4 Methoden
4.2 Arbeiten mit Hefe (Saccharomyces cerevisiae)
und erneut abzentrifugiert (4000 UpM, 10 min). Nach Wiederaufnahme in 2 ml 10%igen Glycerin wurden die Zellen in 100 µl Fraktionen zur Lagerung bei -‐80 °C eingefroren.
4.2 Arbeiten mit Hefe (Saccharomyces cerevisiae)
Für das Hefe-‐Zwei-‐Hybrid-‐System wurde mit den beiden Stammhintergründen AH109 und Y187 des Matchmaker™ GAL4 Two-‐Hybrid System 3 (Clontech) gearbeitet
.
4.2.1 Kultivierung von Hefestämmen in Flüssigmedium
Für die Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae wurde XY-‐Vollmedium verwendet, das je nach Verwendung 2% Glukose (D), Galaktose (G) oder Raffinose (R) als Kohlen-‐
stoffquelle enthielt (5.7.2). Stämme mit aufgenommenem Plasmid wurden unter Selek-‐
tionsdruck in einem Selektionsmedium entsprechend dem Selektionsmarker (HIS3, LEU2, TRP1, URA3) kultiviert. Derart ist auch eine Selektion auf mehrere Plasmide mög-‐
lich. Dies kommt u.a. beim Hefe-‐Zwei-‐Hybrid-‐System zur Anwendung (4.2.4). Für expe-‐
rimentelles Arbeiten wurden über Nacht Vorkulturen in einem Volumen von 5 ml bei 25 °C angezogen. Die Kultivierung von größeren Kulturen fand in Erlenmeyerkolben im Wasserschüttelbad bei 25 °C statt.
4.2.2 Aufbewahrung von Hefestämmen
Hefestämme können einige Wochen bei 4 °C auf Selektionsplatten aufbewahrt werden.
Um sie jedoch dauerhaft zu konservieren, wurden 2 ml einer Übernachtkultur in XYD-‐
Medium geerntet, in 1 ml 15%igem Glycerin aufgenommen und bei -‐70 °C eingefroren.
4.2.3 Hefetransformation nach der Lithiumacetat-‐Methode
Hefezellen werden durch eine Behandlung mit Lithiumacetat-‐Ionen kompetent für die Aufnahme fremder DNA gemacht (Gietz und Woods, 2002).
Dazu wurden 2 ml einer logarithmisch wachsenden Kultur (OD600 von ca. 0,7-‐1) abzent-‐
rifugiert (2000 UpM, 2 min) und zweimal in 1 ml sterilem H2Odest gewaschen. Nach Abnahme des Überstandes wurde der vorbereitete Transformationsmix
50% PEG 3350 240 μl gemischt. Der Transformationsansatz wurde für 20 Minutenbei Raumtemperatur gerol-‐
lert und anschließend 15 Minutenlang bei 42 °C im Heizblock inkubiert. Die Zellen wur-‐
tenz zu ermöglichen. Danach wurden die Stämme wie oben beschrieben abzentrifugiert, in sterilem Wasser aufgenommen und auf entsprechende Selektionsplatten ausplattiert.
Nach einer Inkubationszeit von 2-‐3 Tagen waren Transformanden auf den Platten zu
und die Transkription der Reportergene LEU2 und lacZ bleibt abgeschaltet (Abb. 4.1 A und B).
Erst durch ihr gemeinsames Zusammenwirken kommt es zum Transkriptionsstart. Im Hefe-‐Zwei-‐Hybrid-‐System wurden die beiden Domänen auf zwei verschiedene Plasmide verteilt und mit unterschiedlichen Proteinen gekoppelt. In einer Suche können so sämt-‐
liche Proteine miteinander auf Interaktion getestet werden. Findet zwischen zwei Prote-‐
inen keine Interaktion statt, wird auch die Transkription nicht aktiviert (Abb. 4.1 C).
Erst wenn beide Proteine miteinander interagieren, wird durch das Zusammenspiel der DNA-‐Bindedomäne und der Transkriptionsaktivatordomäne die Expression der Re-‐
portergene angeschaltet (Abb. 4.1 D). LEU2 kodiert für ein essentielles Genprodukt im Leucin-‐Biosyntheseweg, so dass Hefen nur bei interagierenden Proteinen auf Agarplat-‐
ten ohne Leucin wachsen können (Wachstumstest). lacZ kodiert für die β-‐Galaktosidase aus E. coli. Dieses Enzym kann die chromogene Substanz X-‐Gal hydrolysieren, wodurch ein blaues Endprodukt entsteht (Farbnachweis).
Im Rahmen dieser Arbeit wurde als Hefe-‐Zwei-‐Hybrid-‐System das MatchmakerTM GAL4-‐
Two-‐Hybrid-‐System 3 (Clontech) verwendet, um die Interaktion der APC/C-‐
Untereinheit Cdc23 mit Rca1 nachzuweisen. Dazu wurden vor die „multiple cloning site“
(MCS) der beiden Hefe-‐Zwei-‐Hybrid-‐Vektoren pGADT7 (2µ, Leu2) und pGBKT7 (2µ, Trp1) zuerst verschiedene Einfach-‐ und Mehrfachepitope (HA, FLAG, Myc) kloniert und in diese Vektoren sowohl Rca1 als auch Cdc23 gebracht, um sowohl AD-‐Rca1 – BD-‐
Cdc23 als auch BD-‐Rca1 – AD-‐Cdc23 auf Interaktion testen zu können. Alle Konstrukte stehen dabei unter der Kontrolle des konstitutiven ADH1-‐Promotors und sind N-‐
terminal an die Aktivierungs– (im pGADT7-‐Vektor) und die DNA-‐Bindedomäne (im pGBKT7-‐Vektor) fusioniert.
Die beiden Plasmide wurden in zwei unterschiedliche Hefestämme transformiert, pGADT7-‐Vektoren in den Mat a-‐Stamm AH109, pGBKT7-‐Vektoren in den Mat α-‐Stamm Y187. Als Positivkontrolle diente eine Hefekreuzung beider Stämme mit den Vektoren pGADT7-‐T und pGBKT7-‐p53, als Negativkontrolle pGADT7-‐Lam mit pGBKT7-‐p53. Um eine Autoaktivierung ausschließen zu können, wurden außerdem jeweils die Aus-‐
gangsvektoren (Leervektoren) mit dem Gegenvektor kombiniert (5.10.1 und 5.10.5).
4.2.4.1 X-‐Gal-‐Reaktions-‐Nachweis
Um die Interaktion zwischen zwei Proteinen im X-‐Gal-‐Platten-‐Assay nachweisen zu können, macht man sich den Umstand zunutze, dass beide Stämme AD109 und Y187 unter GAL1 (URA3::GAL1UAS-‐GAL1TATA-‐lacZ) bzw. MEL1 (URA3::MEL1UAS-‐MEL1 TATA-‐
lacZ) Promotorkontrolle lacZ herstellt. Dies geschieht allerdings nur, wenn der Tran-‐
skriptionsfaktor GAL4 an die UAS bindet. Damit GAL4 binden kann, müssen die beiden Fusionsproteine mit der Aktivator-‐ (pGADT7) und der Bindedomäne (pGBKT7) jedoch miteinander interagieren.
Durch die Verwendung der chromogenen Substanz X-‐Gal (5-‐Brom-‐4-‐chlor-‐3-‐indoxyl-‐β-‐
D-‐galactopyranosid) kann die Expression von β-‐Galaktosidase auf den Selektivplatten nachgewiesen werden. Dabei spaltet das Enzym β-‐Galaktosidase das Substrat X-‐Gal zu einem blauen Farbstoff als Abbauprodukt. Eine Blaufärbung zeigt somit eine Interaktion der zu untersuchenden Fusionsproteine an.
Für den X-‐Gal-‐Farbassay wurden die haploiden Hefestämme zuerst miteinander ge-‐
kreuzt und auf Selektivplatten SD-‐Leu-‐Trp (Kontrollplatte ohne Galaktose) und SRG-‐
Leu-‐Trp (mit Galaktose) ausgestrichen.
Nach Inkubation der Platten bei 30 °C für zwei bis drei Tage wurden die SRG-‐His-‐Trp-‐
Platten mit 10 ml folgender Komponenten überschichtet:
1% Agarose 5 ml 1 M Natriumphosphat-‐Puffer, pH 7,0 5 ml DMFA 600 μl 10% SDS 100 μl X-‐Gal (20 mg/ml in DMFA) 75 μl
Nach einer weiteren Inkubationszeit von 24 h bei 30 °C wurden die Platten auf 4 °C gelagert bis eine Blaufärbung eintrat.
4.2.4.2 Wachstumstest
Für den Wachstumstest wurden die diploiden Hefezellen auf Selektivmedium SD-‐Leu-‐
Trp-‐His-‐Ade ausgestrichen. Dabei dienten Leucin und Tryptophan als Selektionsmarker auf die beiden Plasmide pGADT7 und pGBKT7 und Histidin und Adenin zur Überprü-‐
fung der Interaktion zwischen den Fusionsproteinen. Das Wachstum des Hefestammes ist nur dann gewährleistet, wenn durch die Interaktion beider Fusionsproteine der Transkriptionsfaktor GAL4 die Auxotrophie der beiden Ausgangsstämme AD109 und Y187 (LYS2::GAL1UAS-‐GAL1TATA-‐HIS3, GAL2UAS-‐GAL2TATA-‐ADE2) komplementieren kann.
Der Vorteil des Wachstumstests ist seine Sensitivität gegenüber den Farbassays. So reicht eine geringe Interaktion beider Fusionsproteine bereits aus, um ein Wachstum zu ermöglichen.