Stabilität von AuNP-Konjugaten

Theoretische Grundlagen und Forschungshintergrund zu Kapitel 2 91 Grundlage für das Studium von PEG-Hüllen auf Nanomaterialien dar, um die offenen Fragen zu klären und Parameter zu studieren, die mit der Charakterisierung und Anwendung von PEGylierten AuNP bzw. NP verbunden sind. Zu diesen Fragen gehören die Wechselwirkun-gen von PEG mit anderen Liganden, das Verhalten von PEGylierten AuNP in vivo, z.B. die aktuelle Diskussion um die Immunogenizität von PEG,¹⁹⁸ die Frage der geeigneten Konformation (mushroom- oder brush-) für eine hohe Repulsivität gegenüber Proteinen in vivo, nach wie vor aber auch die Stabilität der PEGylierten Partikel. Im folgenden Abschnitt wird die Stabilität von AuNP-Konjugaten behandelt, insbesondere um den Begriff der Stabilität zu differenzieren.

für eine zumindest teilweise Reinigung von AuNP-Proben genutzt werden, indem große koaleszierte Partikel oder Aggregate als Sedimente vorsichtig abgetrennt werden.

Aufgrund der plasmonischen Eigenschaften von AuNP können alle Formen ihrer De-stabilisierung einfach und hochempfindlich spektroskopisch verfolgt werden und im Bereich des Biosensing mit AuNP stellen kolorimetrische Assays neben Fluoreszenz-, SPR- und RI-basierten Assays einen enorm bedeutenden Teilbereich dar.²⁰¹ Diese Assays nutzen die Aggregation von AuNP, und die empfindliche Detektion von Krebszellen,²⁰² Enzym-aktivität,²⁰³ DNA-Sequenzen²⁰⁴ kleinen organischen Molekülen²⁰⁵ und Schwermetallionen²⁰⁶ sind nur einige Beispiele für die vielfältigen Anwendungen solcher Aggregations-basierten Assays. Auch Schwangerschaftstest, als Beispiel für sogenannte Lateral Flow Immunoassays, und andere Schnelltests, z.B. auf bestimmte Bakterien, sind mit AuNP realisierbar und auf dem Markt.²⁰⁷

2.2.4.2 Ursachen für Agglomeration und Aggregation

Da AuNP, wie alle NP, aus thermodynamischen Gründen eine Tendenz haben zu aggre-gieren und koaleszieren, müssen sie durch Liganden stabilisiert werden, die diese Aggregation verhindern. Diese Stabilisierung kann elektrostatisch sein, wie bei Citratliganden, oder auf sterischer Hinderung beruhen, wie bei Polymerliganden. Es sind daher mehrere Ursachen für eine Agglomeration oder Aggregation von AuNP denkbar.

Eine Ursache ist die Entfernung gebundener Liganden, z.B. thermisch, durch Änderung des Lösungsmittels, durch Verdünnung oder pH-Wert-Änderung und damit verbundener Ver-schiebung des on/off Gleichgewichts (vgl. Abb. 2.5) oder durch kompetitiven Austausch mit Spezies, die die AuNP nicht stabilisieren. Eine weitere Ursache ist die Beeinflussung des Sta-bilisierungsmechanismus, z.B. kann elektrostatische Stabilisierung durch Salzzugabe unwirk-sam werden, weil Ladungen mit steigender Ionenstärke zunehmend abgeschirmt werden.⁴³ Sterische Stabilisierung kann durch Austausch des Lösungsmittels unwirksam werden, weil in einem schlechten Lösungsmittel (für den Liganden) die Ligand-Ligand Wechselwirkungen auch interpartikulär attraktiv werden verbunden mit dem Kollabieren der Ligandenhülle aus demselben Grund (Minimierung der Ligand-Solvens-Wechselwirkungen).^43,193 Schließlich können eine Ursache für Agglomeration und Aggregation auch Wechselwirkungen der Liganden bzw. Ligandenhüllen sein, teilweise vermittelt durch verbrückende Moleküle. Diese Wechselwirkungen können alle möglichen physikalischen und chemischen Wechselwirkungen von Molekülen umfassen: Dispersionswechselwirkungen, elektrostatische Wechselwirkungen und alle Formen von kovalenten und nicht-kovalenten Bindungen. Solche

Theoretische Grundlagen und Forschungshintergrund zu Kapitel 2 93 Wechselwirkungen sind die Grundlage für die meisten kolorimetrischen Assays, aber z.B.

auch für das bedeutende Forschungsgebiet der kontrollierten Anordnung von NP.^208–211 Für AuNP-Konjugate in biologischen und medizinischen Anwendungen sind insbeson-dere die Stabilität in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen und die gegen kompetitiven Ligandenaustausch von Bedeutung, denn biologische Puffer und Blut weisen hohe Konzen-trationen von Salzen auf und Blut enthält eine Vielzahl von Molekülen mit funktionellen Gruppen die an AuNP binden können, einschließlich Thiol-Gruppen wie z.B. in Cystein und Glutathion.

Die Stabilität in Lösungen mit hoher Ionenstärke kann einfach und direkt durch Salzzu-gabe getestet werden, die Stabilität gegen kompetitiven Ligandenaustausch kann mit kleinen Thiolen getestet werden. Zu letzterem Zweck eignet sich besonders DL-Dithiothreitol (DTT), weil es als kleines Molekül die Ligandenhülle gut durchdringen kann und als Dithiol stark an die AuNP-Oberfläche bindet. DTT stabilisiert AuNP nicht, daher aggregieren diese, nachdem ein kritischer Teil der Ligandenhülle durch DTT ersetzt wurde. Die Verfolgung DTT indu-zierter Aggregation von AuNP mittels zeitaufgelöster UV/vis-Spektroskopie wurde bereits in mehreren Studien genutzt, um Ligandenhüllen zu charakterisieren, und z.B. die bessere Stabi-lisierung gegen Ligandenaustausch durch Verwendung zwei- oder mehrzähniger Thiol-Liganden zu demonstrieren,212–214,124,179,215,188

oder den Einfluss verzweigter Liganden¹²³ oder von Koadsorption²¹⁶ auf die Stabilität gegen Ligandenaustausch zu studieren. Die Kinetik der Destabilisierung durch DTT ist abgesehen von DTT- und AuNP-Konzentration und –Durch-messer durch zwei Aspekte beeinflusst: die Durchdringung der Ligandenhülle und die kom-petitive Verdrängungsreaktion an der Partikeloberfläche. Es ist daher naheliegend, dass mehrzähnige Thiole in dieser Hinsicht besser stabilisieren als einzähnige, weil sie durch den Chelat-Effekt stärker an die AuNP-Oberfläche gebunden sind. Die genannten Studien und auch Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass diese chemische Stabilität für die Austausch-kinetik wichtiger ist als die Durchdringung der Ligandenhülle, denn obwohl einzähnige Thiolliganden wegen ihres geringeren Platzanspruchs dichter gepackte Ligandenhüllen bilden dürften als zweizähnige, werden sie schneller durch DTT ausgetauscht.²¹⁷

2.2.4.3 Oxidatives Ätzen von AuNP

Die Reaktion von Cyaniden (hier Kaliumcyanid) mit Gold:

4 Au + 8 KCN + O2 + 2 H2O → 4 K[Au(CN)2] + 4 KOH

ist aus dem industriellen Bergbau bekannt, wo sie für die sogenannte Cyanidlaugerei genutzt wird, sie kann aber auch für die „weiche“ Lithographie mit µCP verwendet werden, um Mikro- und Nanostrukturen von Gold zu erzeugen.²¹⁸ Die Reaktion von Cyanid mit AuNP kann für den hochsensitiven und selektiven Nachweis von Cyanid genutzt werden, z.B. indem die Verstärkung des Raman-Signals durch AuNP ausgenutzt wird.²¹⁹ Das oxidative Ätzen von AuNP bewirkt eine teilweise oder vollständige Auflösung der Partikel und die Kinetik der Ätzreaktion hängt stark von der Ligandenhülle ab. Daher kann das oxidative Ätzen von AuNP analytisch genutzt werden, um die Ligandenhülle zu studieren. So wurde der Einfluss von dendritischen Strukturen,^220,221 Lipid-Doppelschichten,²²² Kreuzvernetzung,^223,224 sterischem Anspruch und Länge von Alkanthiolaten,^123,118 und der Kettenlänge von -Mercaptocarbonsäuren¹²² auf die Stabilität von AuNP gegen Ätzen studiert. Zudem wird die Ätzreaktion in manchen Studien genutzt, um eine gute Stabilisierung durch neue Ligandentypen oder von Konjugaten zu demonstrieren.^225,191

Wie die Aggregation kann auch das Ätzen von AuNP hervorragend mittels zeitaufgelöster UV/vis-Spektroskopie verfolgt werden, da die Extinktion der AuNP entsprechend dem Lam-bert Beerschem Gesetz von deren Konzentration abhängt und diese Abhängigkeit wegen der extrem hohen Extinktionskoeffizienten von AuNP stark ausgeprägt ist. Die Extinktionskoeffizienten sind ihrerseits vom Durchmesser der AuNP abhängig.⁸⁸ Zusätzlich kann in manchen Experimenten die Abhängigkeit der Lage der SPR-Bande vom Partikeldurchmesser zur Interpretation genutzt werden.

Im Gegensatz zur DTT-induzierten Aggregation hängt die Kinetik der Ätzreaktion nicht von der Stärke der chemischen Bindungen der Liganden an die AuNP-Oberfläche ab, sondern nur von der Durchdringbarkeit der Ligandenhülle für die Cyanidionen. Insofern weist das oxidative Ätzen gute Voraussetzungen für ein Studium der Ligandenhüllen von AuNP-Konjugaten auf. Die Zahl der Studien, die diese Methode verwenden ist allerdings gering. Die Ätzreaktion von Cyanid mit AuNP-Konjugaten und die dafür relevanten Parameter sind kaum untersucht, was ihren analytischen Wert und die studienübergreifende Vergleichbarkeit der Ergebnisse begrenzt. Studien, in denen die Ätzreaktion präparativ genutzt wird, beschränken sich vor allem auf Synthesen, bei denen Gold als Templat dient, z.B. solchen von hohlen Polymer- oder Silicakapseln.^226–231

Die Stabilität von AuNP-Konjugaten muss also differenziert betrachtet werden. Zum einen muss die Art der Destabilisierung unterschieden werden, Agglomeration, Aggregation oder Auflösung, zum anderen die Ursache der Destabilisierung. Da die Stabilität von AuNP-Konjugaten maßgeblich von der Ligandenhülle abhängt, können Stabilitätstests genutzt

wer-Theoretische Grundlagen und Forschungshintergrund zu Kapitel 2 95 den, um die Ligandenhüllen von AuNP-Konjugaten zu studieren. Methodisch sind dafür die Elektrolyt-induzierte Aggregation, die DTT-induzierte Aggregation und das oxidative Ätzen mit Cyanid geeignet. Im folgenden Abschnitt sollen abschließend einige Überlegungen zum Zusammenhang von Struktur der Ligandenhülle und Stabilität der AuNP-Konjugate dem Ergebnisteil vorangestellt werden.