2 Ergebnisse
2.2 Rca1 – ein Substrat des Anaphase-‐Promoting-‐Komplex
2.3.2 Rca1 – Eingrenzung der Abbausequenz
2.3.2.7 N-‐terminales Rca1 mit N-‐terminalen Verkürzungen
Bisher lag der Fokus auf dem C-‐terminalen Rca1. Die Rolle der N-‐terminalen Abbause-‐
quenz von Rca1 sollte im Folgenden näher charakterisiert werden.
2.3.2.6 N-‐ und C-‐terminales Rca1
Die Abbausequenz im C-‐terminalen Rca1 wurde entdeckt, als von Rca1 zwei Deletionen erstellt wurden, die das Rca1 in zwei Hälften spaltete (Abb. 2.44 A). Von beiden wurde die relative G1-‐Stabilität bestimmt und die Rca1-‐Funktionalität überprüft. Dabei stellte sich heraus, dass beide Teile von Rca1 eine eigene Abbausequenz enthalten, da sowohl der C-‐Terminus HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐203 (b), als auch der N-‐Terminus HA-‐NLS-‐
GFP-‐Rca1_Del-‐204-‐411 (c) in nahezu gleicher Weise abgebaut werden. Die relative Rca1-‐Funktionalität weist nur das C-‐terminale Fragment von Rca1 mit der intakten ZBR als aktiv aus, dennoch wurde von beiden Hälften die Abbaukurven erstellt, um sie direkt miteinander vergleichen zu können. Die N-‐ und C-‐terminalen Rca1-‐Fragmente zeigen einen sehr ähnlichen Abbau und erreichen in den Abbaukurven nach 200 Minuten Wer-‐
te von 0,40 und 0,44. Damit unterscheiden sie sich jedoch deutlich in der Abbaukinetik von HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1, das nach viel kürzerer Zeit (t=150 min) bereits den Wert von 0,22 erreicht (Abb. 2.44 C-‐E). Es ist wahrscheinlich, dass für einen effektiven Abbau beide Abbausequenzen zusammenwirken müssen.
Für die Suche nach der Abbausequenz im N-‐terminalen Teil von Rca1 wurden deshalb N-‐terminale Deletionen erstellt.
2.3.2.7 N-‐terminales Rca1 mit N-‐terminalen Verkürzungen
Die Suche nach der Abbausequenz im N-‐terminalen Rca1 erfolgte durch N-‐terminale Deletionen ausgehend von HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐204-‐411 (Abb. 2.45 a). Dabei wurden bis zur NLS-‐Sequenz die Deletionen in 25er Aminosäureschritten erstellt: HA-‐NLS-‐GFP-‐
Rca1_Del-‐1-‐25_Del-‐204-‐411 (b), HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐50_Del-‐204-‐411 (c), HA-‐NLS-‐
GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐75_Del-‐204-‐411 (d) und HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐100_Del-‐204-‐411 (e).
Weitere Deletionen wurden direkt vor der NLS-‐Sequenz HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐
115_Del-‐204-‐411 (f) und direkt nach der NLS-‐Sequenz HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐
133_Del-‐204-‐411 (g) durchgeführt. Das kürzeste N-‐terminale Fragment beinhaltete nur die F-‐Box-‐Domäne HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐154_Del-‐204-‐411 (h). Da der N-‐terminale Bereich von Rca1 keine ZBR mehr besitzt, handelt es sich bei den untersuchten N-‐
terminalen Deletionen um inaktive Rca1-‐Derivate, die keine Rca1-‐Funktionalitäten mehr aufweisen. Die Bestimmung der G1-‐Stabilitäten ergab ein uneinheitliches Bild
(Abb. 2.45 B). Während die Deletion von 25 und 50 Aminosäuren keine Auswirkung auf die Stabilität besitzt, liegt HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐75_Del-‐204-‐411 (d) mit dem Wert von 0,94 in der G1-‐Phase stabil vor. Weitere Verkürzungen führten jedoch wieder zu einer Destabilisierung (HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐100_Del-‐204-‐411 (e) und HA-‐NLS-‐GFP-‐
Rca1_Del-‐1-‐115_Del-‐204-‐411 (f) während HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐133_Del-‐204-‐411 wiederum sehr stabil erscheint.
Auffällig war, dass im Durchflusszytometer bei den N-‐terminalen Derivaten signifikant weniger GFP-‐positive Zellen detektiert werden konnten. Dies deutet darauf hin, dass eine generelle Zellzyklus-‐unabhängige Instabilität vorliegt. Damit können die Werte aus der Durchflusszytometrie nur mit Vorsicht interpretiert werden.
Abbildung 2.44: Relative G1-Stabilität von N- und C-terminalem Rca1 A: Schematische Darstellung der untersuchten Rca1-Deletionen
a) HA-NLS-GFP-Rca1, b) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-203, c) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-204-411
B: Bestimmung der relativen G1-Stabilität
Die Zahlen innerhalb der Balken geben die Anzahl unabhängiger Messungen an, dargestellt sind ebenfalls die Standardabweichungen der einzelnen Messungen.
C: Abbaukurven der verschiedenen Proteine (Mittelwerte von 10 Zellen). Der Zeitpunkt t=200 min nach Beginn der Anaphase wurde als Referenzpunkt gewählt. Zu dieser Zeit ist der Abbau von Rca1 nahezu abgeschlossen und die meisten Zellen sollten sich noch in der G1-Phase befinden.
D: Relative Fluoreszenzwerte der Abbaukurven von C zum Zeitpunkt t=200 min
E: Direkter Vergleich der ermittelten Werte für die Stabilität der Rca1-Derivate in G1 zwi-schen Durchflusszytometer (B) und den Abbaukurven (C+D)
Auch im live-‐cell-‐imaging kam es bei diesen Derivaten zu Unregelmäßigkeiten. So zeigte der t=200 Wert bei HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐25_Del-‐204-‐411 (b) eine Stabilisierung an, obwohl dieses Protein noch gut abgebaut wird, da der t=400 Wert bei 0,25 lag. Weiter-‐
Abbildung 2.45: Die relative G1-Stabilität N-terminaler Rca1-Deletionen A: Schematische Darstellung der untersuchten N-terminalen Rca1-Deletionen:
a) NLS-GFP-Rca1_Del-204-411, b) NLS-GFP-Rca1_Del-1-25_Del-204-411, c) NLS-GFP-Rca1_Del-1-50_Del-204-411, d) NLS-GFP-Rca1_Del-1-75_Del-204-411 e) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-100_Del-204-411, f) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-115_Del-204-411, g) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-133_Del-204-411, h) HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-154_Del-204-411 B: Bestimmung der relativen G1-Stabilität
Die Zahlen innerhalb der Balken geben die Anzahl unabhängiger Messungen an, dargestellt sind ebenfalls die Standardabweichungen der einzelnen Messungen.
C: Relative Fluoreszenzwerte der Abbaukurven zum Zeitpunkt t=200 min
** b) der Wert der Abbaukurve zeigt ein stabilisiertes Protein an, was allerdings ein etwas verzerrtes Bild darstellt. Der minimale Wert der 10 Einzelkurven von HA-NLS-GFP-Rca1_Del-1-25_Del-204-411 liegt zum Zeitpunkt t=400 min bei 0,25. Dies zeigt, dass es durchaus noch abgebaut werden kann.
D: Direkter Vergleich der ermittelten Werte für die Stabilität der Rca1-Derivate in G1 zwischen Durchflusszytometer (B) und den Abbaukurven (C)
hin wurde bei HA-‐NLS-‐GFP-‐Rca1_Del-‐1-‐115_Del-‐204-‐411 (f) ein Wert über 1,0 gemes-‐
sen. Schließlich fallen in beiden Messungen (Durchflusszytometer und live-‐cell-‐imaging) die Werte vom Derivat, das nur noch die F-‐Box Domäne besitzt (h) heraus. In beiden Fällen wird das Derivat noch relativ gut abgebaut. Die Gründe für diese Variabilität konnten nicht klar bestimmt werden, generelle Instabilität spielt hier sicher eine wich-‐
tige Rolle.
Aufgrund dieser Ergebnisse lässt sich keine eindeutige Aussage über die Lokalisierung der Abbausequenz treffen. Eine deutliche Stabilisierung sowohl in der Durchflusszyto-‐
metrie als auch in Abbaukurven konnte bei der Deletion der ersten 75 Aminosäuren beobachtet werden, während die Deletion von 50 Aminosäuren noch gut abgebaut wurde (c und d). Um zu überprüfen, ob in dem Bereich zwischen den Aminosäuren 50 und 75 eine mögliche Abbausequenz liegt, wurden weitere N-‐terminale Rca1-‐Deletionen erstellt.