2 Ergebnisse
2.2 Rca1 – ein Substrat des Anaphase-‐Promoting-‐Komplex
2.3.2 Rca1 – Eingrenzung der Abbausequenz
2.3.2.5 Das kleinste abbaubare Fragment (KAF)
Erst bei einer weiteren Verkürzung auf 143 Aminosäuren bei HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐
203_Del-‐268-‐411 (g) kommt es zu einer signifikanten Stabilisierung.
Nachdem die Aktivität der Rca1-‐Derivate unabhängig von der Länge der C-‐terminalen Deletion verloren ging, scheint das C-‐terminale Ende entweder für die Ausbildung der Zink-‐Binde-‐Region notwendig zu sein, oder aber die C-‐terminale Region unabhängig von der ZBR-‐Domäne für die Aktivität von Rca1 benötigt zu werden. Für den Abbau spielt die Region aber augenscheinlich keine Rolle.
2.3.2.5 Das kleinste abbaubare Fragment (KAF)
Aus den C-‐terminalen Rca1-‐Deletionen wurde HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐203_Del-‐299-‐
411 als das kleinste, noch abbaubare Rca1-‐Fragment ausgemacht (Abb. 2.39). Eine weitere Verkürzung des C-‐Terminus hat eine deutliche Stabilisierung zur Folge. Mit einem Wert von 0,84 liegt HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐203_Del-‐268-‐411 in der G1-‐Phase nahezu stabil vor. Auch eine weitere Verkürzung von der N-‐terminalen Seite führt zu einem stabilen Rca1-‐Derivat (Abb. 2.39 c). HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐220_Del-‐299-‐411 ist mit einem Wert von 0,95 aus den Berechnungen der Durchflusszytometrie-‐Daten annähernd so stabil wie die Kontrolle HA-‐NLS-‐GFP.
Mit HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐203_Del-‐299-‐411 konnte das kleinste abbaubare Fragment (KAF) von Rca1 gefunden werden. Eine weitere Verkürzung sowohl vom N-‐Terminus als
Abbildung 2.39: Die relative G1-Stabilität des kleinsten-abbaubaren-Fragments A: Schematische Darstellung der untersuchten Rca1-Derivate:
a) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-203_Del-299-411, b) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-203_Del-268-411, c) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-221_Del-299-411
B: Bestimmung der relativen G1-Stabilität. Verhältnis der Cherry-positiven Zellen 1C/2C. Werte
<1 bedeuten, dass das entsprechende Protein in der G1-Phase instabiler als das Kontrollpro-tein HA-NES-3xCherry ist. Die Zahlen innerhalb der Balken geben die Anzahl unabhängiger Messungen an, dargestellt sind ebenfalls die Standardabweichungen der einzelnen Messun-gen.
Die Berechnung der relativen Rca1-Funktionalität ergab für jede Rca1-Deletion einen Wert für ein inaktives Rca1-Derivat. Die erhaltenen Werte der Durchflusszytometrie stimmen mit den Werten aus den Abbaukurven überein (nicht gezeigt).
auch vom C-‐Terminus führte zu einer deutlichen Stabilisierung in der G1-‐Phase.
Zwar konnte eine Abbausequenz weiter eingegrenzt werden, aber es ist weiterhin un-‐
klar, wo die Abbausequenz in diesem verkürzten Rca1-‐Fragment lokalisiert ist. Es könn-‐
te sich hier um zwei Abbausequenzen handeln die synergistisch wirken, ebenso denkbar ist es, dass es sich hier um eine Abbausequenz handelt, die über Faltung erst in räumli-‐
che Nähe gebracht wird.
2.3.2.5.1 Die kleinsten Rca1-‐Fragmente
Um der Frage nachzugehen, welcher der beiden Bereiche eine größere Bedeutung für den Abbau trägt, wurden weitere Deletionen erstellt und auf G1-‐Stabilität hin überprüft.
Dazu wurde ausgehend vom kleinsten abbaubaren Fragment HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐
203_Del-‐299-‐411 (a) und von dem C-‐terminal verkürzten Rca1-‐Fragment HA-‐NLS-‐GFP-‐
Rca1_Del-‐1-‐203_Del-‐268-‐411 (d) jeweils zwei weitere N-‐terminale Deletionen um 220 und 234 Aminosäuren erstellt.
Abbildung 2.40: Relative G1-Stabilität der kleinsten Rca1-Fragmente A: Schematische Darstellung der untersuchten Rca1-Derivate:
a) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-203_Del-299-411, b) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-220_Del-299-411, c) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-234_Del-299-HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-220_Del-299-411, d) 203_Del-267-411, e) 220_Del-203_Del-267-411, f) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-234_Del-267-411
B: Bestimmung der relativen G1-Stabilität
Die Berechnung der relativen Rca1-Funktionalität ergab für jede C-terminale Rca1-Deletion einen Wert für ein inaktives Rca1-Derivat. Die erhaltenen Werte der Durchflusszytometrie stimmen mit den Werten aus den Abbaukurven überein (nicht gezeigt).
In beiden Fällen kommt es zu einer Stabilisierung, sobald zusätzlich der N-‐terminale Bereich deletiert wird (Abb. 2.40 b, c und e, f). In diesem Bereich ist die konservierte KEN-‐Box lokalisiert, die oftmals als Erkennungssequenz von APC/C-‐Substraten dient.
Eine Deletion in der C-‐terminalen Region führt trotz intakter KEN-‐Box zu einer deutli-‐
chen Stabilisierung (Abb. 2.40 d), was einen Hinweis darauf gibt, dass die KEN-‐Box für den Abbau zwar notwendig ist, aber durch die Region im C-‐terminalen Teil unterstützt wird. Erst die Deletion der KEN-‐Box führt zu einer vollständigen Stabilisierung (Abb. 2.40 e, f).
2.3.2.5.2 Punktmutationen im kleinsten-‐abbaubaren-‐Fragment
Ein Sequenzvergleich des kleinsten, noch abbaubaren Rca1-‐Fragmentes Rca1_Del-‐1-‐
203_Del-‐299-‐411 (Abb. 2.41 A) in verschiedenen Drosophila-‐Spezies lieferte im N-‐
terminalen Bereich eine hohe Konservierung bis einschließlich zur KEN-‐Box. Interes-‐
santerweise befindet sich auch im C-‐Terminus zwischen den Aminosäuren 264-‐288 ein Bereich mit einer auffallend hohen Konservierung (Abb. 2.41 B-‐D). Im humanen Rca1-‐
Ortholog Emi1 konnte eine sogenannte Linkerregion identifiziert werden, die als Unter-‐
stützung für die schwache D-‐Box-‐Domäne für eine korrekte Platzierung von Emi1 am APC/C-‐Komplex sorgt (Frye, et al., 2013). Der konservierte Bereich der Linkerregion liegt bei Emi1 zwischen D-‐Box und ZBR-‐Domäne. Wird die Lage dieser Linkerregion mit der konservierten Region in Rca1 zwischen den Aminosäuren 264-‐288 verglichen, können Analogien gefunden werden. So befindet sich der konservierte Bereich in Rca1 zwischen KEN-‐Box und ZBR. Aufgrund der ähnlichen Funktion zu Emi1 könnte es sich bei Rca1 ebenfalls um eine Linkerregion handeln, die für eine stabile Anlagerung und vor allem richtige Positionierung von Rca1 an den APC/CFzr notwendig ist, damit die ZBR den APC/C-‐Komplex inhibieren kann. In dieser Region wurden eine Reihe von Punktmutationen eingefügt, die zu einem Austausch von geladenen und polaren Amino-‐
säuren zu Alanin führen.
Über die Funktion dieses konservierten Bereiches in Rca1 ist noch nichts bekannt. Auf-‐
grund der ähnlichen Funktion zu Emi1 könnte es sich bei Rca1 ebenfalls um eine Lin-‐
kerregion handeln, die für eine stabile Anlagerung und vor allem richtige Positionierung von Rca1 an den APC/CFzr notwendig ist, damit die ZBR den APC/C-‐Komplex inhibieren kann. Ebenso gut könnte diese Region eine zusätzliche Abbausequenz für Rca1 darstel-‐
len, die mit anderen Abbausequenzen unterstützend auf den Abbau wirkt.
Abbildung 2.41: Einfluss der Punktmutationen auf die relative G1-Stabilität A: Schematische Darstellung der untersuchten Region der Punktmutanten
B: Sequenzvergleich von Rca1_Del-1-203_Del-299-411 mit anderen Drosophila-Spezies Dargestellt ist der Sequenzvergleich des kleinsten, noch abbaubaren Rca1-Fragments Rca1_Del-1-203_Del-299-411 aus Drosophila melanogaster (oberste Reihe) mit verschiede-nen Drosophila-Spezies. Die Region der Punktmutanten von Aminosäure 264 bis 288 ist schwarz eingerahmt. Die Pfeile unterhalb des Sequenzvergleiches markieren die untersuchten Punktmutanten.
C: Gattung- und Art der Drosophila-Spezies in der Sequenzanalyse
D: Stammbaum für den Verwandschaftsgrad der verschiedenen Drosophila-Spezies E: Bestimmung der relativen G1-Stabilität der Punktmutanten
Die Berechnung der relativen Rca1-Funktionalität ergab für alle Punktmutanten einen Wert für ein inaktives Rca1-Derivat. Die erhaltenen Werte der Durchflusszytometrie stimmen im Rah-men der Standardabweichung mit den Werten aus den Abbaukurven überein (nicht gezeigt).
*KAF: kleinstes abbaubares Fragment (HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-203_Del-299-411; siehe A)
Die relativen G1-‐Stabilitäten der Punktmutanten im Vergleich zum kleinsten, noch ab-‐
baubaren Fragment (KAF) sind in Abbildung 2.41 E dargestellt. Im Vergleich zur G1-‐
Stabilität von HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐203_Del-‐299-‐411 (G1-‐Stabilitätswert von 0,56), führen Punktmutationen in der Linkerregion in den meisten Fällen zu einer Destabili-‐
sierung. Eine Ausnahme stellt die Doppelmutante R275A_K277A dar, die zu einer Stabi-‐
lisierung des kleinsten abbaubaren Fragmentes führt (G1-‐Stabilitätswert von 0,70).
Werden die beiden Punktmutationen einzeln betrachtet, kann für beide eine Stabilisie-‐
rung nachgewiesen werden, die in beiden Fällen mit 0,68 bzw. 0,71 sehr ähnlich ausfällt (Abb. 2.42 c, d). Dies bedeutet, dass beide positiv geladenen Aminosäuren zusammen für einen effizienten Abbau notwendig sind.
Interessanterweise kann die Stabilisierung durch die KEN-‐Box-‐Mutation KEN-‐KAA mit der Punktmutation K277A nicht weiter stabilisiert werden (Abb. 2.42 d, e, f).
Abbildung 2.42: Einfluss der Punktmutation K277A auf die relative G1-Stabilität A: Schematische Darstellung der untersuchten Rca1-Punktmutanten:
a) 411, b) GFP-Rca1_Del-1-203_Del-299-411_R275A_K277A, c) GFP-Rca1_Del-1-203_Del-299-411_R275A, d) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-203_Del-299-411_K277A, e) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-203_Del-299-411_KEN-KAA, f) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-203_Del-299-411_KEN-KAA_K277A,
B: Bestimmung der relativen G1-Stabilität
Die Berechnung der relativen Rca1-Funktionalität ergab für jede Rca1-Mutante einen Wert für ein inaktives Rca1-Derivat. Die erhaltenen Werte der Durchflusszytometrie stimmen mit den Werten aus den Abbaukurven überein (nicht gezeigt).
2.3.2.5.3 Destabilisierung durch Argininmutation
Die Punktmutation R280A führte den Berechnungen der G1-‐Stabilität zufolge zu einer stärkeren Destabilisierung (Abb. 2.43 b). Dieser Effekt könnte mit der starken Verände-‐
rung der positiv geladenen Guanidingruppe bei Arginin zu einer kurzen, hydrophoben Seitenkette bei Alanin zusammenhängen. Die Veränderung der Ladung und der Größe kann einen Einfluss auf die benachbarten Aminosäuren besitzen, weshalb in einem weiteren Austausch in die Arginin-‐ähnliche Aminosäure Lysin die G1-‐Stabilität erneut überprüft werden sollte.
Wie sich herausstellte, zeigte die Punktmutation R280K einen geringeren Destabilisie-‐
rungseffekt als die Punktmutation R280A. Mit dem Wert von 0,28 weist die Punktmu-‐
tante aber weiterhin eine deutliche Destabilisierung auf. In der Sequenzanalyse aus Abbildung 2.41 liegt das mutierte Arginin genau in dem Bereich der höchsten Konser-‐
vierung, weshalb dem Arginin möglicherweise eine wichtige Funktion in der Linkerre-‐
gion zuteil wird.
Mit den bisherigen Untersuchungen konnte die Abbausequenz auf ein kleines Rca1-‐
Fragment der Aminosäuren 203-‐299 eingegrenzt werden. In dieser Region konnten zwei Domänen identifiziert werden, die mit dem Abbau in Verbindung stehen. Zum einen führt die Mutation der KEN-‐Box zu einer Stabilisierung des kurzen Fragments, zum anderen spielt dabei die Linkerregion eine Rolle, da die Punktmutanten R275A und K277A genauso wie die KEN-‐Box-‐Mutation in der Lage sind, das kurze Fragment zu stabilisieren. Punktmutationen an anderer Stelle der Linkerregion ermöglichten eine Destabilisierung, besonders deutlich war dieser Effekt bei der Punktmutante R280A zu sehen.
Abbildung 2.43: Einfluss der Arginin-Punktmutanten auf die relative G1-Stabilität A: Schematische Darstellung der untersuchten Rca1-Punktmutanten:
a) 411, b) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-203_Del-299-411_R280A, c) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-203_Del-299-411_R280K
B: Bestimmung der relativen G1-Stabilität
Die Berechnung der relativen Rca1-Funktionalität ergab für jede Rca1-Mutante einen Wert für ein inaktives Rca1-Derivat. Die erhaltenen Werte der Durchflusszytometrie stimmen mit den Werten aus den Abbaukurven überein (nicht gezeigt).
Bisher lag der Fokus auf dem C-‐terminalen Rca1. Die Rolle der N-‐terminalen Abbause-‐
quenz von Rca1 sollte im Folgenden näher charakterisiert werden.