Zur Kombination der Hepatozyten mit dem EST wurden die Testsubstanzen CPA und VPD in unterschiedlichen Konzentrationen in einer rationierten Komposition des ES-D3-Kulturmediums, dem 1-%-Medium, gelöst und mit dem Ziel einer metabolischen Umsetzung mit den Leberzellen inkubiert.
1-%-Medium: 1 x DMEM mit L-Glutamin, 1 % FBS (Hyclone®), 2,36 mM, L-Glutamin, 59 U/mL Penicillin, 59 µg/mL Streptomycin
Der Kulturüberstand wurde gesammelt und bis zur Verwendung im EST und seiner analytischen Untersuchung bei -20 °C gelagert.
Die Substanzmetabolisierung wurde mit dem 1-%-Medium über einen Zeitraum von sechs bzw. zwölf Stunden durchgeführt. Damit ergab sich für die Nutzung der Leberzellkultur über drei Tage folgender zeitliche Rahmen (Abb. 3.4):
Tag 1: Isolierung, Aussaat und Kultivierung der Hepatozyten;
Tag 2: a) Inkubation von jeweils sechs Stunden des im 1-%-Medium gelösten Lösungsmittels und der niedrigsten zu testenden Substanzkonzentration mit anschließender Kultivierung über Nacht;
b) Inkubation von jeweils zwölf Stunden des im 1-%-Medium gelösten Lösungsmittels und der niedrigsten zu testenden Substanzkonzentration;
Tag 3: a) Inkubation von jeweils sechs Stunden der im 1-%-Medium gelösten zweithöchsten und höchsten zu testenden Substanzkonzentration;
b) Inkubation von jeweils zwölf Stunden der im 1-%-Medium gelösten zweithöchsten und höchsten zu testenden Substanzkonzentration;
3 Material und Methoden
Abb. 3.4: Nutzung der Hepatozytenkultur
Nach der Isolierung der Leberzellen an Tag 1 wurden das Lösungsmittel, in dem die Testsubstanzen gelöst wurden (0,1 % DMSO), und die Substanzen mit den Zellen inkubiert.
Die Inkubationsdauer lag dabei entweder bei sechs Stunden (für die Testung des Überstandes im EST über dessen gesamte Dauer von zehn Tagen) oder bei zwölf Stunden (Testung im EST von Tag 3 bis Tag 10).
Jede Leber-Isolierung ergab eine ausreichende Anzahl an Hepatozyten zur Durchführung des ESTs. Dafür waren mindestens 35 mL Kulturüberstand nötig.
Deshalb wurden die Hepatozyten an Tag 1 in 13 kollagenisierte 60 mm x 15 mm-Zellkulturschalen mit einer Zellzahl von 3 x 106 in 3 mL Medium ausgesät (siehe 3.3.2).
Am Tag 2 wurde im 1-%-Medium das Lösungsmittel der Testsubstanzen (DMSO) in seiner verwendeten Konzentration gelöst. Nach einmaligem Waschen der Leberzellen mit warmer (37 °C) 1 x PBS wurden pro Schale 3 mL dieser DMSO-Kontrolle gegeben und die Zellen für sechs bzw. zwölf Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde der Überstand in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen überführt, das restliche Medium mit einer Pasteurpipette abgesaugt, die Zellen mit warmer 1 x PBS gewaschen und pro Schale 3 mL der in 1-%-Medium gelösten niedrigsten Substanzkonzentration gegeben. Außerdem wurden von dieser angesetzten Lösung auch noch 3 mL in eine Kulturschale ohne Zellen gegeben (Inkubationskontrolle) und etwa 1 mL zur analytischen Bestimmung bei -20 °C eingefroren. Während der Inkubation wurde der gesammelte DMSO-Überstand bei 2500 x g für 10 Minuten abzentrifugiert und in 4 mL-, 6 mL- und 23 mL-Aliquots
3 Material und Methoden
(sechs Stunden Inkubation) bzw. nur in 6 mL- und 23 mL-Aliquots (zwölf Stunden Inkubation) bei -20 °C gelagert. Nach der Inkubation wurden der Zellkulturüberstand und die Inkubationskontrolle jeweils in ein Zentrifugenröhrchen gegeben, das Restmedium in den Schalen abgesaugt, die Zellen gewaschen und, wenn die Substanzen für sechs Stunden inkubiert wurden, über Nacht mit 3 mL Kulturmedium kultiviert. Das gesammelte Medium wurde bei 2500 x g für 10 Minuten abzentrifugiert. Es folgten das Einfrieren von 1 mL des Kulturüberstandes für die Analytik und die bereits beschriebene Aliquotierung von 4 mL, 6 mL und 23 mL (sechs Stunden Inkubation) sowie 6 mL und 23 mL (zwölf Stunden Inkubation) mit anschließender Lagerung bei -20 °C.
Am folgenden Tag wurde mit den beiden höheren Substanzkonzentrationen entsprechend verfahren.
Tag 0 des ESTs:
Die für zwölf Stunden inkubierten Substanzen wurden im EST von Tag 3 bis Tag 10 eingesetzt. Daher wurden am Tag 0 die hängenden Tropfen mit ES-D3-Stammzellmedium (ohne mLIF) angesetzt (3.6.2).
Zur Testung der für sechs Stunden inkubierten Substanzen wurden die 4 mL-Aliquots aufgetaut und mit den noch fehlenden Mengen an Inhaltsstoffen supplementiert, damit die Konzentrationen aller Medium-Bestandteile denen des ES-D3-Kulturmediums entsprachen (Abb. 3.5).
Anschließend wurden die MTT- und Differenzierungsassays nach schon beschriebenem Prinzip angesetzt (3.6.1 bzw. 3.6.2), wobei sich für den MTT-Assay Abweichungen vom Protokoll ergaben. Anders als unter 3.6.1 erwähnt kann bei Verwendung von inkubiertem Mediumüberstand im MTT für die beiden Zelllinien BALB/c-3T3 und ES-D3 nur eine Mediumkomposition, nämlich die des ES-D3-Mediums, verwendet werden. Somit war das Medium der Blanks und Kontrollen bei beiden Zelltypen das ES-D3-Kulturmedium. Außerdem erfolgte keine Sechs- sondern eine Dreifachbestimmung aller Werte, basierend auf dem begrenzt zur Verfügung stehenden Mediumüberstand der Leberzellkultur.
3 Material und Methoden
Die MTT-Assays und Hanging-Drop-Kulturen wurden für drei Tage im Brutschrank inkubiert.
Aliquot 4 mL
+ 14 % FBS (Hyclone®) 660 µL
+ 1 % NEAA 47,2 µL
+ 0,1 mM 2-Mercaptoethanol 9,43 µL
Abb. 3.5: Kombination von Kulturüberstand der Leberzellen und EST am Tag 0
Tag 3 des ESTs:
Am Tag 3 des ESTs wurden die 6 mL-Aliquots aufgetaut und gemäß Abbildung 3.6 supplementiert.
Aliquot 6 mL
+ 14 % FBS (Hyclone®) 991 µL
+ 1 % NEAA 70,8 µL
+ 0,1 mM 2-Mercaptoethanol 14,15 µL
Abb. 3.6: Kombination von Kulturüberstand der Leberzellen und EST am Tag 3 ∑ 4716,63 µL
MTT ES-D3-Zellen MTT BALB/c-3T3-Zellen 3 x 200 µL
3 x 200 µL Hanging-Drop-Kultur der ES-D3-Zellen
∑ 7075,95 µL 5 mL
Deckel der Hanging-Drop-Kultur
EBs in 60 mm x 15 mm-Schale
MTT ES-D3-Zellen MTT BALB/c-3T3-Zellen 3 x 200 µL
3 x 200 µL
3 Material und Methoden
Anschließend erfolgte bei den MTT-Assays der Mediumwechsel (200 µL pro Well) und beim Differenzierungsassay wurden die hängenden Tropfen mit 5 mL Medium abgewaschen zwecks Überführung der EBs in bakterielle 60 mm x 15 mm-Schalen.
Es folgte eine Inkubation im Brutschrank für zwei Tage.
Tag 5 des ESTs:
Nach dem Auftauen und Supplementieren (Abb. 3.7) der 23 mL-Aliquots wurde pro Kontrolle und Substanzkonzentration eine 24-Well-Platte bereitgestellt und jeweils 1 mL pro Well pipettiert. Anschließend wurden die EBs umgesetzt (siehe 3.6.2) und das Medium der MTT-Platten (200 µL / Well) gewechselt.
Aliquot 23 mL
+ 14 % FBS (Hyclone®) 3.797 µL
+ 1 % NEAA 271 µL
+ 0,1 mM 2-Mercaptoethanol 54,2 µL
Abb. 3.7: Kombination von Kulturüberstand der Leberzellen und EST am Tag 5
Tag 10 des ESTs:
Die Auswertung der MTT-Assays und die Untersuchung auf Hemmung der Stammzelldifferenzierung erfolgten wie unter 3.6.1 und 3.6.2 beschrieben.
3.8 Chemisch-analytische Erfassung von Valproinsäure (VPA), Valpromid