt (siehe Tabelle 4), am ersten Tag zwischen 11 und 15 Uhr, das Hormon eCG i.p. verabreicht. Die i.p. Injektion des Hormons hCG erfolgte nach obigem Schema circa 48 Stunden später. Anschließend wurden männliche zu weiblichen Tieren im Verhältnis 1:1 verpaart und am Morgen des nächsten Tages auf vorhandene Vaginalpfröpfe überprüft. Männliche und weibliche Tiere wurden separiert und bis zu drei weibliche Tiere in einen Käfig (Typ III) verbracht. Tiere ohne Vaginalpfropf wurden nach einer zehntägigen Pause erneut superovuliert und verpaart, während VP+-Tiere am Tag 2,5 p.c. zur Entnahme achtzelliger Embryonen genutzt wurden.
3.3.1.2 Präparation der VP+-Spendertiere
Die VP+-Spendertiere wurden am Tag 2,5 p.c. durch zervikale Dislokation getötet und der Bauchraum steril eröffnet. Uterus, Salpinx und Ovar wurden beidseits frei präpariert und circa 3 mm der Uteri mit den Salpinges entnommen und in eine Petrischale (10 cm Durchmesser, Firma Greiner, Frickenhausen) mit 5 ml PBS- Lösung (auf Eis) verbracht. Falls notwendig, wurden die Salpinges nochmals unter dem Mikroskop von übrigem Binde- und Fettgewebes befreit und anschließend in einen Hohlschliffobjektträger mit 100 µl PBS-Lösung (auf Eis) überführt.
Um eine Verbreitung der in Kapitel 4.7 dargestellten Virusinfektion zu verhindern, wurden Tiere aus dieser Barrierenhaltung nicht wie sonst üblich lebend zur Entnahme der Embryonen für die Kryokonservierung ausgeschleust. Die Entnahme der Uteri erfolgte im Haltungsbereich selbst durch geschultes Personal. Nach Ausschleusen der Uteri, die in sterilen 2ml Eppendorfgefäßen (Neolab Migge, Heidelberg) mit 5 ml PBS (4°C) zwischengelagert wurden, konnten die Embryonen wie oben beschrieben gewonnen werden.
3.3.1.3 Gewinnen und Waschen der Embryonen
Unter der Stereolupe (Leica MZ75, 31,5fache Vergrösserung, Leica Mikrosysteme, Bensheim) wurden dieSalpinges jeweils einzeln mit einer Dumontpinzette (Dumont No.5 Firma Sigma Aldrich, München) am Rand eines Hohlschliffglases (Neolab Migge, Heidelberg) fixiert und mit einer 1 ml Einmalspritze mit Kanüle (Durchmesser 0,42 x 23 mm, Firma Neolab Migge, Heidelberg) ausgewaschen. Hierzu wurde mit der Kanüle am Ostium uterinum tubae auf der Pars uterinae der Salpinx eingestochen und die Embryonen mit 0,15 bis 0,2 ml PBS-Lösung (4°C) durch das Infundibulum ausgespült. Um die Erwärmung durch die Außentemperatur möglichst gering zu halten wurde auf zügiges Arbeiten Wert gelegt. Die Embryonen wurden anschließend mit einer feinen Glaskapillare aus Borosilicatglas (1 mm Außendurchmesser normalwandig, Firma Hilgenberg, Malsfeld, die Kapillare wurde vor Gebrauch in der Flamme eines Bunsenbrenners gezogen) aufgenommen und in die Vertiefung eines neuen Hohlschliffglases mit 100 µl M2-Medium auf Eis verbracht.
Abb. 3 : Ausspülen der Embryonen mit Hilfe einer an der Pars uterina der Salpinx eingeführten Kanüle. 20fache Vergrösserung.
