Ermittlung der maximalen Inkubationsdauer

relative Viabilität [%]

Abb. 4.22: Der Einsatz des Stammzellmediums im MTT-Assay mit BALB/c-3T3-Zellen Im Vergleich zur DMSO-Kontrolle ist mit dem Stammzellmedium eine nicht signifikante Erhöhung der Zell-Viabilität auf 109 % und bei der Inkubation mit 0,29 µg / mL 5-FU eine signifikante Reduktion der Lebensrate auf 37,7 % festzustellen.

Mw ± s; n = 3; n.s. = nicht signifikant; *p < 0,05; ANOVA mit anschließendem Scheffé-Test.

4.4.2 Ermittlung der maximalen Inkubationsdauer

Nach einer Kultivierung der primären Hepatozyten im 1-%-Medium ohne Testsubstanz über sechs, sieben und acht Stunden wurde unter bereits beschriebener Mediumsupplementierung (Kapitel 3.6) der Überstand im EST von Tag 0 bis Tag 10 eingesetzt. Abbildung 4.23 zeigt, dass sich nach sechsstündiger Inkubation die Stammzelldifferenzierung in 96 % der Fälle vollzieht und damit deutlich über dem kritischen Wert eines noch validen Befundes von 87,5 % liegt. Die Verwendung eines für sieben bzw. acht Stunden inkubierten Überstandes im EST führte zu den nicht validen Differenzierungsraten von 82 % bzw. 3 %. Die für 12, 18 und 24 Stunden inkubierten Leberzellkulturüberstände wurden im EST von Tag 3 bis Tag 10 getestet. Die zugehörigen relativen EB-Differenzierungen zu schlagenden Herzmuskelzellen betrugen 89, 76 und 51 %.

4 Ergebnisse

0 25 50 75 100

4 8 12 16 20 24

relative D3-Differenzierung [%]

Inkubation [h]

Abb. 4.23: Relative Stammzelldifferenzierung im vorinkubierten Medium

Nach einer Inkubation des 1-%-Mediums mit primären Leberzellen der Maus über sechs, sieben und acht Stunden erfolgte nach Supplementierung seine Testung im Differenzierungsassay des ESTs von Tag 0 bis Tag 10. Nach einer Inkubation von 12, 16 und 24 Stunden wurde der Kulturüberstand von Tag 3 bis Tag 10 im EST verwendet. Pro getesteter Inkubationszeit sind die Mittelwerte von drei Assays angegeben, die jeweils mit dem Kulturüberstand aus drei verschiedenen Leberzellisolierungen durchgeführt worden sind. Die gestrichelte Linie kennzeichnet den kritischen prozentualen Wert der Stammzelldifferenzierung für die Mediumkontrolle (87,5 %).

Mw ± s; n = 3; : Mediumeinsatz von Tag 0 bis Tag 10 im EST, ▲: Mediumeinsatz von Tag 3 bis Tag 10 im EST.

Alle mit dem inkubierten Kulturüberstand durchgeführten MTT-Tests wiesen am Tag 10 des ESTs umfangreiche Kontaminationen auf, so dass ihre Auswertung nicht möglich war. Da dieses wiederholt beobachtet wurde, musste der Schwerpunkt der folgenden Untersuchungen zur Testung der inkubierten Testsubstanzen im EST auf der Kardiomyozyten-Differenzierung der Stammzellen liegen.

4.4.3 Effekte auf die Stammzelldifferenzierung und metabolische Umsetzung des CPA nach Inkubation mit primären Leberzellen der Maus

Die höchste Konzentration an CPA, die im Vorfeld im EST ohne metabolische Aktivierung eingesetzt wurde, betrug 1000 µg / mL. Eine sechsstündige Inkubation der primären Hepatozyten mit dieser Dosis führte zu einer erheblichen

4 Ergebnisse

Zellschädigung unter Ausbildung einer sich abkugelnden Morphologie, Granulierung und Ablösung der Zellen. In weiteren Vorversuchen wirkte sich auch die Konzentration von 500 µg / mL CPA vergleichbar negativ auf die Leberzellkultur aus (Abb. 4.24 B).

Abb. 4.24: Effekte von 30 und 500 µg / mL CPA auf die Maus-Leberzellkultur

Nach sechsstündiger Inkubation von primären Leberzellen der Maus mit 30 µg / mL CPA (A) liegt eine typische, intakte Kulturmorphologie vor. Mit 500 µg / mL CPA (B) runden sich die Zellen ab und Zellgranulierung, die Rückbildung von Gallenkanalikuli und der Verlust von Zell-Zell-Kontakten sind zu beobachten. Vergrößerung: 200 x.

Für die sechsstündige Inkubation von CPA mit den Leberzellen wurde schließlich die Konzentrationsreihe 0,3, 1, 3, 10 und die maximale Konzentration von 30 µg / mL verwendet. Nach einer entsprechenden Inkubation wurde bei keiner der verwendeten Dosierungen ein schädigender Effekt auf die Hepatozyten beobachtet. Abbildung 4.24 A zeigt eine typische, intakte Lebezellkultur nach sechs Stunden Inkubation mit 30 µg / mL CPA.

Auf Grund der durchgeführten Supplementierung vor der Verwendung des Überstandes im Differenzierungsassay (Kapitel 3.6) war für die Erstellung der Dosis-Wirkungskurve ein Verdünnungsfaktor von 18 % zu berücksichtigen. In Abbildung 4.25 zeigt die linke Kurve die erhaltenen Differenzierungsraten nach einer Testung des CPA, welches mit den Hepatozyten für sechs Stunden inkubiert worden war.

B

A

4 Ergebnisse

Abb. 4.25: Der Effekt von CPA auf die D3-Differenzierung ohne Inkubation und nach 6stündiger Inkubation mit murinen Hepatozyten

CPA wurde direkt und nach einer Inkubation von sechs Stunden mit murinen Hepatozyten im Differenzierungsassay des ESTs eingesetzt. Die Substanzexposition im Assay fand von Tag 0 bis Tag 10 statt.

Mw ± s; Dosis-Wirkungskurve ohne Inkubation des CPA: n = 3; Dosis-Wirkungskurve mit inkubiertem CPA: 25 µg / mL: n = 3; 0,3 / 0,9 und 8,5 µg / mL: n = 4; 2,6 µg / mL: n = 8.

: D3-Differenzierung mit inkubiertem CPA, : D3-Differenzierung ohne CPA-Inkubation.

Abb. 4.26: Der Effekt von CPA auf die D3-Differenzierung ohne Inkubation und nach 12stündiger Inkubation mit murinen Hepatozyten

CPA wurde für zwölf Stunden mit murinen Hepatozyten inkubiert und anschließend im Differenzierungsassay des ESTs von Tag 3 bis Tag 10 eingesetzt. Des Weiteren ist die Dosis-Wirkungskurve, erhalten aus der Verwendung von nicht metabolisiertem CPA von Tag 0 bis Tag 10 im Differenzierungsassay, dargestellt.

Mw ± s. Dosis-Wirkungskurve ohne Inkubation des CPA: n = 3. Dosis-Wirkungskurve mit inkubiertem CPA: 8,5 µg / mL: n = 6; 0,9 / 2,6 / 25 und 85 µg / mL: n = 3.

: D3-Differenzierung mit inkubiertem CPA. : D3-Differenzierung ohne Inkubation des CPA bei Substanzexposition im Differenzierungsassay von Tag 0 bis Tag 10.

4 Ergebnisse

Die jeweiligen Prozentwerte erfolgter Herzmuskelzellbildung belaufen sich auf 102, 91, 92, 18 und 0 %. Die daraus ermittelte ID50-Konzentration beträgt 5 µg / mL (0,018 mM) und liegt damit um den Faktor 70 niedriger als der ID50-Wert von 350 µg / mL bei Verwendung von nicht-inkubiertem CPA (rechte Kurve).

Zur Testung von metabolisiertem CPA im Differenzierungsassay von Tag 3 bis Tag 10 wurde die Substanz in den Konzentrationen 1, 3, 10, 30 und 100 µg / mL mit primären Hepatozyten der Maus über zwölf Stunden inkubiert. Keine dieser CPA-Konzentrationen verursachte in Vorversuchen Zellschädigungen oder führte zu morphologischen Veränderungen in den Leberzellen.

Unter Beachtung der anschließenden Supplementierung des Hepatozytenüberstandes vor seiner Verwendung im Assay (Verdünnungsfaktor 18 %) ergab sich die in Abbildung 4.26 auf der linken Seite gezeigte Dosis-Wirkungskurve mit einer ID50-Konzentration von 7 µg / mL (0,025 mM). Dieser Wert liegt um den Faktor 50 niedriger als der ID50-Wert von 350 µg / mL, erhalten bei der Testung des nicht metabolisierten CPA im Differenzierungsassay über den Zeitraum von Tag 0 bis Tag 10.

Die entsprechenden Anteile der metabolisierten Fraktionen von CPA unter Verwendung der genannten Konzentrationen von 0,3 bis 30 µg / mL betrugen 0,2, 0,53, 1,43, 5,23 und 9,14 µg / mL (Abb. 4.27). Der jeweilige Anteil an metabolisiertem CPA nach zwölfstündiger Inkubation der genannten Konzentrationen betrug 0,77, 2,33, 7,21, 21,72 und 40,18 µg / mL (Abb. 4.27). Der direkte Vergleich der metabolisierten CPA-Anteile nach sechs- und zwölfstündiger Inkubation zeigt, dass bei Gebrauch der Konzentrationen von 1, 3 und 10 µg / mL CPA keine signifikanten Unterschiede in der metabolischen Aktivierung vorliegen, mit 30 µg / mL CPA aber eine höchst signifikante Differenz im CPA-Umsatz zu ermitteln ist.

4 Ergebnisse

0,1 1,0 10,0 100,0

0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0

zur Leberzellkultur gegebene CPA-Konzentration [µg/mL]

metabolisierte Fraktion von CPA [µg/mL]

12 Std. Inkubation; r² = 0,9883

n.s.

n.s.

n.s.

***

6 Std. Inkubation; r² = 0,9916

Abb. 4.27: Die metabolische Umsetzung von CPA

Nach zwölfstündiger Inkubation der CPA-Konzentrationen von 1, 3 und 10 µg / mL mit primären Leberzellen der Maus wird eine jeweils größere Fraktion von CPA metabolisch umgesetzt als nach sechs Stunden. Während diese Unterschiede sich nicht signifikant unterscheiden ist die metabolische Umsetzung nach der Inkubation von 30 µg / mL CPA signifikant erhöht.

Median mit Variationsbreite; zwölfstündige Inkubation: 8,5 µg / mL: n = 6; 0,9 / 2,6 / 25 und 85 µg / mL: n = 3; sechsstündige Inkubation: 25 µg / mL: n = 3; 0,3 / 0,9 und 8,5 µg / mL:

n = 4; 2,6 µg / mL: n = 8; n.s. = nicht signifikant; ***p < 0,001; H-Test mit anschließendem Dunn´s-Test.

Unterschiedliche CPA-Konzentrationen bedingten nach den Inkubationen mit murinen Hepatozyten und ihrer anschließenden Verwendung im Differenzierungsassay Veränderungen in der Morphologie der ES-D3-Zellen am Tag 10 des Assays (Abb. 4.28).

Nach der sechsstündigen Inkubation von 3 µg / mL CPA waren auf Grund einer hohen Proliferationsrate der Stammzellen ein ausgebreiteter Zellrasen (Abb. 4.28 A) sowie Areale mit stark kontrahierenden Myokardzellverbänden zu erkennen. Mit dem Einsatz von inkubierten 10 µg / mL CPA waren eine deutliche Reduzierung der Zellproliferation, damit ein vermindert ausgebreiteter Zellrasen (Abb. 4.28 B) sowie eine nachlassende Intensität in den Herzmuskelkontraktionen auffällig. Die

4 Ergebnisse

Verwendungen von 30 oder auch 100 µg / mL (zwölfstündige Inkubation) bewirkten, dass bei den am Tag 5 des Assays umgesetzten embryonalen Aggregaten am Tag 10 keine Abflachung und auch keine nennenswerte Zellproliferation erkennbar waren (Abb. 4.28 C, D), kontrahierende Areale wurden nicht ausgebildet. Die beschriebenen Morphologieausprägungen (Abb. 4.28 A, B, C) waren auch nach einer zwölfstündigen Inkubation der CPA-Konzentationen von 3, 10 und 30 µg / mL gleichermaßen zu beobachten.

Abb. 4.28: Die ES-Kulturmorphologie am Tag 10 des Differenzierungsassays unter Verwendung von metabolisiertem CPA

Nach sechsstündiger Inkubation der CPA-Konzentrationen von 3 µg / mL (A), 10 µg / mL (B), 30 µg / mL (C) und nach zwölfstündiger Inkubation von 100 µg /mL CPA (D) mit primären Leberzellen der Maus und der anschließenden Verwendung des metabolisierten CPAs im Differenzierungsassay ergaben sich Unterschiede in den ES-Kulturmorphologien am Tag 10 des Assays. Neben starker Proliferation unter Ausbildung eines ausgeprägten Zellrasens (A) waren ein vermindertes Zellwachstum bei nur kleiner Zellherdbildung (B) sowie keine Abflachung der EBs und eine ausbleibende Zellausbreitung in die Peripherie (C, D) erkennbar. Vergrößerung: 200 x.

A B

C D

4 Ergebnisse

4.4.4 Effekte auf die Stammzelldifferenzierung und metabolische Umsetzung