3.3 Methoden
3.3.6 Experimente zur Erhöhung der Embryonenzahl durch die
Mit dem Ziel die Zahl an achtzelligen Embryonen je Spendertier zu erhöhen, wurden drei Experimente durchgeführt, die auf einer Stimulation der weiblichen Tiere durch Pheromone beruhen.
3.3.6.1 „Lee-Boot-Effekt“
Leben erwachsene weibliche Mäuse in Gruppen, so verlängert sich die Zeitdauer ihres ovariellen Zyklus (siehe Kapitel 2.9.2.1). Zur Untersuchung des Einflusses des oben beschriebenen Effektes auf die erhaltenen achtzelligen Embryonen wurden zwei hemizygot transgene Linien mit dem genetischen Hintergrund C57BL/6 gewählt, zu deren Kryokonservierung wöchentlich zehn weibliche Tiere der Inzuchtlinie C57BL/6 im Alter von fünf bis sechs Wochen von der Firma Charles River Wiga zugekauft wurden. Die Lieferung bestand aus jeweils zehn Tieren je Transportbox, welche bei Ankunft in der Zielhaltung auf Gruppen zu 3:3:4 Tieren in Makrolonkäfigen des Typs III aufgeteilt wurden. Es wurden 220 weibliche Tiere der Linie C57BL/6 mit insgesamt 15 männlichen Tieren der Linie D1 Cre B6 verpaart, welche einer SPF-Haltung gehalten wurden. Von der zweiten Linie HGF B6 wurden 10 männliche Tiere mit 124 weiblichen Tieren der Linie C57BL/6 in einer konventionellen Haltung verpaart.
Nach einer Eingewöhnungsphase von sieben Tagen wurden die Tiere superovuliert (siehe 3.3.1.1), und im Anschluss an die zweite Gonadotropingabe im Verhältnis 1:1 mit einem transgenen männlichen Tier verpaart. Am folgenden Tag wurden die weiblichen Tiere auf vorhandene Vaginalpfröpfe überprüft. Am Tag 2,5 p.c. wurden die Tiere nach oben beschriebener Vorgehensweise getötet, die Embryonen
Die Kontrollgruppen wurden unter gleichen Bedingungen gehalten, wobei die Liefergröße von zehn zugekauften weiblichen Tieren je Gruppe beibehalten wurde, also keine Aufteilung der gelieferten Tiere in Kleingruppen erfolgte.
3.3.6.2 „Whitten-Effekt“
Wird eine männliche Maus in eine Gruppe von weiblichen Mäusen verbracht, so befinden sich die meisten weiblichen Tiere nach drei Tagen im Östrus. Der luteolytische Effekt des männlichen Tieres beruht auf einer Freisetzung endogener Gonadotropine im weiblichen Tier und kann damit zum Östrus und zur Ovulation führen (siehe Kapitel 2.7.2.2). Um diesen Effekt für einen möglichen Nutzen im Labor zu testen, wurden zwei experimentelle Serien durchgeführt.
3.3.6.2.1 „Whitten-Effekt“ – Trenngitter
Um einen möglichen Effekt des männlichen Tieres auf ein weibliches Tier zu untersuchen, wurde eine transgene Linie auf dem Hintergrund der Auszuchtlinie FVB/N genutzt. Die weiblichen Tiere wurden mit einem Alter von fünf bis sechs Wochen aus der kommerziellen Zucht der Charles River Wiga GmbH zugekauft und wöchentlich in einer Gruppe zu sieben Tieren über einen Zeitraum von neun Wochen geliefert. Nach einer Eingewöhnungsphase von sieben Tagen in Gruppenhaltung von bis zu sieben Tieren je Käfig wurde jedem weiblichen Tier der Versuchsgruppe ein männliches Tier zugeordnet. Die weiblichen Tiere waren bis zu diesem Zeitpunkt (seit dem Absetzen der Tiere vom Muttertier bei der Charles River Wiga GmbH, im Alter von circa drei Wochen) vollständig von männlichen Tieren getrennt. Die Tiere wurden in einem gemeinsamen Makrolonkäfig (Typ III) gehalten, jedoch zunächst durch ein Trenngitter voneinander getrennt (siehe Kapitel 3.1.3, Abbildung 2). Die Superovulation erfolgte nach Standardmethoden (siehe Kapitel 3.3.1.1). Nach 48 Stunden separierter Haltung wurde das Trenngitter zur Verpaarung entfernt. Die stattgefundene Paarung wurde anhand des Vaginalpfropfes einen Tag später überprüft und männliche und weibliche Tiere separiert in Einzelkäfigen gehalten. VP+-Tiere wurden am Tag 2,5 p.c. zur
Entnahme der Embryonen mittels zervikaler Dislokation getötet. Die Embryonen wurden nach oben beschriebener Vorgehensweise kryokonserviert.
3.3.6.2.2 „Whitten-Effekt“ – Einstreu
Es sollte geprüft werden, ob die Stimulation eines weiblichen Tieres durch den Urin eines männlichen Tieres, mit dem es nach 48 Stunden verpaart wurde, zu mehr achtzelligen Embryonen führt. Eine transgene Linie mit dem genetischen Hintergrund C57/BL6 wurde hierfür gewählt. Wöchentlich wurden zehn weibliche Tiere der Inzuchtlinie C57/BL6 im Alter von fünf bis sechs Wochen von Charles River Wiga zugekauft. Danach wurden zwei Gruppen gebildet. Die weiblichen Tiere der Kontrollgruppe wurden bis zur Verpaarung in einer Gruppe zu fünf Tieren gehalten. Die Tiere der Versuchsgruppe wurden 48 Stunden vor der Verpaarung einzeln in Makrolonkäfige (Typ II) gesetzt, in denen zuvor eine handvoll Einstreu
„ihres“ männlichen Tieres gelegt worden war. Nach 48 Stunden und erfolgter Superovulation (siehe Kapitel 3.3.1.1) wurden die Tiere im Verhältnis 1:1 mit dem betreffenden Männchen verpaart. Am nächsten Morgen wurden die Tiere auf das Vorhandensein eines Vaginalpfropfes untersucht und getrennt in Einzelkäfige verbracht. Um einen möglichen „Bruce-Effekt“ (siehe Kapitel 2.7.2.4) zu vermeiden, wurde darauf geachtet, dass jedes weibliche Tier mit dem männlichen Tier verpaart wurde, auf dessen Einstreu es gehalten wurde. Die männlichen Tiere wurden daher in einem Käfig direkt über „ihrem“ weiblichen Tier gehalten und die Käfigkarte des weiblichen Tieres mit einer entsprechenden auffälligen Notiz versehen.
3.3.7 Statistische Auswertung
Die in dieser Arbeit genutzten Daten entstammen der Embryobank des DKFZ. Es sind Daten, die aus Laborbuchaufzeichnungen, Zuchtbüchern und einer elektronischen Datenbank hervorgehen. Die Embryobank des DKFZ verfolgt das Ziel der Sicherung bestimmter Linien für die Zukunft, und so entstammen die genutzten Liniendaten der alltäglichen Laborroutine und Dokumentation. Zudem
Daher wurde für einen Teil diese Arbeit keine Versuchsplanung erstellt, die eine statistische Analyse erlauben würde. Es handelt sich um so genannte „case studies“.
In Grafiken veranschaulichte Daten in Form von Embryonen je VP+-Spendertier sowie in Prozent gezeigte VP+-Spendertiere zur Gesamtzahl verpaarter weiblicher Tiere wurden mit Hilfe des arithmetischen Mittelwertes berechnet. Die Standardabweichung wurde ausgehend von einer Stichprobe ermittelt. Bei den Experimenten zur Erhöhung der Embryonenzahl durch Pheromon bedingte Effekte (Kapitel 4.9) wurden Mittelwerte sowie Standardabweichungen auf die jeweilige Versuchsreihe bezogen berechnet. Darüber hinaus wurde bei den Versuchen zur Untersuchung Pheromon bedingter Effekte ein zweiseitiger t-Test für Stichproben unterschiedlicher Varianz zur Prüfung auf Signifikanz der eventuell bestehenden Unterschiede zwischen Versuchs- und Kontrollgruppe durchgeführt.
Ergebnisse mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von unter 5 % wurden als statistisch signifikant (P < 0,05) bezeichnet, Irrtumswahrscheinlichkeiten von unter 0,1 % galten als statistisch hochsignifikant (P < 0,001).