Abb. 3.7: Kombination von Kulturüberstand der Leberzellen und EST am Tag 5
Tag 10 des ESTs:
Die Auswertung der MTT-Assays und die Untersuchung auf Hemmung der Stammzelldifferenzierung erfolgten wie unter 3.6.1 und 3.6.2 beschrieben.
3.8 Chemisch-analytische Erfassung von Valproinsäure (VPA), Valpromid (VPD) und Cyclophosphamid (CPA)
Die qualitative und quantitative Erfassung von VPA, VPD und CPA im Zellkulturmedium erfolgte maßgeblich durch Dr. Stefan Lunkenbein und Dr. Marcos Fernandes des Instituts für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik (Leitung:
Prof. Dr. Pablo Steinberg) der TiHo Hannover.
∑ 27.122,2 µL
1 EB pro Well einer 24-Well-Platte
MTT ES-D3-Zellen MTT BALB/c-3T3-Zellen 3 x 200 µL
3 x 200 µL
3 Material und Methoden
Dabei wurden Derivatisierungsmethoden sowie die an ein Massenspektrometer gekoppelte Gaschromatographie (GC-MS) angewendet. Die Derivatisierung des Analyten ist in der Gaschromatographie eine übliche Strategie zur Verbesserung seiner Flüchtigkeit, zur Erhöhung seiner thermischen Stabilität oder auch zur Erniedrigung der Nachweisgrenze. Die Identifikation der Substanzen erfolgte unter Berücksichtigung ihrer Retentionszeiten. Zur quantitativen Bestimmung wurde die jeweilige Peakfläche der entsprechenden Substanz herangezogen. Die Zugabe einer definierten Konzentration des internen Standards (I.S.) diente dabei als Bezugsgröße.
3.8.1 Herstellung der Stammlösungen
Folgende Stammlösungen wurden von den Testsubstanzen und den als interne Standards verwendeten Stoffen in 100 mM Dinatriumhydrogenphosphat (wasserfrei;
pH 7,4) angesetzt:
VPA 102,4 mg / 10 mL
VPD 100,8 mg / 50 mL Lagerung bei 4 °C
3-Ethylpentansäure (I.S.) 94,4 mg / 10 mL
CPA 100 mg / 10 mL Lagerung bei -30 °C
Ifosfamid (I.S.) 10 mg / 10 mL Lagerung bei -30 °C
Die aus diesen Stammlösungen jeweils angefertigten Arbeitslösungen wurden am Tag ihres Gebrauchs frisch hergestellt.
3.8.2 Extraktion, Derivatisierung und Analyse von VPD und VPA
In ein 2 mL-Reaktionsgefäß wurden 200 µL der zu untersuchenden Probe sowie 10 µL des I.S. (100 µg / mL 3-Ethylpentansäure) und 200 µL einer Pufferlösung (500 mM Natriumdihydrogenphosphat, pH 5,0) gegeben. Zur Extraktion des Analyten wurden außerdem 1 mL Ethylacetat hinzugefügt, der Ansatz im Schüttler bei
3 Material und Methoden
Raumtemperatur für 15 Minuten vermischt und anschließend für fünf Minuten bei 4 °C und 20.000 x g abzentrifugiert. Nach vollständiger Phasentrennung wurden von der oberen organischen Phase 875 µL in ein 2 mL-Glasfläschchen überführt und die Extraktionsprozedur nach Zugabe von 900 µL Ethylacetat wiederholt. Nach Zusammenführung beider organischer Phasen wurden 100 µL Acetonitril ergänzt und die Probe bei 40 °C unter einem Stickstoffstrom bis zu einer Menge von 50 – 100 µL eingeengt. Nach Zugabe von 25 µL Pyridin und 50 µL des Derivatisierungsreagenz N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)Trifluoroacetamide (MSTFA) erfolgte auf einem Thermoschüttler (1400 rpm) bei einer Temperatur von 60 °C die Derivatisierung.
Anschließend wurde 1 µL der Probe über den Injektor im splitless-Modus in das GC-MS-System injiziert. Die Temperatur des Injektorports war 200 °C, die Fließgeschwindigkeit des Trägergases Helium betrug konstante 0,2 mL / min. Das verwendete Temperaturprogramm gab für den GC-Ofenraum eine Starttemperatur von 90 °C für vier Minuten, einen Anstieg von 20 °C / min bis 150 °C (gehalten für drei Minuten), sowie einen erneuten Temperaturanstieg von 60 °C / min bis 230 °C (gehalten für sechs Minuten) vor. Die Retentionszeiten t lagen für 3-Ethylpentansäure bei 6,83 Minuten, für VPA bei 7,24 Minuten und für VPD bei 9,28 Minuten (Abb. 3.8).
B
C
A
6,83
9,28 7,24
Abb. 3.8: Ionen-Chromatogramm eines GC/MS-Laufes
Darstellung quantifizierbarer Peaks der 3-Ethylpentansäure (A), von VPA (B) und VPD (C).
3 Material und Methoden
Das Massenspektrometer führte eine Elektronenstoßreaktion (electron impact, EI) mit einer kinetischen Energie von 70 eV aus. Für das selektive Ionen-Monitoring waren die Massen von m/z 187,1 (Target-Ion)/ 173,2 / 132,2 und 117,2 für 3-Ethylpentansäure, m/z 201,1 (Target-Ion) / 174,0 / 145,2 und 117,2 für VPA und m/z 200,1 (Target-Ion) / 173,2 / 144,2 und 116,2 für VPD maßgeblich.
Die beschriebene Probenvorbereitung und das analytische Verfahren sind eine modifizierte Ausführung in Anlehnung an eine publizierte Arbeit (NAU et al. 1981 b).
3.8.3 Extraktion, Derivatisierung und Analyse von CPA
In ein 2 mL-Reaktionsgefäß wurden 200 µL der zu untersuchenden Probe sowie 10 µL des I.S. (100 µg / mL Ifosfamid) und 100 µL Natriumhydroxid (0,6 M in Aqua dest.) gegeben. Nach Zugabe von 600 µL Ethylacetat und Schütteln der Probe für 5 Minuten bei Raumtemperatur folgte eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 22 °C und 1600 x g. Danach wurden 500 µL der organischen Phase in ein 2 mL-Glasfläschchen überführt und die Extraktion erneut durchgeführt. Die organischen Phasen wurden vereint und unter einem Stickstoffstrom bei 40 °C bis zur Trockene eingeengt.
Zwecks Derivatisierung wurden 100 µL Ethylacetat und 50 µL Trifluoressigsäureanhydrid (TFAA) hinzugefügt und der Ansatz auf einem Schüttler bei 1400 rpm und 70 °C für 20 Minuten inkubiert. Unter Stickstoff wurden bei 40 °C das Lösungsmittel und die Restmenge TFAA verdampft.
Für die GC-Analyse wurde die Probe in 200 µL Ethylacetat für 3 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde 1 µL der Probe über den Injektor im splitless-Modus in das GC-MS-System injiziert. Der Injektorport war auf 200 °C temperiert und das Trägergas Helium hatte eine Fließgeschwindigkeit von konstanten 0,8 mL / min. Das GC-MS-Temperaturprogramm heizte den Ofenraum auf 100 °C (Starttemperatur für eine Minute) und nachfolgend unter einem Temperaturanstieg von 60 °C / min bis auf 250 °C (gehalten für 8 Minuten). Die Retentionszeiten lagen für Ifosfamid bei 5,46 Minuten und für CPA bei 5,87 Minuten (Abb. 3.9). Das Massenspektrometer führte die Ionisierungen im EI-Modus bei einer kinetischen Energie von 70 eV aus. Für das selektive Ionen-Monitoring von Ifosfamid
3 Material und Methoden
und CPA waren die Massen von m/z 307 (Target-Ion) und m/z 309 (Qualifier-Ion) entscheidend.
Ion 307,00
5,46 5,46
5,87
5,87 Ion 309,00
A
B
Abb. 3.9: Ionen-Chromatogramme (Ion 307 und 309) eines GC/MS-Laufes Darstellung quantifizierbarer Peaks von Ifosfamid (A) und CPA (B).
Die beschriebene Probenbehandlung und analytische Methodik wurde in Anlehnung an eine bereits veröffentlichte Arbeit durchgeführt (SESSINK et al. 1993).
3.8.4 Validierung der Quantifizierungen von VPD, VPA und CPA
Bei der Überprüfung zur Linearität der Detektion von VPD, VPA und CPA waren jeweils Korrelationswerte (r2) um 0,99 vorzufinden (Tab. 3.5).
Zur Bestimmung der entsprechenden Nachweis- (limit of detektion, LOD) und Bestimmungsgrenze (limit of quantification, LOQ) wurden wiederholt Analysen von bekannten, minimalen Konzentrationen durchgeführt (Tab. 3.5). Die Berechnung
3 Material und Methoden
erfolgte unter Berücksichtigung der spezifischen Signal-Rausch-Verhältnisse (signal-noise-ratio, S/N ratio).
CPA VPD VPA
r2 ± s 0,9997 ± 0,0002 0,9989 ± 0,0004 0,9982 ± 0,0009
LOD [ng / mL] 2,5 4,0 1,0
LOQ [ng / mL] 4,0 8,0 3,0
Die Variation in den Retentionszeiten von 3-Ethylpentansäure, Ifosfamid, CPA und VPA lagen unter 0,1 %, für VPD annähernd bei 0,2 %.
Die Wiederfindungsraten der jeweiligen Substanz sind Tabelle 3.6 zu entnehmen.
Wiederfindung [%]
Konzentration [µg / mL] CPA VPD VPA
0,8 - 98,1 ± 2,9 99,9 ± 2,0
8 94,4 ± 2,6 115,9 ± 2,9 100,9 ± 1,0 30 105,6 ± 1,8 111,1 ± 2,6 104,6 ± 1,0 70 97,3 ± 3,7 106,0 ± 8,4 96,8 ± 1,0