Identifizierung und Charakterisierung von PDAT

Neben dem abhängigen Weg der TAG-Synthese existiert ein Acyl-CoA-unabhängiger Weg an dem PtdCho und DAG als Reaktionspartner beteiligt sind. Katalysiert wird diese TAG-Synthese durch die membranständige PDAT (Dahlqvist et al., 2000; Oelkers et al., 2000). Welchen Anteil diese Aktivität an der Ölakkumulation während der Samenreifung hat, ist bislang nicht geklärt. In S. cerevisiae konnte demonstriert werden, dass beide Wege in Abhängigkeit des Wachstumsstadiums mehr oder weniger stark an der TAG-Synthese beteiligt sind (Oelkers et al., 2002). Speziell während der exponentiellen Wachstumsphase ist eine effiziente Modellierung der Fettsäurezusammensetzung von Membranlipiden von besonderer Bedeutung, was die höhere Aktivität der PDAT Lro1p während dieser Wachstumsphase erklären könnte. Ob eine solche entwicklungsspezifische Spezialisierung der einzelnen Synthesewege auch in Pflanzen vorliegt, die möglicherweise von dem Entwicklungsstadium des reifenden Samens reguliert werden könnte, ist bisher unbekannt. Zumindest in R. communis scheinen RcDGAT2 und RcPDAT1a gemeinsam an der Ricinolsäure-Akkumulation aktiv beteiligt zu sein (Browse et al., 2006; Burgal et al., 2008). Dies deutet zudem auf eine Substratspezifität von RcPDAT1a hin, die sie von PDAT aus Organismen ohne hohe Anteile ungewöhnlicher Fettsäuren im Samenöl unterscheidbar werden lässt. Daher sind PDAT aus VLCPUFA produzierenden Organismen ebenso wie DGAT2 von besonderem Interesse und könnten eventuell aufgrund ihrer Substratspezifitäten durch ihre gemeinsame Verwendung in transgenen VLCPUFA-Produzenten einen additiven

4.3.1 OtPDAT ist eine PUFA-spezifische PDAT aus O. tauri

In den Genomen von O. tauri, O. lucimarinus und P. patens wurde jeweils eine PDAT-Sequenz identifiziert (Tab. 23). Zu anderen pflanzlichen PDAT bestehen Aminosäuresequenz-Identitäten von etwa 27 %. Die hochkonservierten Bereiche I, IV und X in der Aminosäuresequenz sowie die typischen Aminosäurereste der katalytischen Triade kennzeichnen OtPDAT als einen Vertreter der LCAT-Superfamilie (Abb. 34 und Abb. 35).

Eine Besonderheit weisen die Aminosäuresequenzen von OtPDAT und OlPDAT auf.

Innerhalb des hochkonservierten Bereichs V befindet sich eine Position stromabwärts des für die katalytische Aktivität essenziellen Serinrestes (S297) bei LCAT-Enzymen typischerweise ein Methionin- oder Leucinrest. OtPDAT und OlPDAT besitzen in dieser äußerst hochkonservierten Aminosäureposition ein Tyrosin (Abb. 34 B). Inwiefern sich dieser Aminosäureaustausch auf die enzymatischen Eigenschaften von OtPDAT und OlPDAT auswirken, könnte durch gerichtete Mutagenesestudien in weiterführenden Arbeiten dargestellt werden. Abweichungen zu der charakteristischen Sekundärstruktur von LCAT-Enzymen liegen bei den beiden LCAT-Enzymen aus O. tauri und O. lucimarinus vermutlich nicht vor. Hier zeigten die Hydropathieanalysen für OtPDAT und OlPDAT jeweils eine N-terminale transmembrane Helix, die vermutlich der Verankerung in der Membran dient.

Jedoch zeigen die beiden PDAT in Analogie zu Lro1p keine C-terminalen ER-Retentionssignale, wie sie u.a. in pflanzlichen PDAT vorhanden sind (Abb. 34 A; Shin et al., 1991; Teasdale & Jackson, 1996; McCartney et al., 2004). Anhand der erfolgreichen Komplementation des lro1Δ dga1Δ-Phänotyps wurde OtPDAT funktional als PDAT identifiziert (Abb. 38). OtPDAT ist, wie auch OtDGAT2B, an der Bildung von Lipidkörpern im Hefestamm H1246 beteiligt (Abb. 39). Bei beiden Komplementationsstudien wurde festgestellt, dass es sich bei OtPDAT um eine PUFA-spezifische PDAT handelt, die keine gesättigten und einfach ungesättigten C16- und C18-Fettsäuren als Substrate nutzt (Abb. 37 bis Abb. 39). Da das Fettsäureprofil und insbesondere das TAG-Fettsäureprofil von O. tauri keine signifikante Akkumulation von gesättigten und einfach ungesättigten C20-Fettsäuren zeigt (M. Heilmann, Dissertation), könnten diese Fettsäuren im Ursprungsorganismus möglicherweise ebenfalls keine präferierten Substrate der OtPDAT darstellen. Dagegen dominieren mehrfach ungesättigte C18- und C20-Fettsäuren das typische Fettsäureprofil der Alge O. tauri.

OtPDAT weist ein zu diesem Profil passendes Fettsäure-Substratspektrum auf, indem das Enzym die hier überprüften Fettsäuren 18:2n-6, 18:3n-6, 18:4n-3, 20:3n-6, 20:3n-3, 20:4n-6 und 20:5n-3 als Substrate für den Transfer von PtdCho auf DAG nutzt. Zu den im Rahmen dieser Arbeit nicht überprüften Substraten zählt auch die Fettsäure 22:6n-3, die einen Hauptbestandteil der VLCPUFA in O. tauri darstellt. Im Allgemeinen werden Fettsäuren mit Kettenlängen ab 20 Kohlenstoffatomen von Hefezellen nur äußerst ungenügend aus dem Nährmedium aufgenommen, aktiviert und dem Lipidstoffwechsel zugeführt. U.a. auch aus diesem Grund sollte ein Testverfahren etabliert werden, um die biochemische Charakterisierung in vitro mit entsprechenden, radioaktiv markierten DAG- und PtdCho-Spezies als Substrate durchführen zu können. Unter den hier gewählten in vitro-Versuchsbedingungen war jedoch keine TAG-Synthese in Membranextrakten der lro1Δ dga1Δ-Mutante nach Expression von OtPDAT feststellbar (Abb. 41). Da jedoch die homologe Komplementation des lro1Δ dga1Δ-Phänotyps durch Lro1p erfolgreich in dem in vitro-Verfahren dargestellt werden konnte, sind die gewählten Versuchsbedingungen zur Darstellung der PDAT-Aktivität prinzipiell geeignet. Darüber hinaus konnte das Enzym in den Membranextrakten angereichert werden (Abb. 40), und es konnte in vivo auch mit dem C-terminalen V5-Epitop den lro1Δ dga1Δ-Phänotyp erfolgreich komplementieren. Um die Substratspezifität der OtPDAT bewerten zu können, wurden die TAG-Fettsäureprofile nach Expression von LRO1 bzw. OtPDAT in Gegenwart verschiedener, einzeln applizierter PUFA miteinander verglichen. Dabei konnte keine ausgeprägte Substratspezifität für eine definierte Fettsäure im Vergleich zu Lro1p festgestellt werden. OtPDAT scheint C18- und C20-Fettsäuren mit vergleichbarer Präferenz als Substrate zu akzeptieren (Abb. 42). Weitere Expressionsstudien von OtPDAT in Gegenwart äquimolarer Mengen verschiedener Fettsäuren sollten mögliche Unterschiede in den molekularen Spezies des gebildeten TAG belegen, und auf eine mögliche Fettsäure-Substratselektivität hinweisen. Wie erwartet, wurden vollständig gesättigte TAG-Spezies, abgesehen von 52:0 und 54:0, und Spezies mit einfach ungesättigten Fettsäuren in den Lipidextrakten von OtPDAT Dies bestätigte die Beobachtungen der vorangehenden Experimente, dass OtPDAT die gesättigten und einfach ungesättigten Fettsäuren diskriminiert. Es wurde jedoch keine Häufung von TAG-Spezies festgestellt, die eine Substratselektivität der OtPDAT für eine definierte C18-Fettsäure widerspiegeln könnte (Abb. 43 und Abb. 45). Ein entsprechender Versuchsansatz mit

Zusammenfassend gilt, dass es sich bei OtPDAT aus O. tauri vermutlich um die erste funktional identifizierte PUFA-spezifische PDAT aus einem pflanzlichen Organismus handelt, die gesättigte und einfach ungesättigte Fettsäuren als Substrate diskriminiert. Für die abschließende Bewertung von OtPDAT hinsichtlich der Verwendung dieses Enzyms als Teil der VLCPUFA-Synthese in transgenen Ölsaaten sollten zunächst die Ergebnisse von Expressionsstudien in der Modellpflanze A. thaliana abgewartet werden, da die hier erhaltenen Erkenntnisse mit Hilfe des Hefe-Systems nicht direkt auf Pflanzen bzw. Samen übertragbar sind. Sollte sich die Spezifität des Enzyms im pflanzlichen System bestätigen, stellt OtPDAT ein äußerst interessantes Enzym dar, mit dessen Hilfe ernährungsphysiologisch relevante Fettsäuren in Pflanzen effizienter produziert werden könnten.