4 Methoden
4.8 Arbeiten in der Zellkultur
4.8.2 SF21-‐Insektenzellen
4.8.2 SF21-‐Insektenzellen
4.8.2.1 Kultivierung
SF21-‐Zellen stammen aus den Ovarzellen des Heerwurmes Spodoptera frugiperda, (Patterson, et al., 1995). Die Zellen wurden vom Lehrstuhl Biochemie III der Universität Regensburg von der Arbeitsgruppe Prof. Gernot Längst aus einer bereits wachsenden Kultur bereitgestellt und in einem Volumen von 20 ml SF-‐900 II Medium (Invitrogen) in 250 ml Erlenmeyerkolben bei 27 °C und 75 UpM kultiviert. Dabei wurde extrem auf steriles Arbeiten geachtet, da dem Medium keine Antibiotika zugesetzt waren.
4.8.2.2 Splitten
Bei SF21-‐Zellen muss darauf geachtet werden, dass sie sich ständig im logarithmischen Wachstum befinden, d.h. im Bereich von Zelldichten zwischen 0,5 x 106 und 2,0 x 106 Zellen/ml. Deshalb wurde jeden Tag mithilfe einer Neubauer-‐Zählkammer die Zellzahl bestimmt (gleiches Vorgehen wie bei Fuchs-‐Rosenthal-‐Zählkammer, 4.8.1.4). Dabei wurde auch die Anzahl an toten Zellen mitbestimmt, wobei der Anteil nicht über 5% der gesamten Zellzahl betragen sollte. Ab einer Zelldichte von 1,0 x 106 Zellen/ml wurden die Zellen wieder auf ca. 0,5 x 106 Zellen/ml und ein Gesamtvolumen von 20 ml ausge-‐
dünnt.
4.8.2.3 Transfektion von SF21-‐Zellen und Gewinnung von V0
Zur Transfektion von SF21-‐Zellen wurden logarithmisch wachsende Zellen einer Dichte von 0,5 x 106 Zellen/ml in SF-‐900 II Medium verwendet. Davon wurden je 2 ml in 5 der 6 Näpfe einer 6-‐Well-‐Platte ausgesät. Durch leichtes Klopfen wurden die Zellen im 6-‐
Well verteilt und für 15 Minuten bei RT inkubiert, wodurch sich die Zellen am Boden des Wells absetzten. In der Zwischenzeit wurde Bacmid–DNA für zwei parallele Trans-‐
fektionen in Duplicaten vorbereitet. Hierfür wurden jeweils 100 μl SF-‐900 II Medium in Reaktionsgefäße vorgelegt, ca. 50 – 100 μg Bacmid–DNA hinzugegeben und gut ver-‐
mischt. Parallel dazu wurde als Negativkontrolle ein Well SF21-‐Zellen ohne Bacmid-‐
DNA transfiziert. Ein weiteres Well enthielt 2 ml SF-‐900 II Medium ohne Zellen. Als Transfektionsreagenz wurde Fugene HD (Roche oder Promega) verwendet. Sofort nach Zugabe von 6 μl Fugene HD Transfektionsreagenz wurde das Reaktionsgefäß 2-‐
3 Sekunden lang gevortext und für 15 Minuten inkubiert. In dieser Zeit bildeten sich die
Lipid-‐Komplexe mit der eingeschlossenen Bacmid-‐DNA aus und jeder Ansatz wurde gleichmäßig auf zwei Wells verteilt. Nach dem Absetzen der Insektenzellen in der 6-‐
Well wurde das überstehende Medium von den fünf Näpfen mit Zellen abgesaugt, ein-‐
mal mit 2 ml SF-‐900 II Medium gewaschen und mit 3 ml Medium überschichtet. Die 6-‐
Wells wurden mit Parafilm verschlossen, um Kontaminationen zu vermeiden, und bei 27 °C inkubiert. Nach 48 – 60 h wurde der Überstand abgenommen und für jedes Bacmid vereinigt, d.h. pro transfiziertem Bacmid erhielt man ca. 6 ml Virusstock V0, der bei 4 °C gelagert wurde.
Für einen ersten Test, ob die Transfektion mit der Bacmid-‐DNA funktioniert hatte, wur-‐
den erneut 3 ml Medium auf die Zellen gegeben und diese nach weiteren 24 – 48 h bei 27 °C mit einem Zellschaber abgelöst. Die Zellen wurden mit 1 ml PBS gewaschen, und mit Probenpuffer versetzt, für 5 Minuten aufgekocht. Die Expression der gewünschten Proteine konnte im Western-‐Blot über Antikörperfärbung oder über Coomassiefärbung untersucht werden.
Unter Verwendung des eYFP–Bacmids, welches im Bacmid ein eYFP–Gen enthält, konn-‐
te die Effizienz der Proteinexpression und damit der Transfektion verfolgt werden (Bieniossek, et al., 2008). Dazu wurden die Zellen mit dem Fluorimeter PTI unter Ver-‐
wendung eines entsprechenden Filters analysiert.
4.8.2.4 Infektion von SF21-‐Zellen mit Viruslösung V0
Zur Amplifikation von Baculoviren wurde eine geringe-‐MOI–Infektion („Low Multiplicity Of Infection“) mit dem Virusstock V0 durchgeführt. Dazu wurden logarithmisch wach-‐
sende SF21-‐Zellen in 20 ml Medium mit einer Zelldichte von 0,5 x 106 Zellen/ml durch einfache Zugabe von 10 – 50 μl V0–Stock infiziert. Nach 24, 48 und 72 h wurde die Zell-‐
zahl bestimmt und die Zelldichte auf 0,5 x 106 Zellen/ml eingestellt. Nach 48-‐72 h er-‐
reichten die Zellen den “dpa” („day after proliferation arrest“) und es erfolgte keine Zellteilung mehr. Zu diesem Zeitpunkt haben die Baculoviren alle Zellen befallen und ihnen auf Kosten der eigenen Zellteilung die Produktion der Virenpartikel aufgezwun-‐
gen. Von diesem Zeitpunkt an wurde 48 h später der Überstand durch Zentrifugieren bei 800 UpM, 15 Minuten bei RT gewonnen. Dieser Virusstock V1 hatte eine deutlich höhere Konzentration als V0. Der Virusstock konnte bei 4 °C gelagert und für nachfol-‐
gende Infektionen verwendet werden. Die Zellpellets wurden bis zur Testaufreinigung in flüssigem Stickstoff verwahrt.
4.8.2.5 Titration der Viruslösung V1
Für eine optimale Proteinanreicherung sollte jede Zelle nur von einem Virus infiziert werden. Um für nachfolgende Infektionen ein optimales Virus-‐Zellen-‐Verhältnis zu bestimmen, wurde eine Titration der Viruslösung V1 durchgeführt. Dazu wurden in alle sechs Näpfe eines 6-‐Wells 2 ml einer mit 0,5 x 106 Zellen/ml logarithmisch wachsenden SF21-‐Zellkultur ausgesät und für 15 Minuten bei 27 °C inkubiert. Danach wurden ver-‐
schiedene Konzentrationen von V1-‐Stock zugegeben (0, 1, 5, 25, 50, 100 μl) und bei 27 °C inkubiert. 24 bzw. 48 h nach Infektion wurde unter dem Fluoreszenz-‐Mikroskop der Anteil an leuchtender und somit der Anteil an eYFP-‐Bacmid infizierter Zellen ermit-‐
telt, wobei nach 48 h ein Großteil der Zellen infiziert sein sollte. Um das optimale Ver-‐
hältnis von zugegebenem Virus V1 zu infizierten Zellen zu bestimmen, konnte das Zell-‐
pellet nach einem Waschschritt mit PBS und nach Aufschluss der Zellen für eine Test-‐
reinigung im kleinen Maßstab verwendet werden.
4.8.2.6 Infektion mit optimalem V1/Zell-‐Verhältnis
Mit der Ermittlung des optimalen Verhältnisses zwischen Zellen und Virus kann die Infektion der Zellen in größerem Maßstab durchgeführt werden. Die Arbeitsschritte entsprechen dabei den Vorhergehenden (4.8.2.5). Im Rahmen dieser Arbeit wurde jedoch eine Aufreinigung in großem Maßstab nicht mehr durchgeführt, da sich heraus-‐
gestellte, dass die Viruskonzentration des V1-‐Stocks zu gering war, um ein optimales Virus/Zell-‐Verhältnis erreichen zu können.
4.8.2.7 Aufschluss von SF21-‐Insektenzellen
Die eingefrorenen und bei -‐80 °C gelagerten SF21-‐Zellpellets (4.8.2.4) der V1-‐Stock Herstellung wurden mit 1 ml Lysepuffer/106 Zellen versetzt und gut resuspendiert.
Durch mehrmaliges Auftauen bei Raumtemperatur und Einfrieren in flüssigem Stick-‐
stoff und einer angeschlossenen Sonifizierung (fünf Wiederholungen zu je 30 s, 30 s Pause, auf Eis) wurden die meisten Zellkerne aufgebrochen. Unlösliche Bestandteile dieses Zellextrakts wurden durch Zentrifugation bei 4500 UpM, 15 Minuten bei 4 °C abgetrennt. Der dabei erhaltene Überstand enthielt die löslichen Proteine.