Das Cyclophosphamid, die Valproinsäure sowie das 5-Fluorouracil wurden von der Firma Sigma-Aldrich GmbH bezogen während das Valpromid von der Firma Alfa Aesar GmbH & Co KG erworben wurde. Weitere Informationen zu den Substanzen sind der Tabelle 3.1 zu entnehmen.
Substanz CAS-Nr. Molare Masse Reinheit Lagerung Cyclophosphamid 6055-19-2 279,1 g / mol ≥ 97 % in DMSO, - 20 °C
5-Fluorouracil 51-21-8 130,1 g / mol ≥ 99 % in DMSO, - 20 °C Valproinsäure 99-66-1 144,2 g / mol 99,9 % flüssig, 23 °C
Valpromid 2430-27-5 143,2 g / mol 97 % in DMSO, - 20 °C Tab. 3.1: Die in dieser Arbeit verwendeten Substanzen und zusätzliche Informationen
3.2 Zelllinien
Die F9- und ES-D3-Zellen wurden direkt von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA) bezogen. Die BALB/c-3T3-Klon-A31-Zelllinie ist durch Frau Dr. Andrea Seiler von der Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch (ZEBET, Berlin, Deutschland) zur Verfügung gestellt worden und wurde ursprünglich ebenfalls von der ATCC erworben.
Die F9-Zelle stammt aus einem testikulären Teratokarzinom des Mausstammes 129 (BERSTINE et al. 1973) und die BALB/c-3T3-Fibroblastenzelle wurde aus 14 bis 17 Tage alten BALB/c Mausembryonen entwickelt (AARONSON u. TODARO 1968). Die ES-D3-Zelle repräsentiert eine embryonale pluripotente Stammzelle, erhalten aus der Blastozyste einer 129S4/SvPas Maus (DOETSCHMANN et al. 1985).
3.2.1 Kultivierung
Die drei verwendeten Zelllinien wachsen anhaftend (adhärent) in einschichtiger Kultur (Monolayer) und wurden in ihrem jeweiligen Zellkulturmedium im Brutschrank
3 Material und Methoden
bei 37 °C, 5 % CO2 und wasserdampfgesättigter Atmosphäre kultiviert. Das Medium der F9-Zellen wurde täglich durch frisches ausgetauscht, die BALB/c-3T3- und ES-D3-Zellen erhielten im Zuge ihrer Subkultivierungen einen Mediumwechsel.
Das für die Herstellung der Kulturmedien verwendete FBS wurde für 20 Minuten bei 56 °C hitzeinaktiviert. Die komplett angesetzten Erhaltungsmedien lagerten für maximal eine Woche in 50 mL Aliquots bei 4 °C.
F9-Kulturmedium: DMEM / HAM´s F12 ohne L-Glutamin, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 0,145 mM 2-Mercaptoethanol
BALB/c-3T3-Kulturmedium: 1 x DMEM mit L-Glutamin, 10 % FBS, 4 mM L-Glutamin, 50 U/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin
ES-D3-Kulturmedium: 1 x DMEM mit L-Glutamin, 15 % FBS (Hyclone®), 2 mM L-Glutamin, 50 U/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin, 1 % nicht essentielle Aminosäuren (NEAA), 0,1 mM 2-Mercaptoethanol;
direkt zur Kulturschale pipettiert: 1000 U/mL eines murinen Leukemia Inhibitory Factor (mLIF)
3.2.2 Subkultivierung
Mit dem Erreichen einer Zelldichte von 70 % bis 80 % (Subkonfluenz) wurden Subkulturen der Zellen angelegt. Hierzu folgte nach Absaugen des Zellkulturmediums ein Waschschritt mit 37 °C warmer 1 x PBS. Anschließend wurden die Zellen mit Trypsin / EDTA (0,25 % / 0,02 %) benetzt und für 3 Minuten im Brutschrank inkubiert. Mit der folgenden Zugabe des jeweiligen Kulturmediums wurde die Trypsinaktivität durch das im Medium enthaltene FBS inhibiert und die Zellen durch behutsames Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Nach der
3 Material und Methoden
Zellzahlbestimmung (siehe 3.2.3) wurden nach Tabelle 3.2 die entsprechenden Zellzahlen in die jeweiligen Zellkulturgefäße umgesetzt:
Zelllinie Kulturgefäß Zellzahl Mediummenge [mL]
F9 75-cm2-Flasche 1,5 x 106 20
BALB/c-3T3 94 mm x 16 mm-Schale 1,0 x 106 10 ES-D3 60 mm x 15 mm-Schale 0,75 x 106 5
Tab. 3.2: Bedingungen zur Zellaussaat der F9-, BALB/c 3T3- und ES-D3-Zellen
Mit jeder Subkultivierung erhöhte sich die Passage der Kulturen. Die Zellen wurden bis zu der maximalen Passagezahl von 25 verwendet.
3.2.3 Zellzahlbestimmung
Zur Bestimmung der Zellzahl wurde nach erfolgter Trypsinierung der Zellen (siehe 3.2.2) ein Teil der Zellsuspension mit dem Diazofarbstoff Trypanblau (0,5 % w/v) im Verhältnis 1:1 vermischt. Von der Zelllösung wurde soviel zwischen einer Neubauer-Zählkammer und einem aufliegenden Deckglas pipettiert, bis die Kammer vollständig gefüllt war (etwa 20 µL). Das Trypanblau wird von Zellen mit beeinträchtigter Membranintegrität aufgenommen, lagert sich in die zelluläre DNA ein und bedingt eine Blaufärbung. Da Zellen mit intakter Membran diesen Farbstoff nicht aufnehmen, entspricht der Prozentsatz an ungefärbten Zellen dem Anteil vitaler Zellen.
Nach Auszählung von vier Großquadraten wurde der Mittelwert bestimmt und dieser mit 10.000 multipliziert. Die erhaltene Zellzahl wurde anschließend zur Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors verdoppelt, das Ergebnis ergab die Zellkonzentration pro Milliliter.
3.2.4 Kryokonservierung / Auftauen
Zur langfristigen Verwahrung wurden die Zellen nach Trypsinierung in ihrem entsprechenden Kulturmedium aufgenommen und ausgezählt. Anschließend erfolgten die Abzentrifugation der Zellen für 10 Minuten bei 170 x g, die Abnahme
3 Material und Methoden
des Mediumüberstandes und ein Resuspendieren des Zellpellets mit dem geeigneten, auf 4 °C vorgekühlten Kryomedium. Hierbei wurde eine Zellsuspension mit der Konzentration von 1 x 106 Zellen / mL hergestellt, wovon jeweils 1 mL in ein Kryoröhrchen überführt und bei einer Rate von -1 °C pro Minute bis zu einer Temperatur von -80 °C eingefroren wurde. Abschließend erfolgte die Umsetzung der Zellen in flüssigen Stickstoff.
F9-Kryomedium: 70 % DMEM / HAM´s F12 ohne L-Glutamin, 20 % FBS, 10 % DMSO
BALB/c-3T3-Kryomedium: 1 x DMEM mit L-Glutamin, 20 % FBS, 4 mM
L-Glutamin, 50 U/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin, 10 % DMSO
ES-D3-Kryomedium: 1 x DMEM mit L-Glutamin, 40 % FBS (Hyclone®), 2 mM L-Glutamin, 50 U/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin, 1 % nicht essentielle Aminosäuren (NEAA), 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 % DMSO
Um kryokonservierte Zellen aufzutauen wurde ein Kryoröhrchen mit darin enthaltener, gefrorener Zelllösung solange bei 37 °C im Wasserbad erwärmt, bis der Inhalt geschmolzen war. Anschließend wurden die Zellen in 9 mL Kulturmedium überführt und im Zentrifugenröhrchen für 5 Minuten bei 170 x g abzentrifugiert. Nach Entfernung des Mediumüberstandes wurden die BALB/c 3T3-Zellen in 10 mL ihres Kulturmediums resuspendiert und in eine 94 mm x 16 mm-Schale umgesetzt. Die F9-Zellen wurden nach Abzentrifugation mit 10 mL Medium in eine 25-cm2-Kulturflasche und bei den später folgenden Subkultivierungen in 75-cm2-Kulturflaschen ausgesät.
Vor dem Auftauen eingefrorener ES-D3 Zellen wurde zur Verbesserung der Zellanhaftung eine 60 mm x 15 mm-Zellkulturschale mit Gelatine beschichtet. Hierzu wurden 3 mL einer Gelatinelösung (0,1 % in 1 x PBS) in die Schale gegeben und für mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur ruhen gelassen. Danach wurde die
3 Material und Methoden
überschüssige Gelatine abgesaugt und die Schale mit 1 x PBS gewaschen. Nach Abzentrifugation der aufgetauten ES-D3-Zellen wurden diese in 5 mL ihres Kulturmediums resuspendiert und in die beschichtete Kulturschale überführt.
Anschließend erfolgte die Zugabe von 5 µL des mLIF (1000 U/mL) direkt zum Medium.
3.2.5 Überprüfung der Zellkulturen auf Mykoplasmenkontamination
Mykoplasmen sind zellwandlose Prokaryoten und die Kontamination von Zellkulturen mit ihnen stellt eines der Hauptprobleme in der Zellkulturtechnik da. Sie leben als kleinste bekannte Zellen intrazellulär und können negative Effekte auf den Stoffwechsel, das Wachstum und die Morphologie von betroffenen Zellen bedingen.
Da sie nicht ohne weiteres lichtmikroskopisch zu erkennen sind, wurden die kultivierten Zelllinien mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) regelmäßig auf eine Mykoplasmenkontamination hin überprüft.
Hierzu wurden 200 µL an Mediumüberstand, der 24 Stunden auf den Zellen inkubiert hatte, in ein 1,5 mL-Reaktionsgefäß gegeben und für 5 Minuten bei 13.000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 100 µL Aqua dest. gelöst und 3 Minuten lang bei 95 °C inkubiert. Anschließend erfolgte für 5 Minuten eine erneute Zentrifugation bei 13.000 x g, worauf 10 µL des erhaltenen Überstandes in einem neuen Reaktionsgefäß mit 15 µL des PCR-Mastermix (s.u.) vermischt wurden.
Zusammensetzung des PCR-Mastermix:
10 x Puffer 2,5 µL
Primer Fwd (25 µM) 0,625 µL Primer Rev (25 µM) 0,625 µL
dNTP (2 mM) 2,5 µL
Taq-Polymerase (5 U/µL) 0,7 µL
Aqua dest. 8,05 µL
Mycoplasmen FWD: 5`- GGG AGC AAA CAG GAT TAG ATA CCC - 3`
Mycoplasmen REV: 5`- TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC - 3`
Temperaturprogramm:
5 min 95 °C 1 x 30 sec 95 °C
30 sec 58 °C 35 x 30 sec 72 °C
3 Material und Methoden
Die DNA-Vervielfältigung erfolgte im Thermocycler nach einem genau definierten Temperaturprogramm.
Anschließend wurden die Proben über Nacht bei 4 °C gelagert. Für die Gelelektrophorese wurden 2 g Agarose und 2 µL Ethidiumbromidlösung in 100 mL 1 x TBE unter Erhitzung in einer Mikrowelle in Lösung gebracht. In die Taschen des hergestellten Agarosegels wurden 10 µL der Proben sowie ein Marker (100 Basenpaare), eine Positiv- und als Negativkontrolle der Mastermix gegeben. Die gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte bei einer Spannung von 100 Volt für zwei Stunden, die Auswertung des Agarosegels unter ultraviolettem Licht.