Sequenzanalyse der LPCAT aus O. lucimarinus

3. ERGEBNISSE

3.2 Identifizierung und funktionale Charakterisierung von LPCAT

3.2.4 Sequenzanalyse der LPCAT aus O. lucimarinus

Der aus der Datenbanksuche erhaltene offene Leserahmen der OlLPCAT mit 1209 bp codiert für ein Protein mit 402 Aminosäuren. Daraus ergibt sich ein Molekulargewicht von 45,1 kDa. Die Aminosäuresequenz von OlLPCAT weist mit 68 % die höchste Identität zu einer bisher nicht charakterisierten LPCAT aus der nah verwandten Mikroalge O. tauri auf.

Ungleich niedrigere Identitäten bestehen zu den bereits charakterisierten LPCAT aus S. cerevisiae und A. thaliana (Riekhof et al., 2007b; Stahl et al., 2008). Zu Ale1p besteht eine Identität von 25 %, zu AtLPCAT1 und AtLPCAT2 bestehen Aminosäure-Identitäten von 33 % bzw. 32 %. Zu den ebenfalls bei der Datenbanksuche identifizierten, mutmaßlichen LPCATI bis III aus P. patens bestehen Aminosäuresequenz-Identitäten von 32 % für PpLPCATI und 34 % zu PpLPCATII und III. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von OlLPCAT mit den Sequenzen aus O. tauri, A. thaliana, P. patens und S. cerevisiae ist in Abb. 12 dargestellt. Vertreter der MBOAT-Familie weisen zwei charakteristische, hoch-konservierte Aminosäuren auf. Die erste hochhoch-konservierte Position besteht entweder aus einem Histidin- oder Asparagin-Aminosäurerest und die zweite Position stets aus einem Histidin-Aminosäurerest, der inmitten eines längeren hydrophoben Bereichs innerhalb der Polypeptidkette liegt. Bei den untersuchten pflanzlichen LPCAT ist die erste hochkonservierte Position mit der Aminosäure Asparagin besetzt. Diese beiden hochkonservierten Amino-säuren werden als mögliche essenzielle Bestandteile des katalytischen Zentrums angesehen (Hofmann, 2000). Außerdem sind die in Abb. 12 dargestellten LPCAT-Homologen vermutlich am ER lokalisiert. Die Konzentration der basischen Aminosäurereste Lysin und Arginin am C-terminalen Ende mit den Konsensussequenzen KKXX, RKXX oder KXKXX sind in allen dargestellten Proteinen vertreten. Diese C-terminalen Konsensussequenzen fungieren als typische ER-Retentionssignale von Membranproteinen (Shin et al., 1991;

Teasdale und Jackson, 1996). Eine Hydropathieanalyse der ER-lokalisierten, membran-ständigen LPCAT ist in Abb. 13 dargestellt. Im Hydropathie-Profil sind die typischen hydro-phoben Bereiche der untersuchten LPCAT aus der MBOAT-Superfamilie zu erkennen.

Hierbei liegen im N- und C-terminalen Bereich vier hydrophobe, transmembrane Bereiche (I, II, III und IV; schwarze Balken) und im mittleren Bereich des Proteins vermutlich zwei hydrophobe, periphere Membranbereiche (i, ii und iii; graue Balken) vor. Besonders deutlich ist der für MBOAT charakteristische, lange hydrophobe Abschnitt zu erkennen, in dem Teile des katalytischen Zentrums vermutet werden (Hofmann, 2000).

OlLPCAT 1 ...

OtLPCAT 1 MDAALDAALARWDDVVREVSIALALPRGSTMFLLGLALAPVFGFGFPTIDWICGDDRARR AtLPCAT1 1 ...MDMSSMAGSIGVSVAVLRFLLCFVATIPVSFACRIVP...S AtLPCAT2 1 ...MELLDMNSMAASIGVSVAVLRFLLCFVATIPISFLWRFIP...S PpLPCAT1 1 ...MVTLEDVSSVLGVSVSVTRFLLCFVGSIPCSALARFMP...S PpLPCAT2 1 ...MITMRDVAGALGIGIPVLWFLMAFMASIPVSWLRRFVR...G PpLPCAT3 1 ...MEDVAGTLGIGVPVLWFLASFVASIPVSWLWRFAP...G Ale1p 1 ...MYNPVDAVLTKIITNYGIDSFTLRYAICLLGSFPLNAILKRIP...E.KRIG consensus 1 lm m dvag vgi v vlrflicfvasiplsfl rfip

OlLPCAT 1 ...MLSAAAFG.RATVVCAHFGACAYATMLATRRRCGYVVFAGSFAYLMR OtLPCAT 61 AMCRSVYALLAGVALSLMSFG.RQTVVCAHFGAVAYAVMALARRRCGVVVFLGSFAYLIR AtLPCAT1 39 RLGKHLYAAASGAFLSYLSFGFSSNLHFLVPMTIGYASMAIYRPKCGIITFFLGFAYLIG AtLPCAT2 42 RLGKHIYSAASGAFLSYLSFGFSSNLHFLVPMTIGYASMAIYRPLSGFITFFLGFAYLIG PpLPCAT1 40 GRVRSVYAVATGILLSYYSFGPEANLFFIPPIAVGYGSMLLAPRHCGAITFVVAFAFLLT PpLPCAT2 40 VTARHLYAAASGALLSHCAFGYESNLYLMVPICVSYGAMVVSRRMCGVISAVFAFGFLIY PpLPCAT3 37 VAARHLYAAASGAFLAHCAFGYEANLYMMIPICVSYGAMMLNRRMCGVVSAIFAFGFLVY Ale1p 49 LKCCFIISMSMFYLFGVLNLVSGFRTLFISTMFTYLISRFYRSKFMPHLNFMFVMGHLAI consensus 61 grhiyaaasgalls lsfgf nl fivpm vayasmll rrrcgvitfm gfayLi

OlLPCAT 47 YHFVADTATAWKSGEVDISGLLMVLVLKVTACALNYQDAATTKASE...MSEFQNRRHLK OtLPCAT 120 FHVMADTANTWKAGEVDISGLLMVMTLKVTACAMNYQDGATVAASE...MTEHQHRRHLK AtLPCAT1 99 CHVFYMSGDAWKEGGIDSTGALMVLTLKVISCSMNYNDGMLKEEG....LREAQKKNRLI AtLPCAT2 102 CHVFYMSGDAWKEGGIDSTGALMVLTLKVISCSINYNDGMLKEEG....LREAQKKNRLI PpLPCAT1 100 CHVMMLSGDAWKNGGIDTTGALMVLTLKVISASMSYQDGLVKKED....LRVSQKKNRLK PpLPCAT2 100 CHVMFMSGDAWKSGGIDHTGSMMVLTLKVTSAAFNYQDGLIKDEES...LREAQKKSRLG PpLPCAT3 97 CHVMFMSGDAWKSGGIDHTGSMMVLTLKVTSAAFNYQDGLIKDGDS...LREAQKKYRLE Ale1p 109 NHIHAQFLNEQTQTTVDITSSQMVLAMKLTSFAWSYYDGSCTSESDFKDLTEHQKSRAVR consensus 121 cHvmymsgdawk ggiD tg lMVltlKvtscalnYqDgmlkee lreaQkk rlr

OlLPCAT 104 RLPSALDYASWLMFPCTLVSGPAIEFRDYSDWLRDRGVYAR...GTP OtLPCAT 177 TLPNVLDYASWLMFPCTLVSGPAVEFRDYSDWLNGRGVWSG...EAP AtLPCAT1 155 QMPSLIEYFGYCLCCGSHFAGPVYEMKDYLEWTEGKGIWDTTE...KRKKP AtLPCAT2 158 QMPSLIEYFGYCLCCGSHFAGPVFEMKDYLEWTEEKGIWAVSE...KGKRP PpLPCAT1 156 ELPSLVQYLGYCLNCGTHLAGPVYEIRDYIDWTEDKGLWSRDS...ARPLP PpLPCAT2 157 KLPSFLAYLGYCFNCGTILVGPVFELRDYMDWTEDKGLWDPQA...ENQPP PpLPCAT3 154 KPPSFIAYLGYCYNCGSILVGPVFELRDYMDWTEDKGLWDPKA...EKRPP Ale1p 169 GHPPLLKFLAYAFFYSTLLTGPSFDYADFDSWLNCEMFRDLPESKKPMRRHHPGERRQIP consensus 181 lPslldylgycm cgtll GPvfemrDyldWtedkgvwd r P

OlLPCAT 148 NRVAPATRKLLGAIACLGIYQAVAMRYTIENTYLNPSWA.QYSLAERIWHVYVYGQGNRA OtLPCAT 221 SRVAATAKKFFGAATCVALFQVLSVKYTLESVYLAPNWLTDYSFLERVWHMNVMGQTNRF AtLPCAT1 203 SPYGATIRAILQAAICMALYLYLVPQYPLT..RFTEPVYQEWGFLRKFSYQYMAGFTARW AtLPCAT2 206 SPYGAMIRAVFQAAICMALYLYLVPQFPLT..RFTEPVYQEWGFLKRFGYQYMAGFTARW PpLPCAT1 204 SPYGAALRALFQAALCMAVYMTLLPRIPLS..MFDSPEYQKWGFWHRLGYMYLSGFTARW PpLPCAT2 205 SPYAAAFLAAVKAFVCMGIYMYMTGTYPLS..FLTTPEYMKREFGFRVWYQILCGFGARW PpLPCAT3 202 QPYGATFLVVVKAFICMGIYMYITGTFPLS..FLTEPDFMKWGFWHRVGYQILCGFGARW Ale1p 229 KNGKLALWKVVQGLAWMILSTLGMKHFPVK.YVLDKDGFPTRSFIFRIHYLFLLGFIHRF consensus 241 spygaalravvqaaicmalylylm hyplt ylt p y wgfirri yqyl GftaRw

OlLPCAT 207 KYYFVWMMADFAATVSGLGFSGYD...AMGKARWDTAANIYPIGVEKSVTLNAIPLSW OtLPCAT 281 KYYFVWMMADFAATVSGLGFSGYD...AKGVARFDTAANIHPLGCERAITLNSFPLSW AtLPCAT1 261 KYYFIWSISEASIIISGLGFSGWT...DDASPKPKWDRAKNVDILGVELAKSAVQIPLVW AtLPCAT2 264 KYYFIWSISEASIIISGLGFSGWT...DETQTKAKWDRAKNVDILGVELAKSAVQIPLFW PpLPCAT1 262 KYYFIWSISEVAVIISGLGFSGWATPDDDKKAKPLWTRAKNVDIMKVELAKSGVELPMCW PpLPCAT2 263 KYYFIWSLSEAAVMISGFGFSGWVKPTPSDEPKAKFSRAENVDILNVELATSAAEIPKYW OlLPCAT 1 ...

100 200 300 400

Abb. 12 Vergleich der Aminosäuresequenzen von verschiedenen Vertretern der LPCAT-Familie.

Vergleich der Aminosäuresequenzen der LPCAT-Homologen aus O. tauri, O. lucimarinus und P. patens mit bekannten LPCAT aus A. thaliana und S. cerevisiae. Es ist ein C-terminal verkürzter Ausschnitt von Ale1p dargestellt. Durch Sternchen sind Aminosäuren gekennzeichnet, die im katalytisch aktiven Zentrum vermutet werden. Die C-terminalen ER-Retentionssignale sind schwarz umrandet. Hochkonservierte Aminosäuren sind unterhalb des Alignments dargestellt. Das Alignment wurde mit dem Programm VecorNTI^® Suite v10.0 errechnet und das Abbild wurde durch das Programm Boxshade 3.21 erzeugt.

Abb. 13 Hydropathieanalyse der LPCAT aus O. lucimarinus.

Die mit römischen Zahlen versehenen schwarzen Balken kennzeichnen potenzielle transmembrane Helices (I bis IV). Potenzielle periphere Membranbereiche wurden mit grauen Balken in das Profil eingezeichnet und mit i bis iii gekennzeichnet. His, hochkonservierter Histidinrest. Das Hydropathie-Profil wurde mit Hilfe des Programms ProtScale berechnet (Gasteiger et al., 2005); die Vorhersage der transmembranen Bereiche erfolgte durch das Programm TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/

services/TMHMM/).

consensus 361 *ikvs WLrhyVYeRlv kGkkpGffqlLaTqlvSavW*Gly GYmlfFvqsAlmi ggr OlLPCAT 262 NVKTGLWLRHYVYDRVTPKGKKPGLLQILITQIVSGVWHGLHAGYWLFFVSSAFAVNAGR OtLPCAT 336 NVKTGQWLRHYVYDRVTPKGKKPGLLQLLITQIVSGLWHGLYAGYWLFFVSSAFALNAGR AtLPCAT1 318 NIQVSTWLRHYVYERLVQNGKKAGFFQLLATQTVSAVWHGLYPGYMMFFVQSALMIAGSR AtLPCAT2 321 NIQVSTWLRHYVYERIVKPGKKAGFFQLLATQTVSAVWHGLYPGYIIFFVQSALMIDGSK PpLPCAT1 322 NVSVSTWLRHYVYERLVPKGGKAGFWQLLMTQVVSAVWHGLYMGYILYFVHSALMISGSR PpLPCAT2 323 NIHVSVWLRHYVYERLVVKGKRPGFWQLLATQVVSAIWHGLYAGYLLFFVNSALMIAGAR PpLPCAT3 320 NIHVSVWLRHYVYERLVVKGRRPGFRQLLATQVVSAIWHGLYTGYLLFFVNSALMIAGAR Ale1p 344 NMNTNKWLKYSVYLRVTKKGKKPGFRSTLFTFLTSAFWHGTRPGYYLTFATGALYQTCGK consensus 361 Nikvs WLrhyVYeRlv kGkkpGffqlLaTqlvSavWHGly GYmlfFvqsAlmi ggr

OlLPCAT 322 LMYRWKQTR...VPEKYRVLVDVPLWAFTHVALNYMCAAFILVDLKQCIQSWSSMH OtLPCAT 396 LMYRWRSRR...VPESLRIFVDVPLWLATQMTINYLVSAFMLVEYKSCMDAWASVH AtLPCAT1 378 VIYRWQQAISP...KMAMLRNIMVFINFLYTVLVLNYSAVGFMVLSLHETLTAYGSVY AtLPCAT2 381 AIYRWQQAIPP...KMAMLRNVLVLINFLYTVVVLNYSSVGFMVLSLHETLVAFKSVY PpLPCAT1 382 VIYKWQSALPE...NAIWARRLGHLINGLFGALVNNYSCIGFLLLSYHETLQAYSSVH PpLPCAT2 383 VIFKWQRSIPK...SNFLAVNLGPLFGFVYTVFVLNLTVMGFLVLYFDDTITVYKTVY PpLPCAT3 380 VLYKWQQAIPK...SNFLAVKLGSFFGFFYTVLVLNLTVMGFLVLYFDDTITAYRTVY Ale1p 404 IYRRNFRPIFLREDGVTPLPSKKIYDLVGIYAIKLAFGYMVQPFIILDLKPSLMVWGSVY consensus 421 viyrwqqaip m r lv lv flytvlvlnysvvgFivl lketl ay svy

OlLPCAT 375 YFGHVGIAVLLVFGAVFAPRR.SSKPKSA...

OtLPCAT 449 YIAHVGIVVMSVFGVVFAPK..SSKPKTA...

AtLPCAT1 433 YIGTIIPVGLILLSYVVPAK..PSRPKPRKEE...

AtLPCAT2 436 YIGTVIPIAVLLLSYLVPVK..PVRPKTRKEE...

PpLPCAT1 437 YVGTVVPVAIILFDLVVKPPRTGSARKTKKVQ...

PpLPCAT2 438 YSGTLLPVVIILLGEFIKLPRAGQNPSVKKES...

PpLPCAT3 435 YSGTLLPVALILLGKVVKPPRSGQNPRVKKES...

Ale1p 464 FYVHIIVAFSFFLFRGPYAKQVTEFFKSKQPKEIFIRKQKKLEKDISASSPNLGGILKAK consensus 481 yigtvipvglillg vv pkr skpkskke

3.2.5 Versuche zur funktionalen Charakterisierung der LPCAT aus O. lucimarinus

Im Dokument Identifizierung und funktionale Charakterisierung neuartiger Acyltransferasen aus Mikroalgen (Seite 104-107)