Einfluss der PEG-Länge auf die Stabilität von AuNP@PEG-Konjugaten

PEG-Ergebnisse und Diskussionen zu Kapitel 2 119 Liganden mit Amino-Termini oder Molmassen unter 1000 g/mol zeigten dagegen Anzeichen von sehr langsamer irreversibler unspezifischer Adsorption und Aggregation. Im Folgenden werden zunächst die Stabilitätstest und zusätzliche Charakterisierung der Konjugate AuNP@3kPEGNH2, AuNP@5kPEGNH2 und AuNP@10kPEGNH2 dargestellt, gefolgt von den Konjugaten mit Methoxy-terminierten PEG-Liganden, bei denen insbesondere der Einfluss des Spacers untersucht wurde.

pH 12 wurden dazu jeweils 90 Absorbanzspektren in Intervallen von 5 Minuten aufgenommen. Bei pH 7 wurde anhand der abnehmenden Absorbanz ein leichter Konzentra-tionsabfall auf ca. 80 % der Ausgangskonzentration festgestellt, während die Proben bei pH 2 und 12 keine Änderung des Absorbanzspektrums innerhalb dieses Zeitraums aufwiesen. Diese Beobachtungen unterstreichen die Rolle der geladenen Aminogruppen bei der Destabi-lisierung, sie legen aber auch eine verbrückende Funktion der Citratmoleküle nahe, die z.B.

für Peptid-Konjugate bereits beschrieben wurde.¹⁸⁶ Bei pH 12 sind die Aminogruppen deprotoniert und bei pH 2 sind die Citratmoleküle vollständig protoniert. In beiden Fällen ist die elektrostatisch induzierte Agglomeration nicht möglich.

2.4.2.2 Stabilität von AuNP@PEGNH2-Konjugaten gegen oxidatives Ätzen

Um die Stabilisierung durch die Amino-PEG-Liganden gegen oxidatives Ätzen zu unter-suchen, wurden Konjugate mit der Partikelcharge AuNP54 unter gleichen Bedingungen syn-thetisiert und durch Dialysieren gereinigt. Anschließend wurden Teile dieser Proben auf die gleiche Partikelkonzentration von 0.04 nM eingestellt und das oxidative Ätzen in Gegenwart von 10 mM KCN spektroskopisch verfolgt (Intervall: 5 Minuten; Gesamtdauer: 18 Stunden).

Das Experiment wurde nach einem Monat unter gleichen Bedingungen wiederholt, um den Einfluss der langfristigen Destabilisierung durch Desorption von Liganden zu untersuchen.

Da in den gereinigten Konjugaten kein freier Ligand mehr vorliegen sollte, ist die Desorption aus der Ligandenhülle thermodynamisch begünstigt und kann nur durch kinetische Hemmung verzögert werden. Die Desorption von Thiolen ist in wässrigen Lösungen am schwächsten ausgeprägt¹⁰⁹ und kann vernachlässigbar gering sein,⁴⁹ jedoch dürfte die Kinetik des oxidativen Ätzens bereits durch geringe Zunahmen an Defektstellen in den Ligandenhüllen beeinflusst werden. Die Ergebnisse der Ätzexperimente sind in Abbildung 2.15 gezeigt.

Abbildung 2.15 A zeigt beispielhaft die aufgenommenen Spektren für AuNP54@PEG3kNH2.

Es ist eine sehr regelmäßige Abnahme der Absorbanz mit der Zeit zu erkennen ohne Anzeichen für eine signifikante Aggregation der Probe. Diese würde eine Zunahme der Absorbanz im Bereich von etwa 600-800 nm bewirken. Dies weist darauf hin, dass die Partikelgröße sich während des Ätzens nicht stark ändert und dass durch Ätzen destabilisierte Partikel schnell vollständig aufgelöst werden. Wenn eine Aggregation stattgefunden hätte, hätte die Sedimentationsgeschwindigkeit dieser Aggregate sehr hoch sein müssen, um zu keinem Zeitpunkt Aggregate zu detektieren. Es wurden allerdings keine Anzeichen von Sedimenten nach den Experimenten gefunden, so dass bedeutende Aggregationsprozesse in

Ergebnisse und Diskussionen zu Kapitel 2 121 diesen Experimenten ausgeschlossen werden können. Eine genaue Untersuchung und Diskussion des Ätzmechanismus wird in Abschnitt 2.4.3.3 dieses Kapitels vorgestellt.

Durch Auftragen der maximalen Absorbanz der SPB oder der Absorbanz bei 450 nm gegen die Zeit lassen sich die Kinetiken der Ätzprozesse direkt darstellen und vergleichen (Abbildung 2.15 B). Der Vergleich der Ätzkinetiken zeigt sowohl für die frischen als auch die gealterten Proben, dass die Stabilisierung mit zunehmender PEG-Kettenlänge leicht abnimmt.

Außerdem sind die gealterten Proben etwas instabiler gegenüber dem oxidativen Ätzen als die frischen. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass PEG-Liganden mit höheren Molmassen schlechter stabilisieren als solche mit niedrigeren Molmassen, wenn der stabilisie-rende Effekt einer dickeren Ligandenhülle durch den destabilisiestabilisie-renden Effekt einer niedrige-ren Bedeckungsdichte relativiert wird. Zudem deutet die geringere Stabilität nach einem längeren Zeitraum auf die Desorption von Liganden hin, die jedoch nicht stark ausgeprägt zu sein scheint. Auch die Destabilisierung durch Alterung ist bei den Konjugaten mit längeren PEG-Liganden etwas stärker ausgeprägt.

Abb. 2.15: Ergebnisse der zeitaufgelösten UV-vis-Spektroskopie zur Verfolgung der Reaktion der AuNP54@PEGNH2-Konjugate mit Cyanid. Eine repräsentative Auswahl an Absorbanzspek-tren der Probe AuNP54@PEG3kNH2 in Gegenwart von 10 mM Kaliumcyanid verdeutlicht die suk-zessive Abnahme der Absorbanz, die hier auf die Abnahme der AuNP-Konzentration zurückzuführen ist (A). Die Spektren wurden in 5 Minuten-Intervallen aufgenommen, aus Gründen der Übersichtlich-keit ist jedoch nur jedes 4. Spektrum gezeigt (t = 20 min). In den Spektren finden sich keine Anzei-chen für Aggregation oder signifikante Änderungen des mittleren Durchmessers der Probe. Durch Auftragung der normierten Absorbanzmaxima der SPB gegen die Zeit können die Kinetiken der Ätzreaktionen dargestellt und verglichen werden (B). Gereinigte Proben, die also keine freie Liganden enthielten, wiesen nach 27 Tagen Lagerung bei Raumtemperatur in verschlossenen Gefäßen eine etwas geringere Stabilität gegen oxidatives Ätzen mit Kaliumcyanid auf. Außerdem nahm mit zunehmender Molmasse der Liganden die Stabilisierung gegen oxidatives Ätzen ab.

Ergebnisse und Diskussionen zu Kapitel 2 123 2.4.2.3 Stabilität von AuNP@PEGNH2-Konjugaten gegen DTT-induzierte Aggregation

Die Stabilität von AuNP54@PEG3kNH2, AuNP54@PEG5kNH2 und AuNP54@PEG10kNH2 gegen DTT-induzierte Aggregation wurde mit einer DTT-Konzent-ration von 330 mM und 133 mM NaCl getestet. Die Kinetiken sind in Abbildung 2.16 gezeigt.

Abb. 2.16: DTT-induzierte Aggregation. Aggregation der AuNP54@PEGNH2-Konjugate in Gegen-wart von 330 mM DTT und 133 mM NaCl, dargestellt über die mit der Zeit abnehmende Absorbanz der SPB (SPB-Absorbanz).

Diese Experimente sind schwieriger zu interpretieren, weil die Verläufe der Absorbanz mit der Zeit unregelmäßiger sind. Dies ist in der Komplexität der Aggregations- und damit verbundenen Sedimentationsprozesse begründet, die zu ungewöhnlichen Konzentrations-profilen innerhalb der Küvette führen können. Die Kinetik scheint bei AuNP54@PEG5kNH2 und AuNP54@PEG10kNH2 verzögert zu sein, und diese anfängliche Verzögerung scheint bei der Probe AuNP54@PEG10kNH2 stärker ausgeprägt zu sein. Dies könnte vorsichtig als eine etwas bessere Stabilisierung mit zunehmender Kettenlänge interpretiert werden. Eine höhere Bedeckungsdichte dürfte auch hinsichtlich der DTT-induzierten Aggregation stabilisierend wirken, auch weil mehr Thiolat-Bindungen ausgetauscht werden müssen. Da das DTT-Molekül deutlich größer ist als Cyanid-Ionen könnte aber der Effekt der sterischen Hinderung durch eine dickere Ligandenhülle in diesen Experimenten überwiegen. Mit zunehmender PEG-Kettenlänge sind zudem weniger Moleküle pro AuNP nötig, um diese sterisch gegen Aggregation zu stabilisieren.

2.4.2.4 Fazit zum Einfluss der Kettenlänge Teil I

Sowohl die Stabilität gegen oxidatives Ätzen als auch die Stabilität gegen DTT-induzierte Aggregation wurde durch PEG-Liganden höherer Molmasse nicht signifikant verbessert. Die

getesteten PEG-Liganden waren heterobifunktionelle Liganden, bei denen die PEG-Kette direkt durch eine Amino- bzw. eine Thiolfunktion in  und -Position terminiert ist, in denen also kein Spacer zwischen Thiol und PEG-Kette vorlag. Die Stabilität gegen oxidatives Ätzen nahm mit zunehmender Kettenlänge leicht ab, die DTT-induzierte Aggregation war mit zunehmender Kettenlänge schwach verzögert. Als wichtiger Grund für diese Beobachtungen werden Unterschiede in der Bedeckungsdichte angenommen.

2.4.2.5 Einfluss der Kettenlänge bei PEGMUA

Der Einfluss der Kettenlänge auf die Stabilität der Konjugate wurde auch mit den Ligan-den PEGMUA, PEGMUA5k und PEGAmidMUA untersucht. PEGAmidMUA unterscheidet sich von den anderen beiden Liganden dadurch, dass der Spacer - basiert auf 11-Mercapto-undecansäure - hier über eine Amidbindung mit der PEG-Kette verknüpft ist und dass es sich um ein reines Oligomer mit zehn Ethylenglykoleinheiten handelt, dessen Molmasse nicht verteilt ist (Abb. 2.12).

Es wurden AuNP12C mit den Liganden funktionalisiert. Diese Partikel waren mit der optimierten inversen Methode synthetisiert und wiesen eine enge Größenverteilung auf bei einem Durchmesser von 11.7 ± 0.9 nm. Die Konjugate AuNP12C@PEGAmidMUA waren nicht stabil und es wurden Konzentrationsverluste nach der Reinigung durch Zentrifugation festgestellt. Auch die DLS-Messungen und Absorbanzspektren wiesen auf eine teilweise Aggregation hin (Abbildungen 2.17 und 2.18). Auch Konjugate von AuNP mit 11-Mercaptoundecansäure (MUA), AuNP12C@MUA, wurden durch Zentrifugationen destabili-siert (Abbildungen 2.17 und 2.18) und diese Beobachtungen zeigen, dass die PEG-Kette eine wichtige Rolle für die Stabilisierung der Konjugate spielt und ausreichend lang sein muss, um eine hohe Stabilität in wässriger Lösung zu gewährleisten.

Ergebnisse und Diskussionen zu Kapitel 2 125

Abb. 2.17: Stabilität in Abhängigkeit von der (PEG-) Ligandenlänge UV/vis Analytik der Konju-gate AuNP12C@Citrat, @MUA, @PEGAmidMUA, @PEGMUA2k und @PEGMUA5k direkt nach der Konjugationsreaktion („roh“), nach Filtration mittels Spritzenfilter (0.22 µm PVDF, „filtriert“) und nach Reinigung und Aufkonzentrieren durch mehrfache Zentrifugation („purif.“). Die detaillierten Durchführungen von Konjugation und Reinigung sind im Experimentalteil beschrieben. Die Absorbanzspektren zeigen, dass die Konjugate AuNP12C@MUA und @PEGAmidMUA bereits nach der Filtration niedriger konzentriert sind (rote Spektren, A), was auf eine teilweise Aggregation hinweist. Die Konjugate AuNP12C@MUA zeigten hohe Konzentrationsverluste durch Reinigung und Aufkonzentrieren, wurden also durch die Zentrifugationsschritte stark destabilisiert (blaue Spektren, A). AuNP12C@PEGAmidMUA zeigten ebenfalls Konzentrationsverluste durch Reinigung und Aufkonzentrieren, während die Konjugate AuNP12C@PEGMUA2k und @PEGMUA5k keine Kon-zentrationsverluste, weder durch Filtration, noch durch Reinigung und Aufkonzentrieren, aufwiesen.

In den normierten Absorbanzspektren (B, normiert mit der Absorbanz bei 450 nm), weist nur für die Konjugate AuNP12C@MUA die stärkere Absorbanz im Bereich von ~600-800 nm auf eine signifi-kante Population von Aggregaten hin, sowohl vor als auch nach der Reinigung. Alle anderen Absorbanzspektren zeigen nur die charakteristische Verschiebung der SPR-Bande nach Konjugation eines PEG-Liganden.

Abb. 2.18: DLS-Experimente zum Einfluss der (PEG-) Ligandenlänge. Der über DLS-Messungen bestimmte hydrodynamische Durchmesser der Konjugate AuNP12C@PEGMUA2k und

@PEGMUA5k (filtrierte und gereinigte Proben) nimmt mit steigender PEG-Länge zu (A). Die DLS-Messungen der Konjugate AuNP12C@MUA (nur filtrierte Probe wegen zu starker Destabilisierung durch Reinigung) und @PEGAmidMUA (filtrierte und gereinigte Probe) weisen auf eine teilweise Aggregation der Proben hin (B).

Die Konjugate AuNP12C@PEGAmidMUA wurden trotz ihrer geringeren Stabilität den in Abbildung 2.19 gezeigten Ätzexperimenten unterzogen. Allerdings ist wegen der Konzentrationsverluste durch Aggregation die Anfangskonzentrationen der Probe nicht mit denen der stabileren Konjugate AuNP12C@PEGMUA und AuNP12C@PEGMUA5k ver-gleichbar. Eine Probe AuNP12C@PEGMUA wurde für solch einen Vergleich verdünnt und einem Ätzexperiment unter gleichen Bedingungen unterzogen. Die Ätzexperimente sind nicht mit denen der AuNP54@PEGNH2-Konjugate zu vergleichen, da eine andere Partikelkonzentration und -größe verwendet wurde. Es ist jedoch bemerkenswert, dass mit deutlich höheren Cyanidionenkonzentrationen von 85 mM, im Vergleich zu 10 mM, gearbei-tet wurde, was auf die höhere Stabilität der AuNP12C@PEGMUA-Konjugate hinweist. Denn trotz dieser höheren Cyanidionenkonzentration wurden die Proben AuNP12C@PEGMUA und AuNP12C@PEGMUA5k während der Dauer des Experiments nicht vollständig aufge-löst. Die Rolle des (MUA-) Spacers für die Stabilisierung von AuNP-Konjugaten wird im folgenden Abschnitt ausführlich untersucht und diskutiert. Die Stabilität der AuNP@-PEGMUA-Konjugate gegen oxidatives Ätzen war im Gegensatz zu den AuNP54@PEGNH2-Konjugaten stark abhängig von der PEG-Kettenlänge und nahm mit zunehmender Kettenlänge zu.

Ergebnisse und Diskussionen zu Kapitel 2 127

Abb. 2.19: Einfluss der PEG-Länge auf die Ätzreaktion. Abnahme der Absorbanz bei 450 nm (A450) im Verlauf der Reaktion der Konjugate AuNP12C@PEGMUA5k (blaue Kreise), AuNP12C@PEGMUA2k (rote Dreiecke) und AuNP12C@PEGAmidMUA (grüne Vierecke) mit je 85 mM Kaliumcyanid. Für den Vergleich mit den instabileren Konjugaten AuNP12C@PEGAmidMUA wurde zusätzlich die Reaktion einer verdünnten Probe der Konjugate AuNP12C@PEGMUA2k unter gleichen Bedingungen spektroskopisch verfolgt (AuNP12C@-PEGMUA2k (2), graue Dreiecke). Die Experimente belegen übereinstimmend eine deutliche Korrelation von PEG-Länge und Stabilität gegen oxidatives Ätzen mit Cyanid.

Diese wichtige Beobachtung ist ein starker Hinweis darauf, dass der MUA-Spacer eine höhere Bedeckungsdichte insbesondere der größeren Polymere ermöglicht. Dies kann zum einen bewirken, dass die PEG-Ketten stärker in eine brush-Konformation gezwungen werden, wodurch die Dicke der Ligandenhülle zunimmt. Der wichtigere Punkt ist aber, dass der stabi-lisierende Effekt einer dickeren Ligandenhülle in diesen Konjugaten nicht oder weniger durch eine geringere Bedeckungsdichte relativiert wird. Dass durch den MUA-Spacer eine höhere Bedeckungsdichte erzielt wird, kann geometrische und thermodynamische Gründe haben. Das geometrische Argument berücksichtigt den geringeren Platzanspruch der Alkylketten im Zusammenhang mit der Krümmung der AuNP-Oberfläche. Durch den Abstand von etwa 0.5-1 nm, den die Alkylketten zwischen PEG-Ketten und AuNP-Oberfläche erzeugen, und durch die Aufspreizung der Liganden aufgrund der Oberflächenkrümmung, ergibt sich mehr Raum für die PEG-Ketten, von denen folglich mehr an den AuNP gebunden werden können, selbst wenn sie in der gleichen Konformation vorliegen (Abb. 2.20). Die innere hydrophobe Schicht, die durch die Alkylketten gebildet wird, stellt eine zusätzliche physikalische Barriere dar.

Dies erklärt, zusammen mit der höheren Bedeckungsdichte, dass bei gleicher Polymerlänge durch Verwendung eines Spacers die Stabilität der Konjugate erhöht wird.

Abb. 2.20: Schematische Darstellung der veränderten Konjugatgeometrie durch Verwendung eines Spacers. Da der Spacer, z.B. MUA, als innere Schicht oder Hülle zum Durchmesser des AuNP beiträgt, können aus geometrischen Gründen mehr PEG-Liganden in der gleichen Konformation an den Partikel gebunden werden. Die innere Schicht stellt eine zusätzliche physikalische Barriere dar.

Allerdings würde bei unveränderter Konformation der PEG-Reste auch bei Verwendung eines Spacers mit steigender Polymerlänge die Bedeckungsdichte abnehmen. Dass die Stabilität der AuNP@PEGMUA-Konjugate mit der PEG-Länge korreliert, lässt sich also nur damit erklären, dass die PEG-Reste durch Verwendung eines Spacers in eine Konformation gezwungen werden, die eine höhere Bedeckungsdichte ermöglicht. Dies kann thermodynamisch durch Bilanzierung der attraktiven und repulsiven Wechselwirkungen in der Ligandenhülle begründet werden. Während bei PEG-Liganden ohne Spacer die Bedeckungsdichte allein durch die repulsiven Wechselwirkungen der PEG-Monomere beeinflusst wird (die Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel Wasser sind bevorzugt),¹⁹³ liefern bei den PEGMUA-Konjugaten die attraktiven Van-der Waals-Wechselwirkungen der Alkylketten einen energetischen Beitrag,⁴⁷ der eine höhere Bedeckungsdichte und eine brush-Konformation der PEG-Ketten begünstigt, unabhängig davon, ob es sich um ein gekrümmtes oder ein planares Substrat handelt.