2 Ergebnisse
2.4 Die Etablierung eines Drosophila-‐spezifischen in vitro-‐
2.4.3 Ubiquitinylierungsassays
2.4.3.1 Inaktivierung des Retikulozytenlysats durch NEM
Abbildung 2.63: Vergleich der Drosophila E2-Enzyme Effete und Vihar mit humanem UbcH5b
Die spezifische Ubiquitinylierung des Substrates Geminin_Del-102-192-10xHA-6xHis wurde im Westernblot mit einem HA-Antikörper sichtbar gemacht. Die Prozentangaben unterhalb des Blots geben die verbliebene Menge an Substrat nach erfolgter Reaktion an. Die Ausgangsmenge entsprach dabei den 100% der Nullkontrolle zum Zeitpunkt t=0 (1).
(2-3) Ubiquitinylierungsreaktionen nach 60 Minuten (2) bzw. 180 Minuten mit aufgereinigtem UbcH5b-6xHis aus E. coli
(4-5) Ubiquitinylierungsreaktionen nach 60 Minuten (2) bzw. 180 Minuten mit gekauftem UbcH5b (Enzo)
(6-8): Ubiquitinylierungsreaktionen mit unterschiedlichen E2-Enzymen unter Zugabe von zusätzli-chem 6xHis-Uba1: (6) Ubiquitinylierung mit UbcH5b-6xHis; (7) Ubiquitinylierung mit Effete-6xHis;
(8) Ubiquitinylierung mit Vihar-6xHis zum Zeitpunkt t=60 min Zusammensetzung des Mastermixes pro Ansatz:
Geminin* (2 µl), Ubiquitin (0,15 µl), 100 mM ATP (0,3 µl), Retik-Lysat (8 µl).
(1-8): E2-Enzyme gemäß Angabe (1 µl); (6-8): 6xHis-Uba1 (0,5 µl)
Reaktionen wurden mit 10 µl 4xLSB gestoppt, aufgekocht und jeweils 10 µl auf ein 8%iges SDS-Gel aufgetragen und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Geminin*: Geminin_Del-102-192-10xHA-6xHis
2.4.3 Ubiquitinylierungsassays
2.4.3.1 Inaktivierung des Retikulozytenlysats durch NEM
Retikulozytenlysat wird häufig für die Translation von Proteinen verwendet. In dieser Arbeit wurde bereits Geminin_Del-‐102-‐192-‐10xHA in vitro hergestellt, letztendlich aber durch aus E. coli aufgereinigtes Geminin_Del-‐102-‐192-‐10xHA-‐6xHis ersetzt. Eine bakte-‐
rielle Aufreinigung ist aber nicht in allen Fällen möglich. Der APC/C-‐Aktivator Fzr benö-‐
tigt zum Beispiel für eine richtige Faltung CCT-‐Chaperone (Bandura, et al., 2013). Dieser Reifungsprozess ist nur im eukaryotischen Zellsystem möglich, weshalb Fzr nicht in E. coli hergestellt werden kann. Um den störenden Einfluss der unspezifischen E3-‐
Ubiquitin-‐Ligasen im Retikulozytenlysat zu beseitigen, wurde deshalb in einem ersten
Experiment das Retik-‐Lysat durch Zugabe von 10 mM N-‐Ethylmaleinimid (NEM) behan-‐
delt (Enquist-‐Newman, et al., 2008). NEM geht eine chemische Reaktion mit Cysteinen ein, wodurch aktive S-‐H-‐Bindungen reduziert und somit inaktiviert werden. Durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT) soll der Überschuss an NEM beseitigt werden, so dass der APC/C-‐Komplex durch Zugabe von 6xHis-‐Uba1 und einem entsprechenden E2-‐
Enzym wieder aktiviert werden kann, andere Ubiquitin-‐Ligasen jedoch weiterhin inak-‐
tiviert bleiben.
Ob NEM in der Lage ist, die E3-‐Ligasen im Retikulozytenlysat vollständig zu inaktivie-‐
ren, zeigt Abbildung 2.64. Ein Teil des Retik-‐Lysates wurde mit NEM und DTT vorbe-‐
handelt und mit aktivem sowie inaktiviertem Retikulozytenlysat ein Ubiquitinylie-‐
rungsassay mit allen notwendigen Komponenten im Mastermix angesetzt. Um die Akti-‐
vität der E3-‐Ligasen detektieren zu können, wurde ein 1:1 Gemisch von Ubiqui-‐
tin/FLAG-‐Ubiquitin verwendet. Bei beiden Ansätzen zeigte die Nullkontrolle im FLAG-‐
Blot keine Polyubiquitinylierungsbanden (1 und 3). Die Behandlung mit NEM und DTT führte zu einer nahezu vollständigen Inaktivierung der E3-‐Ligasen, da vor allem auf dem FLAG-‐Blot nur noch eine schwache Polyubiquitinylierung zu sehen ist (4).
Das unbehandelte Retikulozytenlysat hingegen zeigt als Positivkontrolle in der Reaktion deutliche Polyubiquitinylierungsbanden im hochmolekularen Bereich an, die sowohl im FLAG-‐Blot für unspezifische Proteine als auch für das APC/C-‐Substrat Geminin* gut zu erkennen sind (2).
Durch eine zusätzliche Zugabe von 6xHis-‐Uba1 und dem im Mastermix vorhandenen humanen UbcH5b sollte der APC/C-‐Komplex wieder reaktiviert werden und speziell das Geminin* ubiquitinyliert werden. Zwar wurden keine anderen E3-‐Ligasen reaktiviert, eine Polyubiquitinylierung von Geminin* im HA-‐Blot ist allerdings auch nicht zu erken-‐
nen (5).
Anhand dieses Experiments lässt sich die Aussage treffen, dass NEM die E1-‐, E2-‐, und E3-‐Enzyme im Retikulozytenlysat nahezu vollständig inhibieren kann. Eine Reaktivie-‐
rung durch Zugabe von DTT, humanem UbcH5b und 6xHis-‐Uba1 konnte nicht beobach-‐
tet werden. Es ist wahrscheinlich, dass nach NEM-‐Inaktivierung sämtlicher E3-‐Ligasen für eine Reaktivierung der Ubiquitinylierungsreaktion neben dem E1-‐ und dem E2-‐
Enzym auch ein aktiver APC/CFzr-‐Komplex wieder hinzugegeben werden muss.
Abbildung 2.64: Inaktivierung der E3-Ligasen im Retikulozytenlysat durch NEM
Die spezifische Ubiquitinylierung des Substrates Geminin_Del-102-192-10xHA-6xHis wurde im Westernblot mit einem HA-Antikörper sichtbar gemacht (oberer Blot). Die unspezifische Ubiquiti-nylierung von Proteinen durch E3-Ligasen im Retikulozytenlysat kann durch die Zugabe von FLAG-Ubiquitin im Westernblot mit einem FLAG-Antikörper detektiert werden (unterer Blot).
(1-2): Ubiquitinylierungsassays mit aktivem Retik-Lysat zum Zeitpunkt t=0 min (Nullkontrolle) und t=60 min (Positivkontrolle)
(3-4): Ubiquitinylierungsassays mit inaktiviertem Retik-Lysat zum Zeitpunkt t=0 min (Nullkontrolle) und t=60 min. Das Retik-Lysat wurde mit 10 mM N-Ethylmaleinimid (NEM) vorbehandelt, wodurch unter anderem die Cysteine der Ubiquitin-übertragenden Enzyme reduziert und damit inaktiviert wurden. DTT inaktiviert den Überschuss an NEM.
(5) Ubiquitinylierungsreaktion des inaktiven Retik-Lysates mit zusätzlichem 6xHis-Uba1 nach t=60 min
Zusammensetzung des Mastermixes pro Ansatz:
Geminin* (1 µl), Ubiquitin (0,1 µl), FLAG-Ubiquitin (0,2 µl), 100 mM ATP (0,3 µl), MG132 (0,5 µl), UbcH5b (1 µl), aktives oder inaktiviertes Retik-Lysat (8 µl); Ansatz 5: 6xHis-Uba1 (0,5 µl)
Die Reaktionen wurden mit 10 µl 4xLSB gestoppt, aufgekocht und jeweils 10 µl auf ein 9%iges SDS-Gel aufgetragen und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Geminin*: Geminin_Del-102-192-10xHA-6xHis
2.4.3.1.1 Fehlende Drosophila-‐Komponenten APC/C und Fzr
Bisher wurden die Ubiquitinylierungsreaktionen im Retikulozytenlysat wahrscheinlich von verschiedenen E3-‐Ligasen ausgeführt. Humane-‐ bzw. Drosophila-‐spezifische Kom-‐
ponenten wurden hinzugegeben, um die Stimulierung einer unbekannten E3-‐Ligase durch das E2-‐Enyzm herbeizuführen.
In einem weiteren Etablierungsschritt zum Drosophila-‐spezifischen Ubiquitinylierungs-‐
assay sollte nun der APC/C-‐Komplex als einzige E3-‐Ligase aufgereinigt werden. In Sac-‐
charomyces cerevisiae konnte der gesamte APC/C-‐Komplex unter anderem über MYC-‐
Cdc16 und Cdc16-‐Tap gewonnen werden (Carroll, et al., 2005; Passmore, et al., 2005) und auch aus humanen HeLa-‐Zellen war eine Aufreinigung möglich (Sugimoto, et al., 2008).
Aus Drosophila sollte der APC/C-‐Komplex durch Immunpräzipitation aus adulten Flie-‐
gen, oder aus Drosophila-‐Embryonen gewonnen werden. Dazu standen transgene Flie-‐
gen zur Verfügung, die entweder GFP-‐Cdc16 oder GFP-‐Cdc27 exprimieren und freundli-‐
cherweise von Dr. Huang (University Newcastle) zur Verfügung gestellt wurden. In Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Fusionsproteine in den endogenen APC/C inkorporieren und über das Fusionsprotein mehrere Untereinheiten des APC/C präzipitiert werden können (Raff, et al., 2002). Für die Isolation des APC/C-‐Komplexes wurden adulte Fliegen homogenisiert, die GFP-‐Cdc16 exprimieren. Mit diesem Homo-‐
genisat wurde eine GFP-‐Immunpräzipitation durchgeführt. Das Präzipität konnte in einem Westernblot mit dem gleichen GFP-‐Antikörper nachgewiesen werden (Abb. 2.65 A). Während GFP-‐Cdc16 bei der vorhergesagten Größe von 106 kDa sichtbar ist, konnte GFP-‐Cdc27 nach identischen Immunpräzipitationsbedingungen nicht detektiert werden (Daten nicht gezeigt).
Um den APC/C-‐Komplex aus Drosophila in einem Ubiquitinylierungsassay aktivieren zu können, wird einer der beiden Aktivatoren Fzy oder Fzr benötigt. Beide Aktivatoren benötigen für ihre posttranslationale Faltung Chaperone (Camasses, et al., 2003), wes-‐
halb eine bakterielle Aufreinigung nicht möglich ist. Die schnellste Möglichkeit den epitopmarkierten Aktivator 4xFLAG-‐Fzr herzustellen, ist die in vitro-‐Translation im Retikulozyenlysat. Abbildung 2.65 B zeigt die Effizienz der Translation.
Mit der Immunpräzipitation von GFP-‐Cdc16 und der in vitro-‐Translation von 4xFLAG-‐
Fzr konnten zwei weitere wichtige Komponenten für den Ubiquitinylierungsassay be-‐
reitgestellt werden. Es ist jedoch noch unklar, ob über GFP-‐Cdc16 ein aktiver APC/C-‐
Komplex co-‐präzipitiert werden kann und ob das Retik-‐Lysat vom in vitro translatierten 4xFLAG-‐Fzr aufgrund der enthaltenen E3-‐Ligasen nicht störend wirkt.
Abbildung 2.65: Gewinnung der fehlenden Drosophila-Komponenten APC/C und 4xFLAG-Fzr
A: Co-Immunpräzipitation des APC/C-Komplexes über die Untereinheit GFP-Cdc16:
Die APC/C-Untereinheit GFP-Cdc16 wurde mithilfe des GFP-Epitops aus dem adulten Fliegen-stamm 430 präzipitiert und im Westernblot mit einem Antikörper sichtbar gemacht. GFP-Cdc16 hat eine Größe von 107 kDa. Die Präzipitation aus Wildtyp-Fliegen diente als Negativkon-trolle. Jeweils 15 µl der Präzipitate wurden aufgekocht und auf ein 14%iges SDS-Gel aufgetragen und mittels SDS-PAGE aufgetrennt.
B: In vitro-Translation des APC/C-Aktivators 4xFLAG-Fzr:
Der APC/C-Aktivator 4xFLAG-Fzr wurde in vitro im Retikulozytenlysat translatiert und konnte im Westernblot mit einem FLAG-Antikörper nachgewiesen werden. 4xFLAG-Fzr hat eine Größe von 57,8 kDa.
10 µl des Translationsansatzes wurde auf ein 10%iges Gel aufgetragen und mittels SDS-PAGE aufgetrennt.
2.4.3.1.2 Ubiquitinylierungsassay mit immunpräzipitiertem APC/C
In Hefen konnte der gesamte APC/C-‐Komplex über die epitopmarkierte Untereinheit Cdc16 co-‐präzipitiert werden, weshalb auch in Drosophila die Möglichkeit besteht, einen aktiven APC/C-‐Komplex über GFP-‐Cdc16 präzipitieren zu können und eine Ubiquitiny-‐
lierung mit reinen Drosophila-‐Komponenten erzeugen zu können. Dazu wurde vor je-‐
dem Experiment GFP-‐Cdc16 frisch aus den transgenen Fliegen immunpräzipitiert und die Beads mit dem gebundenen GFP-‐Cdc16 in einem 1xThioesterpuffer aufgenommen und in die entsprechenden PCR-‐Cups vorgelegt.
Da der Aktivator eine entscheidende Rolle bei der Aktivität des APC/C-‐Komplexes spielt und nicht bekannt ist, ob Fzr bei der Immunpräzipitation mit dem APC/C aufgereinigt wird, wurde ein in vitro translatiertes 4xFLAG-‐Fzr verwendet.
Um Ubiquitinylierungsbanden als solche zu erkennen, wurde in einem als Nullkontrolle bezeichneten Ansatz Geminin* ohne eine andere Komponente des Ubiqitinylierungs-‐
Systems ausschließlich mit Wasser für 60 Minuten bei 30 °C inkubiert (Abb 2.66 Spur 5). In einer Negativkontrolle wurde NEM-‐inaktiviertes Retikulozytenlysat mit IVT 4xFLAG-‐Fzr mit allen notwendigen Komponenten vereinigt, allerdings noch ohne das
präzipitierte GFP-‐Cdc16 (1). Im Vergleich zur Nullkontrolle konnte die Aktivität der E3-‐
Ligasen im Retik-‐Lysat nicht vollständig durch NEM inaktiviert werden, die Po-‐
lyubiquitinylierungsbanden im hochmolekularen Bereich waren jedoch deutlich redu-‐
zierter als im gleichen Ansatz mit aktivem Retik-‐Lysat (2).
Abbildung 2.66: Ubiquitinylierungsassay mit immunpräzipitiertem GFP-Cdc16 und 4xFLAG-Fzr
Die spezifische Ubiquitinylierung des Substrates Geminin_Del-102-192-10xHA-6xHis wurde im Westernblot mit einem HA-Antikörper sichtbar gemacht (oberer Blot). Der Nachweis des frisch hergestellten Präzipitats Cdc16 aus transgenen Fliegen erfolgte im Westernblot über GFP-Antikörper (mittlerer Blot) und 4xFLAG-Fzr wurde im Westernblot mit einem FLAG-GFP-Antikörper detektiert (unterer Blot).Bei den unteren beiden Blots handelt es sich um relevante Ausschnitte.
Das Retik-Lysat mit dem IVT 4xFLAG-Fzr wurde mit 10 mM N-Ethylmaleinimid (NEM) vorbehan-delt, und mit DTT der Überschuss an NEM entfernt.
(1): Negativkontrolle mit inaktiviertem Retikulozytenlysat nach t=60 min (2): Positivkontrolle mit aktivem Retikulozytenlysat nach t=60 min
(3, 4, 6): Ubiquitinylierungsassays mit inaktiviertem Retik-Lysat und unter Verwendung von GFP-Cdc16 zum Zeitpunkt t=60 min. Eingesetzt wurden humanes E1-Enzym (3) und Uba1-6xHis (4), bzw. kein E1-Enzym (6).
(5) Nullkontrolle: reines Substrat Geminin* nach t=60 min
(7-8): Drosophila Ubiquitinylierungsassay, mit dem APC/C als einzige E3-Ligase, ohne Retik-Lysat aber auch ohne Aktivator Fzr. Nullkontrolle nach t=60 min (7) und nach t=60 min
Zusammensetzung des Mastermixes pro Ansatz:
Geminin* (2 µl), Effete-6xHis (1 µl), Ubiquitin (0,1 µl), FLAG-Ubiquitin (0,2 µl), 100 mM ATP (0,3 µl)
Separat zugegeben: aktives oder NEM-inaktiviertes Retik-Lysat mit IVT 4xFLAG-Fzr (8 µl); hu-manes E1-Enzym bzw. 6xHis-Uba1 (1 µl), GFP-Cdc16 Präzipitat (8 µl); Ansatz 5, 7 und 8: Thio-esterpuffer (8 µl)
Die Reaktionen wurden mit 10 µl 4xLSB gestoppt, aufgekocht und jeweils 10 µl auf ein 9%iges SDS-Gel aufgetragen und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Geminin*: Geminin_Del-102-192-10xHA-6xHis
In einem weiteren Schritt wurde zum inaktivierten Retikulozytenlysat das präzipitierte GFP-‐Cdc16 gegeben, wodurch die Polyubiquitinylierung von Geminin* zunahm (3).
Dieses Ergebnis lässt die Möglichkeit offen, dass durch GFP-‐Cdc16 der vollständige APC/C-‐Komplex präzipitiert werden konnte. Allerdings zeigte sich kein Unterschied, ob das humane E1-‐Enzym verwendet wurde (3), das Drosophila 6xHis-‐Uba1 eingesetzt wurde (4) oder kein E1-‐Enzym hinzugegeben wurde (6).
Nachdem die E3-‐Ligasen im Retikulozytenlysat keine klare Aussage bezüglich der Po-‐
lyubiquitinylierung von Geminin* durch den APC/C-‐Komplex zulassen, wurde eine Reaktion ohne Retik-‐Lysat angesetzt. Dazu wurde das GFP-‐Cdc16-‐Präzipitat mit allen Komponenten des Ubiquitinylierungs-‐Systems versetzt und mit 1xThioesterpuffer auf das ursprüngliche Volumen aufgefüllt. In diesem Ansatz fehlte der Aktivator Fzr, was eine Erklärung dafür sein könnte, warum nach 60 Minuten Inkubation kein Unterschied zur Nullkontrolle in der Polyubiquitinylierung von Geminin* zu erkennen ist (7 und 8).
In diesem Experiment konnte mit dem Präzipitat von GFP-‐Cdc16 eine Polyubiquitinylie-‐
rung von Geminin* nachgewiesen werden. Allerdings waren in diesem Ansatz auch die E3-‐Ligasen des Retikulozytenlysates enthalten, weshalb in Frage gestellt werden muss, ob für die Reaktion der Aktivator 4xFLAG-‐Fzr im Retik-‐Lysat oder das Retik-‐Lysat selber verantwortlich ist.