Im Folgenden werden die Signale verschiedener Pheromon bedingter Effekte diskutiert, die den Zeitpunkt der Fertilität weiblicher Mäuse regulieren können.
Pheromone dienen der artspezifischen Kommunikation und eine Berücksichtigung dieser kann in der Versuchstierhaltung zu einer Verbesserung der Zuchtergebnisse, aber auch im Falle der Kryokonservierung zu einer Erhöhung der Ausbeuten an achtzelligen Embryonen führen. So sind unter anderem Transportstress, eine neue Umgebung und die Haltung der weiblichen Tiere in Gruppen Faktoren, die sich negativ auf die Ausbeuten an achtzelligen Embryonen auswirken können (CHAPMAN et al. 2000).
Die Superovulation weiblicher Tiere ist eine wirkungsvolle Technik, auf die jedoch nicht alle transgenen Linien im gewünschten Maße reagieren. Hinzu kommt, dass transgene weibliche Tiere oftmals nicht in einem für die Superovulation optimalen Alter zur Verfügung stehen (NAGY et al. 2003). Dies liegt daran, dass die Populationen transgener Linien meist klein sind und nicht ausreichend viele weibliche Tiere im geeigneten Alter über Wochen hinweg zur Verfügung stehen.
Ziel dieser Untersuchung war es herauszufinden, ob eine Beachtung Pheromon bedingter Effekte die Ausbeute an Embryonen erhöhen kann, um damit die Methodik der Superovulation sinnvoll zu ergänzen.
5.8.1 Der „Lee-Boot-Effekt“
Zugekaufte weibliche Tiere werden zu zehnt in einem Transportkäfig geliefert. Es ist aufgrund der Wurfgröße der Maus davon auszugehen, dass diese Tiere nicht aus einem Wurf stammen. VAN DER LEE und BOOT (1955) zeigten, dass bei einer Gruppengröße von vier Tieren in einem Käfig mit einer Grundfläche von 187 cm2 es zu einer Verlängerung der Zyklusdauer der Tiere kommen kann. Die vom DKFZ zugekauften weiblichen Tiere werden vor Anlieferung bis zu zehnt auf einer Käfigfläche von 810 cm2 gehalten. Hier wird gezeigt, dass eine Aufteilung der
führt (siehe Abbildung 20, S.74). Der Effekt ist linienabhängig, bei einer der untersuchten Linien konnte keine Erhöhung der Embryonenausbeute erzielt werden, während bei einer anderen Linie mit ein signifikanter Faktor von 40 erreicht wurde (siehe Tabelle 13, S.73; Abbildung 20, S.74 und Abbildung 30, S.93). Die hier erfassten Ergebnisse des untersuchten Lee-Boot-Effektes stimmen demnach mit bereits veröffentlichten Untersuchungen (mit dem Ziel der Erhöhung von Nachkommen) überein (MA et al. 1998).
Betrachtet man die Zahl der VP+-Spendertiere im Verhältnis zur Zahl der verpaarten Tiere, so sind zwischen den Versuchs- und Kontrollgruppen nur geringe, nicht signifikante Unterschiede zu sehen (siehe Abbildung 21, S.75 und Abbildung 31, S.94). Auffällig ist jedoch, dass es in der Kontrollgruppe der Mauslinie HGF B6 trotz der hohen Prozentzahl kopulierter Tiere (68 %) nur zu geringen Ausbeuten an achtzelligen Embryonen kam.
Bei der Präparation der VP+-Spendertiere am Tag 2,5 p.c. wurden außer den achtzelligen Embryonen weitere, frühere Eileiterstadien gefunden. Eine Auswertung dieser (Abbildung 23, S.78) zeigt, dass die Zahl erhaltener Embryonen je VP+ -Spendertier vom Einzellstadium zum Vierzellstadium in beiden Versuchs- und Kontrollgruppen kontinuierlich abnimmt. Es ist davon auszugehen, dass es sich bei den Einzell- und Zweizellstadien um Embryonen handelt, die sich nicht weiter teilen werden. Möglicherweise sind auch unbefruchtete Oocyten vorhanden, was sich aber zum Präparationszeitpunkt mit den zur Verfügung stehenden Mitteln nicht überprüfen ließ. Eine Begründung hierfür ist die Tatsache, dass das männliche Tier nur über den Zeitraum einer Dunkelphase im Käfig des weiblichen Tieres belassen wird und die stattgefundene Verpaarung durch die Kontrolle des Vaginalpfropfes überprüft wird. Hinzukommt die hormonelle Behandlung der weiblichen Tiere, die zu einer Zyklussynchronisation und einer zeitlich festgelegten Ovulation führt. Die Paarung der Tiere erfolgt in der Regel in der Mitte der Dunkelphase, das heißt im DKFZ um circa 24 Uhr. Die Oocyten befinden sich am folgenden Mittag um 12 Uhr in der Ampulla der Salpinx und am Tag 1,5 p.c. sind aus befruchteten Oocyten bereits zweizellige Embryonen hervorgegangen.
Es ist denkbar, dass erhaltene vierzellige Embryonen in ihrer Entwicklung einer zeitlichen Verzögerung unterliegen, zum Beispiel aufgrund einer erst in den letzten Stunden der Dunkelphase stattgefundenen Verpaarung. Daher werden vierzellige Embryonen grundsätzlich kryokonserviert, jedoch an der Embryobank des DKFZ in der Regel nicht statistisch erfasst und auch nicht für die Mindestanzahl der zu konservierenden Embryonen mitgezählt.
Bei der Betrachtung einer Zusammenfassung aller sonstigen Eileiterstadien (alle außer Achtzellern) mit den achtzelligen Embryonen (siehe Abbildung 22, S.77) zeigt sich zwischen der Versuchsgruppe und Kontrollgruppe der transgenen Mauslinie HGF B6 ein signifikanter Unterschied. So sind in der Versuchsgruppe 4,02 achtzellige Embryonen und 2,71 sonstige Embryonalstadien inklusive Oocyten je VP+-Spendertier, also insgesamt 6,72 Embryonen inklusive Oocyten je Spendertier erfasst, während in der Kontrollgruppe lediglich 0,12 achtzellige Embryonen und 1,53 sonstige Embryonalstadien inklusive Oocyten je Spendertier, also 1,65 Embryonen inklusive Oocyten erhalten wurden.
Errechnet man nun aus den vorliegenden Daten die Prozente derjenigen ovulierten Oocyten, die sich am Tag 2,5 p.c. zum Achtzellstadium entwickelt haben (siehe Abbildung 24, S.81), so wird ein weiterer Faktor deutlich. Bei der Linie HGF B6 entwickeln sich 58,84 % der ovulierten Zellen der Versuchsgruppe zu achtzelligen Embryonen, während in der Kontrollgruppe nur 6,41 % das Achtzellstadium erreichen. Dies bedeutet, dass die Zahl erhaltener achtzelliger Embryonen am Tag 2,5 p.c. zum einen durch eine bedeutsam höhere Zahl ovulierter Oocyten, aber auch durch eine signifikant höhere Entwicklungsrate der Embryonen bis zu Achtzellstadium zustande kommt.
Die zweite untersuchte transgene Linie D1 Cre B6 zeigt in der Gesamtzahl erhaltener sonstiger Eileiterstadien keinen signifikanten Unterschied zwischen Versuchs- und Kontrollgruppe (siehe Abbildung 22, S.77). Der Prozentsatz der Embryonen die das Achtzellstadium erreichen unterscheidet sich nicht signifikant
fünf Tieren, keine Erhöhung der Gesamtzahl erhaltener Embryonen verschiedener Stadien oder achtzelligen Embryonen und keine Erhöhung des Prozentsatzes der sich zum Achtzellstadium entwickelnden Embryonen. Dies verdeutlicht nochmals die Linienabhängigkeit der Sensitivität gegenüber dem hier untersuchten Pheromon abhängigen Effektes.
5.8.2 Der „Whitten-Effekt“
Während der Lee-Boot-Effekt einen Pheromon bedingten Effekt zwischen weiblichen Tieren beschreibt, so handelt es sich beim Whitten-Effekt um ein vom männlichen Tier mit dem Urin abgegebenes Signal, welches von den weiblichen Tieren beantwortet wird.
Auch bei dieser Untersuchung wurden die weiblichen Tiere zugekauft und in Gruppen angeliefert, von denen man annehmen muss, dass es sich nicht ausschließlich um Wurfgeschwister handelt. Damit lässt sich auch bei diesen Tieren eine verlängerte Zyklusdauer vermuten (siehe Kapitel 2.7.2.1). Der Einsatz eines Trenngitters, das einen Geruchskontakt zwischen dem männlichen und weiblichen Tier ermöglicht, eine Kopulation jedoch verhindert, erhöhte nicht die Zahl erhaltener achtzelliger, kryokonservierbarer Embryonen. Vielmehr waren die Ergebnisse der Versuchsgruppe niedriger als die der Kontrollgruppe (konventionell verpaarte Tiere) (Tabelle 15, S.84; Abbildung 21, S.75 und Abbildung 30, S.93). Um dieses Phänomen besser verstehen zu können, wurden die Tiere in den 48 Stunden, in denen sie sich im Trenngitterkäfig befanden, beobachtet. Dabei war auffällig, dass sich die Tiere (sowohl männliche als auch weibliche) sehr aktiv verhielten und vor allem in den ersten Stunden versuchten, auf die andere Seite des Trenngitters zu gelangen. Die Situation des Trenngitterkäfigs verursachte einen Stress, der letztendlich den gewünschten Effekt des männlichen Tieres überlagert haben mag.
Dies ist nicht abwegig, da Stress über mehrere biochemische Reaktionen zu einer Verhinderung der Ovulation führen kann (ROOZENDAAL et al. 1995, siehe auch Kapitel 2.5).
Um den beschriebenen Stress zu vermeiden und dennoch den Pheromon bedingten Effekt des männlichen Tieres nutzen zu können, wurde in einem erneuten Versuchsansatz die Einstreu eines Männchens in den Käfig des einzeln sitzenden Weibchens gelegt. Dies wirkte sich positiv auf die Zahl erhaltener achtzelliger, kryokonservierbarer Embryonen der so gehaltenen „Versuchsgruppe“
aus (siehe Tabelle 15, S.84; Abbildung 25, S.85 und 30, S.93), was die Theorie der Stress verursachenden Wirkung des Trenngitterkäfigs bestärkt.
Sicherlich wäre es möglich, durch eine längere Verweilzeit der weiblichen und männlichen Tiere im Trenngitterkäfig, eine Art „Gewöhnungsphase“ einzuführen und so den erlebten Stress der Tiere nach einiger Zeit zu minimieren. Es dürfen jedoch rein praktische Aspekte nicht außer Acht gelassen werden. So ist diese Art der Haltung und Verpaarung mit einem höheren Platzbedarf und Arbeitsaufwand verbunden, der sicherlich im Falle extrem schwieriger Linien in Kauf genommen wird, aber generell nicht für jede zu kryokonservierende Mauslinie durchführbar ist.
Zudem ist eine große Sorgfalt erforderlich, um ein Vertauschen von Tieren und Material zu vermeiden, was zu einem negativen Effekt führen würde (Bruce-Effekt, siehe Kapitel 2.7.2.4).
Das Verhältnis der VP+-Tiere zur Zahl verpaarter Tiere zeigt sich in den Versuchs-und Kontrollgruppen etwa gleich hoch (Abbildung 26, S.86 Versuchs-und Abbildung 31, S.94).
Es ist zu sehen, dass die Gruppe der höheren Embryonenausbeuten auch die höchste Zahl kopulierter Tiere aufweist. Deutlich wird auch hier, dass die Ausnutzung des Pheromon bedingten Effektes unter der Vermeidung von Stress zu einer Erhöhung der Zahl achtzelliger kryokonservierbarer Embryonen je VP+ -Spendertier führt und nicht zu einer Erhöhung der Embryonenzahl durch eine erhöhte Zahl kopulierter Tiere.
Wie bereits bei der Untersuchung anderer Eileiterstadien am Tag 2,5 p.c. des Lee-Boot-Effektes diskutiert, nimmt auch im Whittenexperiment die Zahl erhaltener Embryonen je VP+-Spendertier vom Einzell- bis Vierzellstadium kontinuierlich ab
Die Gesamtzahl erhaltener Embryonen und Oocyten am Tag 2,5 p.c. lässt auch hier einen Rückschluss auf die Zahl ovulierter Oocyten zu. Im Trenngitterexperiment sind dies 4,74 Oocyten je VP+-Spendertier in der Versuchsgruppe und 6,71 Oocyten je VP+-Spendertier in der Kontrollgruppe (siehe Tabelle 16, S.90 und Abbildung 27, S.88). Dieses Ergebnis stimmt somit überein mit der Zahl erhaltener achtzelliger kryokonservierbarer Embryonen, die für die Versuchsgruppe niedriger liegt als für die Kontrollgruppe.
73,68 % der Embryonen in der Versuchsgruppe und 73,40 % der Embryonen in der Kontrollgruppe des Trenngitterxperimentes erreichen intakt das Achtzellstadium (siehe Abbildung 29, S.92). Dies bedeutet zusammengefasst, dass die Gesamtzahl erhaltener Embryonen inklusive Oocyten am Tag 2,5 p.c. in der Versuchsgruppe kleiner ist, die Ursache hierfür jedoch nicht in der Entwicklung der Oocyten zum achtzelligen Embryo zu suchen ist, da dieser Prozentsatz für die Versuchs- und Kontrollgruppe gleich hoch ist.
Das Einstreuexperiment zeigt hingegen ein anderes Ergebnis. Die Gesamtzahl erhaltener Embryonen und Oocyten am Tag 2,5 p.c. ist hier in der Versuchsgruppe im Mittelwert mit 7,46 Embryonen je VP+-Spendertier höher als in der Kontrollgruppe mit 4,43 Embryonen je VP+-Spendertier, jedoch aufgrund der großen Streuung der erhobenen Daten nicht signifikant (siehe Tabelle 16, S.90 und Abbildung 27, S.88). Diese Daten sind in Parallelität zur Ausbeute an achtzelligen Embryonen je VP+-Spendertier zu sehen, welche in der Versuchsgruppe ein besseres Ergebnis als in der Kontrollgruppe zeigen. Die Prozentzahl derjenigen Embryonen, die sich zum intakten Achtzeller entwickeln, ist in der Versuchsgruppe ebenfalls um circa 10 Prozentpunkte erhöht gegenüber der Kontrollgruppe.
Zusammengefasst bedeutet dies, dass die höhere Zahl erhaltener Achtzeller am Tag 2,5 p.c. in der Versuchsgruppe zum einen durch eine höhere Zahl ovulierter Oocyten zustande kommt und zum anderen durch eine bessere Entwicklungsrate begünstigt wird.
Die Untersuchungen zeigen, dass Pheromon bedingte Effekte einen linienspezifischen Einfluss auf die Ausbeute an Embryonen haben (Abbildung 30,
S.93). Die Nutzung Pheromon bedingter Effekte stellt damit trotz erhöhten Platzbedarfs und Arbeitsaufwandes eine sinnvolle Ergänzung der Superovulation besonders bei schlecht züchtenden Linien dar.
Zusammengefasst beruht die Beeinflussung der Ausbeuten an achtzelligen Embryonen auf einem multifaktoriellen Geschehen.
Eine Optimierung der Kryokonservierung erfordert es negative Beeinflussungen soweit möglich zu minimieren, um mit der geringsten notwendigen Zahl an Spendertieren eine transgene Mauslinie für die Zukunft sichern zu können. Dies und auch die Tatsache, dass kryokonservierte Linien nicht weiter in Zucht gehalten werden müssen, ist ein Beitrag zum Tierschutz und zu den „3“-R Forderungen von RUSSELL und BURCH (1959), die Anzahl der Versuchstiere wann immer möglich zu reduzieren.
6 Zusammenfassung
Anna Schwab
Optimierung der Embryonenzahl für die Kryokonservierung transgener Mäuse Die Kryokonservierung früher Embryonalstadien ist eine zuverlässige Technologie, um wertvolle transgene Mauslinien ohne Zuchterhalt zu sichern. Im DKFZ Heidelberg werden seit etwa zehn Jahren konsequent transgene Mäuse kryokonserviert. Dabei schwankt die Zahl der Embryonen, die aus speziell für die Kryokonservierung angesetzten Verpaarungen erhalten werden, erheblich und wird somit zu einem der limitierenden Faktoren. In dieser Dissertation werden mit dem Datenmaterial von 95000 kryokonservierten Embryonen die Ursachen für diese Schwankungen untersucht und nach Möglichkeiten für eine höhere Effizienz gesucht.
Die Daten zeigen, dass ein erheblicher Umwelteinfluss auf den Haltungsbereich und die dort vorhandene Technik besteht, unter anderem weil extreme Witterungsbedingungen selbst starke Klimaanlagen überfordern und bis zu einem regelrechten Zusammenbruch der Zucht führen können. So entsteht in Abhängigkeit der Wetterbedingungen ein eigenes Jahresprofil für jedes Tierlabor, was auch an Hand von Daten aus anderen Tierlabors gezeigt wurde.
Besonders wichtig ist eine hygienisch einwandfreie Tierhaltung: In einer MPV-(murines Parvovirus) infizierten Haltung reduzierte sich innerhalb weniger Monate die Zahl der erhaltenen Embryonen (insgesamt und je Spendertier) dramatisch.
Auch biologische Gründe spielen eine erhebliche Rolle, herausragend ist der genetische Hintergrund: Hybrid- oder Auszuchtmäuse hatten deutlich bessere Zuchterfolge als die für die Transgenese sehr beliebten C57/BL6 Inzuchtmäuse.
Das vorhandene Datenmaterial zeigt auch, dass eine dreiwöchige Verpaarungsfrequenz der männlichen (transgenen) Tiere am effektivsten ist.
Um das Verfahren nach der Superovulation zu optimieren, wurde ein möglicher Einfluss Pheromon bedingter Effekte untersucht: Der Lee-Boot Effekt beschreibt eine Zyklussuppression bei in großen Gruppen gehaltenen weiblichen Tieren, wie dies in Tierhaltungen häufig der Fall ist. Bei bis zu vier Tieren großen Gruppen erhielten wir im Durchschnitt eineinhalb Mal mehr Embryonen je Spendertier, in Einzelfällen bis zu vierzig Mal mehr. Der Whitten Effekt (Zyklus synchronisierender
Effekt), der durch eine Exposition des weiblichen Tieres zu den Pheromonen eines männlichen Tieres ausgelöst wird, führte im Mittel zu einer Steigerung der Embryonenausbeute um den Faktor 2,4. Beide Effekte zeigten auch eine Erhöhung der Anzahl ovulierter Oocyten.
Die hier gezeigten Ergebnisse führen zu einer höheren Effektivität der Embryonengewinnung und tragen somit zum Tierschutz bei.
7 Summary
Anna Schwab
Improving the Gain of Transgenic Mouse Embryos for Cryopreservation
The cryopreservation of early embryonic stages is a powerful tool to save and to handle the increasing number of transgenic mouse lines. Cryopreservation of transgenic mice is being done at the DKFZ in Heidelberg since ten years. However, the outcome of embryos varies from line to line. Using the data of 95000 cryopreserved embryos the reasons for these variances were elucidated and possibilities to raise the efficiency were investigated.
Environmental effects influence the climate of the facility. Extreme weather conditions are not fully compensated by the air conditioning supply even if powerful equipments are used. This results in a specific season profile for each facility. Data of other facilities show the same behaviour.
A MPV- (mouse parvo virus) infection of mice housed in a SPF-facility enabled the bad opportunity to analyse its impact on mating and the number of embryos obtained. Within a couple of months following the detection of the infection the efficiency of breeding collapsed.
Biological influences also play an important role, e.g. the genetic background: While hybrid and outbred mice are very active, C57BL/6 inbred mice most common for transgenesis provide the smallest efficiency. Furthermore, male transgenic mice show the highest success in mating with a breeding interval of three weeks.
To optimize the cryopreservation technique, especially in case of “difficult” lines, pheromonal effects were investigated.
The Lee-Boot Effect describes an estrous suppression caused by group sizes of more than four females per cage. Mating of females housed in groups of a maximum of four mice delivered more embryos than their controls (average: factor of 1.5, the factor 40 was detected in one case).
The Whitten Effect (cycle synchronizing effect) induces ovulation following the exposure to the male: In this case the efficiency was raised up to a factor of 2.4.
The data presented here show possibilities to reduce the number of animals needed for cryopreservation and are subsequently a contribution to the animal welfare.
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