Sequenzanalyse der PDAT aus Mikroalgen

Der bei der Datenbanksuche identifizierte Leserahmen der möglichen PDAT aus O. tauri mit 1998 bp codiert für ein Protein mit 665 Aminosäuren. Daraus ergibt sich ein Molekulargewicht von 73,2 kDa. Der offene Leserahmen der OtPDAT war in der Datenbank unvollständig annotiert. Der dort annotierte Leserahmen mit 1542 bp ist deutlich kürzer als die offenen Leserahmen der meisten bisher bekannten PDAT, die eine durchschnittliche

At3g03310

0,1

Die Identitäts- und Ähnlichkeitswerte der OtPDAT zu PDAT aus Pflanzen und Hefen sind in Tab. 23 aufgeführt. Zu der bisher nicht charakterisierten PDAT aus O. lucimarinus besteht eine Identität von 67 %. Des Weiteren bestehen sowohl zu den pflanzlichen PDAT als auch zu der PDAT aus S. pombe vergleichbare Identitätswerte von 28 bis 30 %.

Tab. 23 Identitäts- und Ähnlichkeitswerte der OtPDAT zu PDAT aus Pflanzen und Hefen.

Grau hinterlegt sind die jeweils zwei höchsten Werte. Während die Identitätswerte den prozentualen Anteil von ausschließlich identischen Aminosäuren angeben, geben die Ähnlichkeitswerte den prozentualen Anteil sowohl identischer als auch isofunktioneller Aminosäuren an. Die Berechnungen wurden mit dem Programm VecorNTI^® Suite v10.0 durchgeführt.

OlPDAT At3g44830 At5g13640 PpPDAT MtPDAT SpPDAT

OtPDAT 67 % / 76 % 28 % / 41 % 28 % / 42 % 23 % / 32 % 29 % / 42 % 30 % / 45 %

Elf charakteristische konservierte Bereiche sind in Abb. 34 markiert. Die Proteine der LCAT-Superfamilie weisen zumindest in einigen wenigen Bereichen eine hohe Ähnlichkeit zueinander auf. Dies zeigt sich vor allem anhand von vier konservierten Bereichen (I, IV, V und XI in Abb. 34 B), die zwischen allen Enzymen konserviert sind. Ferner existieren zwölf hochkonservierte Aminosäuren, die in allen Proteinen dieser Superfamilie vorhanden sind (schwarz hinterlegt unterhalb des Alignments in Abb. 34 A). Drei dieser Aminosäuren bilden die sogenannte katalytische Triade der LCAT-Superfamilie (Peelman et al., 1998). Bezogen auf die Aminosäuresequenz der OtPDAT sind es die Reste S297 (Serin), D560 (Aspartat) und H613 (Histidin), die am Transfer von Fettsäuren der sn-2-Position von PtdCho beteiligt sind.

Eine Besonderheit der möglichen PDAT aus O. tauri und O. lucimarinus tritt im hoch-konservierten Bereich V auf. Dort befindet sich in allen bisher bekannten Mitgliedern der LCAT-Superfamilie eine Position stromabwärts des für die katalytische Aktivität wichtigen S297 stets ein Methioninrest oder ein Leucinrest. OtPDAT und OlPDAT besitzen in diesem äußerst hochkonservierten Bereich stattdessen ein Tyrosin (Abb. 34 A und B). Des Weiteren ist eine Position von besonderem Interesse, die in den meisten LCAT-Proteinen von einem Serin besetzt wird. Der Serinrest S262 liegt in unmittelbarer Nachbarschaft zu dem hochkonservierten Bereich IV und scheint eine Determinante der Substratspezifität zu sein (Abb.34 A; Zhao et al., 2003). Die Bereiche II, III, VI bis X sind zwischen den LCAT-Proteinen weniger stark konserviert und eher als charakteristisch für die PDAT anzusehen.

Besonders auffällig sind die Unterschiede in den Bereichen VIII und IX zwischen OtPDAT bzw. OlPDAT und den übrigen PDAT aus Pflanzen und Hefe (Abb. 34 B). Zu der Bedeutung dieser Unterschiede in der Primärstruktur in Bezug auf die katalytische Aktivität der OtPDAT

OtPDAT 1 MAVTRRTTRAGARAPGTGASSSRAPRPA.IRASSSRTKTASKRSSAWARAEIGGARARRS OlPDAT 1 MAPARRRPAVRAPSKRASSASRAGARDA.SRASPSPSTTAWTVLSRLFATTFSRRAARRE At3g44830 1 ...MSPLLRFRKLSSFSEDTINPK.PKQSATVEK...PKR...RRSGRCS At5g13640 1 .MPLIHRKKPTE..KPSTPPSEEVVHDE.DSQKKPHESSKSHHKKS...NGGGKWS MtPDAT 1 .MALIRRRKGSEPEKGQSENSEPKIQKK.EDEDDDNDKNKKNKKKNKDEVGVFKKSTRWS Lro1p 1 MGTLFRRNVQNQKSDSDENNKGGSVHNKRESRNHIHHQQGLGHKRRRGISGSAKRNERGK PpPDAT 1 ...

consensus 1 rr r s s ih kr rr gr s

OtPDAT 60 WFVRVWAFDWSS.AGASKRVRAFAVVVIACAATYLRDVYVPERVRVAVVGTLP...

OlPDAT 60 DVER...RRTRARALAVACVACAATYLREVYVPAAVRDTFVDSLP...

At3g44830 41 CVDS...CCWLIGYLCTAWWLLLFLYH...

At5g13640 50 CIDS...CCWFIGCVCVTWWFLLFLYN...

MtPDAT 59 CVDS...CCWFVGCICTLWWFLLFMYN...

Lro1p 61 DFDRKRDGNGRKRWRDSRRLIFILGAFLGVLLPFSFGAYHVHNSDSDLFDNFVNFDSLKV PpPDAT 1 ...

consensus 61 vd w ig l fl ly

OtPDAT 112 ...EWVNDTVLARLPALAYVPDSGARG.VIGRTMALGGAEPKHPVVIVPG OlPDAT 102 ...DWVNDTVLARLPALELQPETRSRERGPGVELRERGLTPKHPVVIVPG At3g44830 65 ...SVPVPAMLQAPE...SPGTRLSRDGVKAFHPVILVPG At5g13640 74 ...AMPASFPQYVTERITGPLPDPPGVKLKKEGLKAKHPVVFIPG MtPDAT 83 ...VMPASFPQYVTEAITGPMPDPPGLKLKKEGLSVKHPVVFVPG Lro1p 121 YLDDWKDVLPQGISSFIDDIQAGNYSTSSLDDLSENFAVGKQLLRDYNIEAKHPVVMVPG PpPDAT 1 ...

consensus 121 v a p t pg lr gv kHPVXXXPG

OtPDAT 158 FVSTGLELWRGQ....ACGEHFFRRRMWGTPAMARAFFSNQKCWMEHMRLDAKTGSDPED OlPDAT 149 FVSTGLELWRGK....ACGAHFFRRRMWGTPAMARAFFSNQKCWMEHMRLDGRTGSDPES At3g44830 99 IVTGGLELWEGR....PCAEGLFRKRLWG..ASFSEILRRPLCWLEHLSLDSETGLDPSG At5g13640 116 IVTGGLELWEGK....QCADGLFRKRLWG..GTFGEVYKRPLCWVEHMSLDNETGLDPAG MtPDAT 125 IVTGGLELWEGH....QCAEGLFRKRLWG..GTFGEVYKRPSCWVEHMSLDNETGMDPPG Lro1p 181 VISTGIESWGVIGDDECDSSAHFRKRLWGSFYMLRTMVMDKVCWLKHVMLDPETGLDPPN PpPDAT 1 ...MEHMSLDNETGLDPEG consensus 181 ivt GXELW gr caeg FRXRXWG a if CWleHmsLD eTGlDP g

OtPDAT 214 IRLRAVRGLEGVDWFVPGYFVWARIIEELGGLGYDANTIHSAAYDWRLSPHMLEVRDGYF OlPDAT 205 VRLRAVRGLEGVDWFLPGYFVWGKVIEELSELGYDSNTLHSAAYDWRLSPTMLERRDGYF At3g44830 153 IRVRAVPGLVAADYFAPCYFAWAVLIENLAKIGYEGKNLHMASYDWRLSFHNTEVRDQSL At5g13640 170 IRVRAVSGLVAADYFAPGYFVWAVLIANLAHIGYEEKNMYMAAYDWRLSFQNTEVRDQTL MtPDAT 179 ITVRPVSGLVAADYFAAGYFVWADLIANLARIGYEEKTMYMAAYDWRISFQNTEVRDQTL Lro1p 241 FTLRAAQGFESTDYFIAGYWIWNKVFQNLGVIGYEPNKMTSAAYDWRLAYLDLERRDRYF PpPDAT 17 IRVRPVSGLVAADYFAPGYFVWAVLIENLARIGYEEKNMYMASYDWRLTFQNTEVRDQSL consensus 241 irvRav GlvaaDyFapgYfvWa lienLakiGYe k m mAaYDWRXsf ntEvRDqsl

*

OtPDAT 274 SRLKSVIETLHGVSG.ERVAILAHSYGDTVTRYFFEWVETPVAKGGGGGGKKWVDAHIHA OlPDAT 265 TRLKSVIETLYSVHG.ERVALLAHSYGDTISRYFFEWVETPVAKGGGGGGKRWVDKHVHA At3g44830 213 SRLKSKIELMYATNGFKKVVVVPHSMGAIYFLHFLKWVETPLPDGGGGGGPGWCAKHIKS At5g13640 230 SRMKSNIELMVSTNGGKKAVIVPHSMGVLYFLHFMKWVEAPAPLGGGGG.PDWCAKYIKA MtPDAT 239 SRIKSNIELMVSTNGGNKAVIIPHSMGVLYFLHFMKWVEAPAPMGGGGG.PDWCSKYIKA Lro1p 301 TKLKEQIELFHQLSG.EKVCLIGHSMGSQIIFYFMKWVEAEGPLYGNGG.RGWVNEHIDS PpPDAT 77 SRLKSTIESMVRTSG.NKAVVIPHSMGSLYFLHFLKWVEAPAPMGGGGG.PDWVARHIKA consensus 301 srlKs IElm t G kvvvvpHSXG iyflhFlkWVEapgplgGXGG p Wv khika

I

II III

IV

V VI

A

OtPDAT 615 NIMGNEDMIADILSVVAG..RAEDVRERIVSDIDHLSSVIDARFASANPRESF OlPDAT 602 NIMGNEDMIRDLLTIVAG..RAHAVPPRVVSDVDALAATIR...

At3g44830 622 DIMGNVGLIEDVLRIAAGASGQEIGGDRIYSDVMRMSERISIKL...

At5g13640 628 DIMGNFALIEDIMRVAAGGNGSDIGHDQVHSGIFEWSERIDLKL...

MtPDAT 637 DIMGNFALIEDVMRVAAGAKGEELGGDKVYSDIFKWSDRIKLPL...

Lro1p 620 DILGSAELNDYILKIASG..NGDLVEPRQLSNLSQWVSQMPFPM...

PpPDAT 482 DIMGNFALIEDILKVAAGMTGEDIGGNRIFSDLREWSERIKLKL...

OtPDAT 333 YVDIAGPMLGIPKTIPSLLSGEMRDTAILGELEGMLGGILENAMGRFIGSQIKEVCETFR OlPDAT 324 YVDIAGPMLGIPKTIPSLLSGEMRDTAILGELEGMLGGLLETAVGRLIGTQIKEVCDTFR At3g44830 273 VVNIGPAFLGVPKAVSNLLSAEGKDIAYA...RSLAPGLLDSELLKLQ..TLEHLMRMSH At5g13640 289 VMNIGGPFLGVPKAVAGLFSAEAKDVAVA...RAIAPGFLDTDIFRLQ..TLQHVMRMTR MtPDAT 298 IVNIGGPFLGVPKAIAGLFSAEARDIAVA...RAIAPGFLDNDMFRIQ..TLQHVMKMTR Lro1p 359 FINAAGTLLGAPKAVPALISGEMKDTIQLN...TLAMYGLEKFFSRIER...VK...MLQ PpPDAT 135 TMNIAGPFLGVPKAFAGIFSAEAKDIAVA...RAIAPGVLDNDIFGLQ..TLQYIMKVTR consensus 361 vniagpfLGvPKav allSaEgkDiaia rglapglLd el rlq tl hvmrmsr

OtPDAT 393 TWGALWAMLPRGGSKIWGDERSGTPDVD...

OlPDAT 384 TWGALWAMLPRGGAAVWGDDDAGAPES...

At3g44830 328 SWDSIVSLLPKGGEAIWGDLDSHAEEGLNCIYSKRKSSQLSLSNLHKQNYSLKPVSRVKE At5g13640 344 TWDSTMSMLPKGGDTIWGGLDWSPEKGHTCCGKKQKNNETCGEAGENGVS...KKS MtPDAT 353 TWDSTMSMIPKGGDTIWGDLDWSPEE...SCGLHTRKQSSNNTQLTEQKT...NKT Lro1p 410 TWGGIPSMLPKGEEVIWGDMKSSSEDALN...NN PpPDAT 190 TWDSCLSMLPKGGKTIWGDASWSPEEG.YDCSTKKSDDAADGLVKGQTESGVQVGAHGKP consensus 421 tWdsivsmlPkGge iWGdld s eeg k k

OtPDAT 421 .AAG.DSVNFFLQLRESGQSSEKS...FN..HSIMSATSLLFEHLADSVPHN...

OlPDAT 411 ...GALNFFLQMRAAGTSRETS...FN..HTVDSALGFLFEQLADSVPHN...

At3g44830 388 PAKYGRIVSFGKRASELPSSQLSTLNVKELSRVDGNSNDSTSCGEFWSEYNEMSRES...

At5g13640 397 PVNYGRMISFGKEVAEAAPSEINN..IDFRGAVKGQSIPNHTCRDVWTEYHDMGIAG...

MtPDAT 403 NVNYGRMISFGKAVAEADSSKIDI..VDFRGAIKGPNVANTSCRDVWTEYHDMGVEGVRA Lro1p 441 TDTYGNFIRFERNTSDAFNKNLTM...KDAINMTLSISPEWLQ...RR.

PpPDAT 249 SAHYGRMVAFGKEAAAMSHEVIVNRKKEIKTPTNTTLRNTTACGDVWTEYQELTWDD...

consensus 481 ygriv Fgk m ea s l tsc elwsey dm

OtPDAT 466 ...VAEFSHFLDEATRARLKKRIPSIKSKVAPNFG...DSLTSP OlPDAT 453 ...VAEFSSTIDRASRERLKTRVPDLEAKTAPNFG...DPLRSA At3g44830 445 IVKVAENTAYTATTVLDLLRFIAPKMMRRAEAHFSHGIADDLDDPKYGHYKYWSNPLETK At5g13640 452 IKAIAEYKVYTAGEAIDLLHYVAPKMMARGAAHFSYGIADDLDDTKYQDPKYWSNPLETK MtPDAT 461 VAAVAEHKVYTAGSIIDLLQFVAPKMMARGSDHFSYGVADNLDDPKYEHYKYWSNPLETK Lro1p 483 ...VHEQYSFGYSKNEEELRKNE...LHHKHWSNPMEVP PpPDAT 306 VEEIASREIFNADDLVEVLRKVAPKLMARGEDNWSFNIADDPSDEKYQHYRYWANPLETT consensus 541 i vae y a ldlLr iapkmmara fs iad d ky h kywsnplet

OtPDAT 504 LPHAPNMKVYCLYGVGKPSERAYAYERVD...DALRPYQLDVDQS...RNGVLTRGVW OlPDAT 491 LPRAPNMKIFCLYGAGKPTERAYVYERFDA....DALRPYQLDVQS....RDAALTHGVW At3g44830 505 LPEAPEMEMYCLYGVGIPTERSYIYKLATSSGKCKSSIPFRIDGSLDG..DDVCLKGGTR At5g13640 512 LPNAPEMEIYSLYGVGIPTERAYVYKLNQSP...DSCIPFQIFTSAHEEDEDSCLKAGVY MtPDAT 521 LPNAPDMEIFSLYGVGLPTERAYIYKLTPFA...ECYIPFEIDPNAEGGDKVSCLKDGVY Lro1p 516 LPEAPHMKIYCIYGVNNPTERAYVYKEEDDS...SALNLTIDYESKQ...PVF PpPDAT 366 LPNAPDMEVYCLYGVGIPTERSYIYKVSPSAD..NCYIPFRIDTSADGGSEG.CLKGGVQ consensus 601 LP APeMeiyclYGvgiPtERaYiYkl d ipf id s clk gvf

* *

OtPDAT 556 QVDGDGSIPLVSLGYVCR.HWRDNRKLNPANVSVVSREYHHRALPLGVGGFQGKTEGDHV OlPDAT 543 QVDGDGSIPLASLGYVCR.EWRVNRALNPANVSVVTREYAHRPLPLSVGGFQGKSEGDHV At3g44830 563 FADGDESVPVISAGFMCAKGWRGKTRFNPSGMDTFLREYKHKPPGSLLESR.GTESGAHV At5g13640 569 NVDGDETVPVLSAGYMCAKAWRGKTRFNPSGIKTYIREYNHSPPANLLEGR.GTQSGAHV MtPDAT 578 TVDGDETVPVLSSGYMCAKGWRGKTRFNPSGIRTYVREYDHSPPANLLEGR.GTQSGAHV Lro1p 563 LTEGDGTVP.LVAHSMCHKWAQGASPYNPAGINVTIVEMKHQPDRFDIRGG..AKSAEHV PpPDAT 423 FVDGDETVPALSAGYLCHAPWKGKTKFNPGGSPSYVREYKHAPPSNLLEGR.GTQSGAHV consensus 661 vdGDXXXPvlsagymChk wrgktrfNPagm tflrEykH pp llegr gt sgaHV

X

VII

VIII

IX

Abb. 34 Vergleich der Aminosäuresequenzen von Vertretern der LCAT-Superfamilie.

(A) Vergleich der Aminosäuresequenzen der möglichen PDAT aus O. tauri und O. lucimarinus mit PDAT aus A. thaliana, M. truncatula, P. patens und S. cerevisiae. Durch Sternchen gekennzeichnet sind die Aminosäurereste der katalytischen Triade von LCAT-Enzymen. Die C-terminalen ER-Retentionssignale sind schwarz umrandet. Die grauen Balken markieren konservierte Aminosäuresequenzen der LCAT-Familie und schwarze Balken konservierte Bereiche der PDAT. Während hochkonservierte Aminosäurereste der LCAT-Superfamilie unterhalb des Alignments schwarz hinterlegt dargestellt sind, sind die konservierten Aminosäurereste der PDAT-Familie unterhalb des Alignments in fettgedruckten Buchstaben dargestellt. (B) Partielles Aminosäuresequenz-Alignment bekannter Proteine der LCAT-Superfamilie. Der Ausschnitt zeigt zwei hochkonservierte Bereiche innerhalb der LCAT-Superfamilie. Abweichend zu den konservierten Aminosäureresten Methionin und Leucin findet man in OtPDAT und OlPDAT einen Tyrosinrest in Position 298.

Der Serinrest in Position 262 ist eine Determinante der Fettsäure-Substratspezifität in der humanen LCAT HsLCAT (Zhao et al., 2003). X, beliebiger Aminosäurerest innerhalb einer Konsensussequenz. Das Alignment wurde mit dem Programm VecorNTI^® Suite v10.0 errechnet und das Abbild wurde durch das Programm Boxshade 3.21 erzeugt.

Die Unterschiede in der Primärstruktur wirken sich jedoch nicht auf die Sekundärstruktur aus. Hier zeigen OtPDAT und OlPDAT die typischen Charakteristika der LCAT mit einer N-terminalen transmembranen Helix, die vermutlich der Verankerung in der Membran dient (Abb. 35). Jedoch zeigen die möglichen PDAT aus O. tauri und O. lucimarinus gemeinsam mit Lro1p keine C-terminalen ER-Retentionssignale wie sie in anderen pflanzlichen PDAT vorhanden sind (Abb. 34 B; Shin et al., 1991; Teasdale und Jackson, 1996; McCartney et al., 2004).

B

MtPSAT 144 IAVPYDWRLS....PSMLEERDLYFHKLKLTFETAFKLRG.GPSLVFGHSLGNNVFRYFL PpPSAT 140 VAVPYDWRLP....GAMLEERDLYFHKLKIIFETARKLRG.GPSLVYAHSMGNNVFRYFL At1g04010 151 VAVPYDWRLS....PTKLEERDLYFHKLKLTFETALKLRG.GPSIVFAHSMGNNVFRYFL MtLCAT 164 FGAPYDFRYGLAAPSHPSQVGSKFLNDLKNLIEKASNSNGGKPVILVSHSLGGLFVLELL PpLCAT 175 YGAPYDFRF..APGPHASNVALEYLKDLKDLIETAYSVNANEPVVILAHSMGGLWTLFFL At1g27480 160 LGAPYDFRYGLAASGHPSRVASQFLQDLKQLVEKTSSENEGKPVILLSHSLGGLFVLHFL HsLCAT 164 RAAPYDWRLE...P.GQQEEYYRKLAGLVEEMHAAYG.KPVFLIGHSLGCLHLLYFL MmLCAT 164 RAAPYDWRLA...P.HQQDEYYKKLAGLVEEMYAAYG.KPVFLIGHSLGCLHVLHFL XlLCAT 166 RAAPYDWRIA...P.NGQKEYFEKLKSLIEEMSNKYN.ESVFIIGHSLGNLYLLYFL NtPLA1 139 FGFGYDFRQS...N..RIDKAMNDLKAKLETAYKASGGRKVDIISHSMGGLLIKCFI At3g03310 136 FGYGYDFRQS...N..RIDLLILGLKKKLETAYKRSGGRKVTIISHSMGGLMVSCFM PpPLA 149 FGFGYDFRQS...N..RLGETMDRLKAKLEMMYEVSGGKKVDIITHSMGGIVLKSFL MtPLA 142 FGFGYDFRQS...N..RLQETMDRFAEKLELIYNAAGGKKIDLISHSMGGLLVKCFM At4g19860 141 FGFGYDFRQS...N..RLQETLDQFAKKLETVYKASGEKKINVISHSMGGLLVKCFM MtPDAT 218 YMAAYDWRIS....FQNTEVRDQTLSRIKSNIELMVSTNGGNKAVIIPHSMGVLYFLHFM PpPDAT 56 YMASYDWRLT....FQNTEVRDQSLSRLKSTIESMVRTSG.NKAVVIPHSMGSLYFLHFL At3g44830 192 HMASYDWRLS....FHNTEVRDQSLSRLKSKIELMYATNGFKKVVVVPHSMGAIYFLHFL At5g13640 209 YMAAYDWRLS....FQNTEVRDQTLSRMKSNIELMVSTNGGKKAVIVPHSMGVLYFLHFM SpPDAT 249 LSASYDWRLS....YANLEERDKYFSKLKMFIEYSNIVHK.KKVVLISHSMGSQVTYYFF Lro1p 280 TSAAYDWRLA....YLDLERRDRYFTKLKEQIELFHQLSG.EKVCLIGHSMGSQIIFYFM OlPDAT 244 HSAAYDWRLS....PTMLERRDGYFTRLKSVIETLYSVHG.ERVALLAHSYGDTISRYFF OtPDAT 253 HSAAYDWRLS....PHMLEVRDGYFSRLKSVIETLHGVSG.ERVAILAHSYGDTVTRYFF consensus 301 aa YDwRls d yl klk vE m g kkv vi HSmG lv fl

V IV

S262 Y298

Abb. 35 Hydropathieanalyse der PDAT aus O. tauri.

Die Lage der für LCAT-Enzyme charakteristischen N-terminalen transmembranen Helix ist durch einen schwarzen Balken gekennzeichnet. Die sogenannte katalytische Triade der LCAT-Enzyme umfasst die drei Aminosäurereste Serin, Aspartat und Histidin, deren Positionen durch Pfeile markiert sind. Das Hydropathie-Profil wurde mit Hilfe des Programms ProtScale berechnet (Gasteiger et al., 2005); die Vorhersage der transmembranen Bereiche erfolgte durch das Programm TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).