Biosynthese von VLCPUFA in höheren Pflanzen

Im Gegensatz zu der bereits beschriebenen de novo Biosynthese von VLCPUFA in prokaryoten und eukaryoten Organismen sind die meisten höheren Pflanzen nicht in der Lage VLCPUFAs de novo zu synthetisieren. Dies gilt besonders für die landwirtschaftlichen Nutz-pflanzen, deren Samenöl für verschiedene Anwendungen von großem Interesse ist (Napier, 2007). Die Samenöle von einjährigen Nutzpflanzen wie Raps (Brassica napus) und Lein (Linum usitatissmum) weisen einen hohen Gehalt an den VLCPUFA-Vorstufen 18:2n-6 bzw.

18:3n-3 auf. Aufgrund dieses Fettsäureprofils eignen sich diese beiden Ölsaaten besonders gut für die Etablierung eines der in Abb. 6 dargestellten Biosynthesewege.

Die in Mikroalgen, Moosen oder Pilzen vorkommenden Biosynthesewege für VLCPUFAs stellen den Ausgangspunkt für die Etablierung eines solchen Stoffwechselwegs in Ölsaaten dar. Ihre genetische Ausstattung bildet die Grundlage für die Etablierung eines VLCPUFA-Biosynthesewegs in Kulturpflanzen. Das primäre Ziel ist dabei die Identifizierung und Isolierung von für die VLCPUFA-Synthese relevanten Genen aus einem oder mehreren Spenderorganismen und deren Transfer in höhere Pflanzen. Bislang ist es gelungen die Bio-synthese von VLCPUFA entlang des ω6-/ω3-Syntheswegs und des Δ8-Synthesewegs in höheren Pflanzen darzustellen. Als Expressionswirte für die Gene dienten

Im Folgenden werden drei verschiedene Strategien für die transgene VLCPUFA-Synthese in höheren Pflanzen vorgestellt, die alle gleichermaßen das Potenzial für die VLCPUFA-Produktion besitzen (Abb. 7). Der Δ8-Syntheseweg wurde zuerst von Qi et al.

(2004) in A. thaliana eingebracht. Die dabei verwendeten Gene wurden aber ubiquitär unter Kontrolle eines 35S-Promotors exprimiert. Mit diesem Ansatz konnte der Δ8-Syntheseweg erfolgreich in A. thaliana dargestellt werden. Dieser Syntheseweg setzte sich zusammen aus einer Δ9-Elongase aus der Mikroalge Isochrisis galbana, einer Δ8-Desaturse aus der Mikro-alge Euglena gracilis und einer Δ5-Desaturase aus dem Pilz Mortierella alpina. Der erste Reaktionsschritt dieses Synthesewegs ist die Elongation von CoA-gebundenem 18:2n-6 und 18:3n-3. Nach dem Transfer der Produkte 20:2n-6 bzw. 20:3n-3 auf PtdCho erfolgt zunächst die Desaturierung zu 20:3n-6 bzw. 20:4n-3. Die anschließende Desaturierung zu ARA und EPA erfolgte ebenfalls an den PtdCho-gebundenen Fettsäuren. Neben verschiedenen intermediären Fettsäuren des Δ8-Synthesewegs wurden in den analysierten Blättern ARA-Gehalte von etwa 7 % und EPA-ARA-Gehalte von etwa 3 % des Gesamtfettsäuregehalts festgestellt. In einer davon unabhängigen Studie wurde berichtet, dass die im Acyl-CoA-Pool durch die Δ9-Elongase gebildeten Fettsäuren 20:2n-6 und 20:3n-3 nicht effizient aus dem Acyl-CoA-Pool entfernt werden, sondern dort scheinbar akkumulieren. Es wurde vermutet, dass die endogene LPCAT die C20-Fettsäuren nicht als bevorzugtes Substrat verwendet und somit keine direkte Verbindung mit dem PtdCho-Pool herstellt, die allerdings für eine effiziente Prozessierung notwendig wäre (Sayanova et al., 2006). Jedoch lässt sich anhand dieser Ergebnisse nur bedingt auf die Eignung der verwendeten Enzymkombination in Ölsaaten schließen, da bei diesem Versuchsansatz nicht Samen, sondern Blattgewebe für die Expression der Gene und Analysen verwendet wurden. Blattgewebe zeichnet sich durch einen hohen Gehalt an Glyceroglykolipiden und Glycerophospholipiden aus. Triacylglycerin, das im Samen akkumulierende Lipid, ist in Blättern nur zu einem äußerst geringen Anteil vertreten. Über die spezifische Akkumulation der VLCPUFAs im TAG lassen sich daher keine Aussagen treffen. Ein ω6-Syntheseweg für die Bildung von VLCPUFAs wurde von Abbadi et al. (2004) in N. tabacum und L. usitatissimum etabliert. Die Ergebnisse dieser Studie werden hier nur für L. usitatissimum erläutert. Für diesen Stoffwechselweg wurde die Δ6-Desaturase PtΔ6 und die Δ5-Desturase PtΔ5 aus Phaeodactylum tricornutum (Domergue et al., 2002) und die Δ6-Elongase PSE1 aus dem Moos Physcomitrella patens (Zank et al., 2002) verwendet. Im Gegensatz zu dem von Qi et al. etablierten Weg wurde die Expression der Gene des Δ6-Synthesewegs durch einen samenspezifischen Promotor reguliert.

Bei diesem Stoffwechselweg erfolgt die erste Desaturierung an PtdCho-gebundenem 18:2n-6 bzw. 18:3n-3. Anschließend müssen die Fettsäurereste für die Elongation zu 20:2n-6 bzw. 20:3n-3 von PtdCho auf CoA übertragen werden. Die Endprodukte ARA und EPA entstehen wie auch bei dem von Qi et al. etablierten VLCPUFA-Syntheseweg an PtdCho-gebundenen Fettsäuren. Daraus folgt, dass für den letzten Reaktionsschritt die Fettsäuren 20:2n-6 bzw. 20:3n-3 wieder zurück auf PtdCho übertragen werden müssen.

Die Analyse der Fettsäurezusammensetzung im reifen Samen zeigte, dass bereits die primären Stoffwechselprodukte GLA und SDA zu einem relativ hohen Anteil im Samen akkumulierten und zusammen rund 42 % des Gesamtfettsäuregehalts bildeten. Die Endprodukte ARA und EPA hatten im reifen Samen einen wesentlich geringeren Anteil am Gesamtfettsäuregehalt von zusammen lediglich etwa 2 %. Die detaillierte Analyse der Fettsäurezusammensetzung im reifenden Samen zeigte die vermutlichen Gründe für den hohen Anteil der intermediären Stoffwechselprodukte und deren ineffiziente Prozessierung zu den Endprodukten auf. Einerseits scheint die endogene LPCAT nicht in der Lage zu sein, einen effizienten Austausch der C18- und C20-PUFAs zwischen PtdCho und CoA zu vermitteln, was die niedrigen Gehalte an C20-Fettsäuren erklären könnte. Andererseits wurde vermutet, dass im reifenden Samen Acylgruppen-übertragende Enzyme wie LPCAT, CPT und PDAT um die Fettsäure-Substrate konkurrieren, denn diese drei Enzyme haben gemein, dass sie Fettsäuren des PtdCho als Substrate nutzen. Die gleichmäßige Verteilung des primären Produkts 18:3n-6 zwischen PtdEtn, DAG und MGDG könnte auf die CPT-Aktivität zurückzuführen sein, während der hohe Anteil an 18:4n-3 in den TAG auf die PDAT-Aktivität zurückzuführen sein könnte. Vermutlich sind es diese beiden PDAT-Aktivitäten, die dazu führen, dass die primären Intermediate aus dem transgenen Biosyntheseweg entfernt werden, wodurch sie den weiteren Umsetzungen hin zu ARA und EPA nicht mehr zur Verfügung stehen und somit die geringen Erträge an n-6- und n-3-VLCPUFAs erklären.

Ein ω3-Syntheseweg für die Bildung von EPA, dessen Reaktionsschritte ausschließlich unter Beteiligung von CoA-gebundenen Fettsäuren verlaufen, wurde im Samen von A. thaliana etabliert (Hoffmann et al., 2008). Hierfür wurden die Desaturasen MsΔ6 und MsΔ5 aus der Mikroalge Mantoniella squamata und die Δ6-Elongase PSE1 aus dem Moos P. patens verwendet. Die Fettsäurezusammensetzung des reifen Samens wies einen

20:4n-3-Zusätzlich wurden nahezu keine intermediären Stoffwechselprodukte detektiert, d.h., vermutlich wurde das primäre Produkt 18:4n-3 nahezu vollständig der Elongation zu 20:4n-3 zugeführt. Des Weiteren akkumulierten 92 % des gebildeten EPA im TAG.

Abb. 7 Schematische Darstellung verschiedener Strategien zur VLCPUFA-Biosynthese in höheren Pflanzen.

(A) Der Δ8-Syntheseweg zur Bildung von EPA in Blättern von A. thaliana verläuft unter Beteiligung des PtdCho- und Acyl-CoA-Pools (Qi et al., 2004). (B) w3-Syntheseweg zu Bildung von EPA im Samen von A. thaliana (Hoffmann et al., 2008). Die Reaktionsschritte erfolgen ausschließlich an CoA-gebundenen Fettsäuren ohne Beteiligung des PtdCho-Pools. (C) Kombinierter w6- und w3-Syntheseweg zur Bildung von ARA. An der Reaktionsfolge sind abwechselnd Lipid- und CoA-gebundene Fettsäuren beteiligt (Abbadi et al., 2004). Schwarze Schriftzeichen stellen endogene Fettsäuren dar. Weiße Schriftzeichen stellen transgen produzierte Fettsäuren dar.