3 Diskussion
3.1 Rca1 – vom Inhibitor zum Substrat des APC Fzr
3.2.2 Die Eingrenzung der Abbausequenz/en in Rca1
In früheren Arbeiten in Drosophila-‐Embryonen konnte die Sequenz, die für den Abbau von Rca1 benötigt wird, bereits auf einen kleinen Bereich eingegrenzt werden (Zielke, 2006; Radermacher, 2007). Dies wurde im Zellkultursystem noch einmal verifiziert, um zu überprüfen, ob dies auch für Schneiderzellen zutrifft.
Ein Sequenzvergleich von Rca1 mit Emi1 hat ergeben, dass Rca1 mehrere funktionale Domänen mit Emi1 gemeinsam hat (Kapitel 2.6.3.1, Abb. 2.3). Für Emi1 konnte gezeigt werden, dass für den Abbau zwei Domänen notwendig sind. Neben einer Phosphorylie-‐
rung an der GSK3-‐Phosphorylierungsstelle müssen auch mehrere Cdk1-‐Phosphory-‐
lierungstellen phosphoryliert werden, damit der SCFβTRCP-‐vermittelte Abbau erfolgen kann (Guardavacaro, 2003; Hansen, 2004; Margottin-‐Goguet, 2003; Moshe, 2004). Die Untersuchung der konservierten Bereiche in Rca1 konnte zeigen, dass keine der Domä-‐
nen alleine für den Abbau von Rca1 verantwortlich ist (Abb. 2.35). Zwar war für *Rca1 (a), *Rca1_dCdk1-‐P (b) und für *Rca1_dGSK (e) in der Auswertung der Durchflusszyto-‐
metrie-‐Daten eine Stabilisierung zu erkennen, die Berechnung der Rca1-‐Funktionaltität zeigte jedoch für alle drei Rca1-‐Derivate eine Aktivität an. Weil die Überexpression eines aktiven Rca1-‐Derivates in Schneiderzellen die erhaltenen Werte der Durchflusszytomet-‐
rie unbrauchbar werden lassen (3.2.1), wurden die Werte der Abbaukurven der Aus-‐
wertung zu Grunde gelegt. Hierbei zeigte sich für keines der untersuchten Rca1-‐
Derivate eine Stabilisierung (Abb. 2.35 C, D). Im Gegensatz zu Emi1, wo die Deletion der GSK3-‐Phosphorylierungsstelle oder der Cdk1-‐Phosphorylierungsstellen ausreichte, um eine vollständige Stabilisierung herbeizuführen, konnte bei Rca1 kein stabilisierender Effekt durch die Deletion der für den Emi1-‐Abbau verantwortlichen Domänen erzielt werden. Dieses Ergebnis spiegelt auch in Schneiderzellen den unterschiedlichen Abbau von Rca1 wieder, wie er bereits in Drosophila-‐Embryonen gezeigt werden konnte. Wei-‐
terhin offen bleibt die Möglichkeit, dass es neben einer dieser Domänen einen zweiten Bereich gibt, der für den Abbau von Rca1 hinreichend ist. In diesem Fall könnte erst durch die Deletion beider Abbausequenzen eine Stabilisierung von Rca1 erreicht wer-‐
den.
In Drosophila-‐Embryonen konnte durch N-‐terminale Verkürzungen eine Stabilisierung von Rca1 nach 234 Aminosäuren erzielt werden, während die Deletion der ersten 220 Aminosäuren noch zu einem Abbau führte (Radermacher, 2009). In Schneiderzellen konnten übereinstimmende Ergebnisse erzielt werden. Während *Rca1_Del-‐1-‐220 als aktives Rca1 in Abbaukurven noch einem Abbau unterworfen war, kam es bei einer Verkürzung um weitere 14 Aminosäuren bei dem Rca1-‐Derivat *Rca1_Del-‐1-‐234 zu einer deutlichen Stabilisierung (Abb. 2.36). Dieser 14 Aminosäuren umfassende Bereich beinhaltet neben zwei Lysinen (K) auch ein Serin (S) und ein Threonin (T) (Abb. 2.37).
Diese modifizierbaren Aminosäuren kommen generell für eine Ubiquitinylierung (K) oder eine Phosphorylierung (S, T) in Frage und könnten damit direkt am Abbau von
Rca1 beteiligt sein. Die Deletion der 14 Aminosäuren langen Region in Rca1 (*Rca1_Del-‐
221-‐234) konnte jedoch keine Stabilisierung von Rca1 in der G1-‐Phase herbeiführen (Abb. 2.37 c). Erst mit der zusätzlichen N-‐terminalen Deletion der ersten 203 Amino-‐
säuren wurde *Rca1_Del-‐1-‐203_Del-‐221-‐234 stabilisiert und zeigte nur noch einen geringfügigen Abbau in den Abbaukurven und im Durchflusszytometer (Abb. 2.37 d). In einer zielgerichteten Punktmutagenese im verkürzten *Rca1_Del-‐1-‐203 wurden drei der vier modifizierbaren Aminosäuren (S224A, K228R, T232V) mutiert, ohne dass sich dadurch ein stabilisierender Effekt – wie er bei der Deletion der 14 Aminosäure langen Sequenz zu sehen war – ergab (Abb. 2.37 e, f). Zwar steht die Untersuchung der Amino-‐
säure K221 noch aus, dennoch legt dieses Ergebnis den Schluss nahe, dass der Abbau von Rca1 nicht durch eine Modifizierung in dem kurzen Bereich ausgelöst wird. Es muss vielmehr in Betracht gezogen werden, dass die Deletion dieses Bereichs möglicherweise einen negativen Effekt auf die nahegelegene KEN-‐Box ausübt und dies zur Stabilisierung führt.
Allerdings war die Stabilisierung von Rca1 durch die Deletion der Aminosäuren 221-‐
234 erst mit einer zusätzlichen Deletion der ersten 203 Aminosäuren zu erkennen. Im N-‐terminalen Bereich von Rca1 muss demnach eine zweite Abbausequenz lokalisiert sein, die alleine ebenfalls hinreichend ist, den Abbau von Rca1 in der G1-‐Phase einzulei-‐
ten. Die Spaltung von Rca1 in ein N-‐terminales und ein C-‐terminales Rca1 konnten diesen Verdacht bestätigen (Abb. 2.44). Beide Rca1-‐Hälften zeigten ein nahezu identi-‐
sches Abbauverhalten in den Abbaukurven. Interessanterweise ergab ein Vergleich des Abbaus beider Rca1-‐Hälften mit *Rca1 eine Verdopplung der Halbwertszeit (50%-‐
Signalintensität) und auch eine Verdopplung des Zeitpunktes in dem der minimale Endwert (20%-‐Signalintensität) erreicht wurde (50%-‐Wert: *Rca1 bei 80 min, N-‐ und C-‐terminales *Rca1 bei 160 min bzw. bei 150 min; 20%-‐Wert: *Rca1 bei 150 min, N-‐ und C-‐terminales *Rca1 bei 340 min bzw. 310 min) (Abb. 2.8 D). Diese Werte legen nahe, dass beide Abbausequenzen zu gleichen Teilen am Abbau von Rca1 beteiligt sind.
Um die Abbausequenz im C-‐terminalen Rca1 (*Rca1_Del-‐1-‐203) weiter einzugrenzen, wurden C-‐terminale Rca1-‐Deletionen vorgenommen (Abb. 2.38). Dabei zeigte sich, dass das Rca1-‐Fragment *Rca1_Del-‐1-‐203_Del-‐299-‐411 noch abgebaut werden kann, wäh-‐
rend die nächst größere Deletion *Rca1_Del-‐1-‐203_Del-‐268-‐411 im Durchflusszytome-‐
ter keinen Abbau mehr aufwies. Das dadurch erhaltene „kleinste abbaubare Fragment“
(KAF, *Rca1_Del-‐1-‐203_Del-‐299-‐411) wurde durch weitere Verkürzungen deutlich stabilisiert. Dabei spielte es keine Rolle, ob die Deletion am N-‐Terminus oder am
C-‐Terminus eingefügt wurde (Abb. 2.39). Da sich die Abbausequenz nicht weiter ein-‐
schränken ließ, stellte sich die Frage, ob das KAF im Gesamten eine Abbausequenz dar-‐
stellt, oder ob es sich hierbei um zwei Abbausequenzen handelt, die zusammenwirken müssen, um einen Abbau einleiten zu können.
Direkt am N-‐Terminus des KAFs ist die KEN-‐Box-‐Domäne lokalisiert, die eine bekannte Erkennungssequenz für APC/CFzr-‐Substrate darstellt. Wurde in diese KEN-‐Box die Punktmutation KEN-‐KAA (E215A-‐N216A) eingeführt und die KEN-‐Box dadurch derart verändert, dass eine Substraterkennung über den APC/CFzr-‐Komplex nicht mehr statt-‐
finden kann, zeigte sich beim KAF eine deutliche Stabilisierung (Abb. 2.42 e). Im Gegen-‐
satz zu einer N-‐terminalen Deletion wird mit der Einführung von zwei Punktmutationen die Struktur des KAFs nur minimal geändert, so dass die erzielte Stabilisierung mit großer Wahrscheinlichkeit auf die veränderte Substraterkennung zurückzuführen ist.
Aufgrund der zweiten Abbausequenz im N-‐terminalen Teil von Rca1 (Rca1_Del-‐204-‐
411) wurde dieser stabilisierende Effekt bei der Untersuchung der KEN-‐Box-‐Domäne im
„volle Länge“-‐Rca1 nicht entdeckt, da die zweite Abbausequenz die KEN-‐Box-‐Funktion vermutlich vollständig übernehmen kann.
Ein Sequenzvergleich des KAFs aus verschiedenen Drosophila-‐Spezies lieferte neben einer hohen Konservierung im N-‐terminalen Bereich, in der die KEN-‐Box lokalisiert ist, zusätzlich eine hohe Konservierung in der C-‐terminalen Region. Dieser Bereich zwi-‐
schen den Aminosäuren 264-‐288 von Rca1 umfasst 25 Aminosäuren (Abb. 2.41 A), darunter mehrere modifizierbare Aminosäuren (1 Serin, 1 Lysin, 2 Cysteine) und auch überdurchschnittlich viele Arginine (6x), die häufig an Protein-‐Protein-‐Interaktionen beteiligt sind (DeLano, 2002). Im Rca1-‐Ortholog Emi1 wurde ein konservierter Bereich identifiziert, der als Unterstützung für die schwache D-‐Box-‐Domäne für eine korrekte Platzierung von Emi1 am APC/C-‐Komplex sorgt (Frye, et al., 2013). Dieser 20 Amino-‐
säuren umfassende Bereich wurde als Linker bezeichnet und ist bei Emi1 zwischen D-‐Box und ZBR lokalisiert (Abb. 1.3), während sich die 25 Aminosäuren umfassende Linkerregion in Rca1 zwischen KEN-‐Box und ZBR befindet. Aufgrund dieser gefundenen Analogie, könnte die Linkerregion in Rca1 – genauso wie bei Emi1 – für eine stabile Anlagerung und vor allem für eine richtige Positionierung von Rca1 an den APC/CFzr sorgen, damit die ZBR den APC/CFzr-‐Komplex in der G2-‐Phase inaktiv halten kann. Die Stabilisierung, die bei der C-‐terminalen Verkürzung des KAFs um 31 Aminosäuren gesehen wurde, könnte mit der neuen Linker-‐Funktion erklärt werden. Da durch die Deletion nahezu die gesamte Linkerregion betroffen ist, ist möglicherweise die KEN-‐
Box-‐Domäne alleine zu schwach, um eine ausreichend starke Interaktion mit dem APC/CFzr-‐Komplex herstellen zu können.
Um die neu identifizierte Linkerregion in Rca1 näher zu charakterisieren, wurden ein-‐
zelne konservierte Aminosäuren im KAF in ein Alanin mutiert und auf ihre G1-‐Stabilität im Vergleich zum ursprünglichen KAF getestet. Dabei führte eine Punktmutation in der Linkerregion in den meisten Fällen zu einer Destabilisierung (Abb. 2.41). Eine Ausnah-‐
me bildeten die beiden Punktmutationen R275A und K277A, sowie die Doppelmutante R275A-‐K277A, die zu einer Stabilisierung führten (Abb. 2.42). Möglicherweise kommt diesen beiden Aminosäuren eine besondere Bedeutung in der Protein-‐Protein-‐
Wechselwirkung zuteil, so dass eine Veränderung einer dieser beiden Aminosäuren dazu führt, dass die Interaktion der Linkerregion mit dem APC/CFzr-‐Komplex soweit abgeschwächt wird, dass die KEN-‐Box-‐Domäne alleine nicht mehr ausreichend ist, um eine APC/C-‐Bindung herbeiführen zu können.
Dieses Argument wird mit der KAF-‐Doppelmutante KEN-‐KAA_K277A bekräftigt (Abb. 2.42 f), da sowohl eine KEN-‐Box-‐Mutation wie auch eine Punktmutation im essen-‐
tiellen Bereich der Linkerregion die Interaktion mit dem APC/C soweit abschwächt, dass eine stabile Bindung nicht mehr stattfinden kann. Trifft diese Hypothese zu, wäre das der Grund, warum die Doppelmutation zu keiner weiteren Stabilisierung führt.
Während die Punktmutanten R275A und K277A zu einer Stabilisierung führten, konnte für alle anderen Punktmutationen im KAF eine Destabilisierung festgestellt werden.
Anhand der bisherigen Argumentation würde die Destabilisierung – hervorgerufen durch die verschiedenen Punktmutanten – eine stärkere APC/CFzr-‐Bindefähigkeit be-‐
deuten. Eine besonders deutliche Destabilisierung des KAF war bei der Punktmutante R280A zu sehen (Abb. 2.43 b). Eine mögliche Erklärung für diesen starken Effekt ist die Veränderung der großen Seitenkette mit einer positiv geladenen Guanidingruppe bei Arginin hin zu einer kurzen und hydrophoben Seitenkette bei Alanin. Solch eine starke Veränderung kann einen großen Effekt auf benachbarte Aminosäuren besitzen. Um die Veränderung etwas moderater zu gestalten, wurde in einer weiteren Punktmutante das Arginin in ein Lysin mutiert, das anstatt der Guanidingruppe ein primäres Amin in der Seitenkette trägt. Allerdings zeigte auch die Punktmutation R280K einen deutlich stär-‐
keren destabilisierenden Effekt (Abb. 2.43 c). Da das Arginin im Zentrum des am höchs-‐
ten konservierten Bereiches lokalisiert ist, liegt die Vermutung nahe, dass diesem Be-‐
reich eine wichtige Funktion in der Linkerregion zuteil wird. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig, um die Funktion dieses Bereiches und vor allem der Linkerregi-‐
on näher charakterisieren zu können. Es zeichnet sich jedoch ab, dass Rca1 in der C-‐
terminalen Region zwei Bereiche besitzt, die für eine Interaktion mit dem APC/C not-‐
wendig sind. Dabei handelt es sich zum einen um die KEN-‐Box und zum anderen um die Linkerregion, die vermutlich für die korrekte Platzierung am APC/C sorgt, damit die ZBR-‐Domäne den APC/CFzr-‐Komplex inhibieren kann.
Neben der Abbausequenz im C-‐terminalen Teil von Rca1 (*Rca1_Del-‐1-‐203), konnte auch im N-‐terminalen Teil von Rca1 (Rca1_Del-‐204-‐411) ein Abbau in der G1-‐Phase beobachtet werden (Abb. 2.44). Um die Abbausequenz in diesem Bereich weiter einzu-‐
grenzen, wurden N-‐terminale Deletionen vorgenommen (Abb. 2.45). Dabei zeigten die Auswertungen ein uneinheitliches Bild. Während N-‐terminale Deletionen in der G1-‐
Phase teilweise vollständig stabilisiert waren (Abb. 2.45 d, g), zeigte das kürzeste Frag-‐
ment, das nur aus der F-‐Box-‐Domäne besteht (*Rca1_Del-‐1-‐154_Del-‐204-‐411, Abb 2.45), eine deutliche Instabilität an. Die F-‐Box-‐Region bildet eine recht strukturierte Domäne aus (Frye, et al.,2013), die durch die Deletionen in einer nicht vorhersagbarer Weise beeinflusst werden könnte. Die dadurch fehlerhaft gefalteten Proteine könnten generell eine allgemeine, nicht abschätzbare Instabilität hervorrufen. Aufgrund der generell aufgetretenen G1-‐Instabilität in den Daten der Durchflusszytometrie für die N-‐terminale Deletion der ersten 100 Aminosäuren, lässt sich keine Aussage über die Stabilität der noch weiter verkürzten Rca1-‐Deletionen treffen (Abb. 2.45). Jedoch zeichnete sich zwi-‐
schen Aminosäure 50 und 75 sowohl bei der Auswertung der G1-‐Stabilität im Durch-‐
flusszytometer als auch bei den Abbaukurven eine deutliche Stabilisierung des N-‐
terminalen Rca1 ab (Abb.2.45 c, d). Aus diesem Grund wurden weitere N-‐terminale Rca1-‐Deletionen erstellt, um die Abbausequenz genauer eingrenzen zu können. In die-‐
sen N-‐terminalen Rca1-‐Derivaten war die F-‐Box deletiert, so dass die generelle Instabili-‐
tät, die durch die F-‐Box hervorgerufen worden ist, wieder ausgegrenzt werden konnte.
Dabei zeigte sich für *Rca1_Del-‐76-‐411 eine Instabilität in der G1-‐Phase, wohingegen
*Rca1_Del-‐1-‐75_Del-‐151-‐411 stabilisiert vorlag (Abb. 2,46). Dieses Ergebnis deutet auf eine Abbausequenz in den ersten 75 Aminosäuren hin.
Allerdings sind die Ergebnisse für die Eingrenzung der Abbausequenz im N-‐terminalen
*Rca1_Del-‐204-‐411 nicht sehr aussagekräftig, da für die Auswertung nur die Abbaukur-‐
ven verwendet werden konnten, während die Daten aus der Durchflusszytometrie von Messung zu Messung teilweise deutlich voneinander abwichen.
Insgesamt konnten in Rca1 mehrere Bereiche ausgemacht werden, die für einen Rca1-‐
Abbau in der G1-‐Phase verantwortlich gemacht werden können. Neben der Abbause-‐
quenz im N-‐terminalen Bereich, die vermutlich zwischen Aminosäure 50-‐75 lokalisiert ist (Abb. 2.45 c und d), konnte in der C-‐terminalen Hälfte von Rca1 neben der KEN-‐Box auch die Linkerregion als zusätzliche Region identifiziert werden, die für den Abbau notwendig ist (Abb. 2.42). Bei letzteren handelt es sich allerdings um keine autarken Abbausequenzen sondern beide bilden gemeinsam eine Abbausequenz aus.