Etablierung von DHA-Biosynthesewegen in A. thaliana

Neben der lipidabhängigen VLCPUFA-Biosynthese, dessen Reaktionsschritte unter Beteiligung des Acyl-CoA-Pools und des PtdCho-Pools verlaufen, können VLCPUFA auch ausschließlich im Acyl-CoA-Pool synthetisiert werden. Hierbei erfolgt die Desaturierung, im Gegensatz zu dem lipidabhängigen Weg, an CoA-gebundenen Fettsäuren. Ein solcher ω3-Syntheseweg für die Bildung von EPA wurde im Samen von A. thaliana etabliert (Hoffmann et al., 2008). Bei diesem Ansatz konnte der limitierende Austausch der intermediären Fett-säuren zwischen Acyl-CoA- und PtdCho-Pool umgangen werden.

Im Rahmen dieser Arbeit sollten Acyl-CoA-abhängige Biosynthesewege für DHA (22:6n-3) im reifenden Samen von A. thaliana etabliert werden. Für die Biosynthese von 22:6n-3 aus 18:3n-3 gilt es, fünf enzymatische Aktivitäten in Pflanzen einzubringen.

Zusätzlich zu den bereits in Abschnitt 3.5 erwähnten drei enzymatischen Aktivitäten, die zur Bildung von 20:5n-3 führen, sind eine sich daran anschließende Δ5-Elongation zur Bildung von 22:5n-3 und eine Δ4-Desaturierung zur Bildung von 22:6n-3 notwendig. Von vier der benötigten fünf Aktivitäten waren zum Zeitpunkt der vorliegenden Arbeit Enzyme bekannt, die eine Acyl-CoA-Spezifität aufweisen (Zank et al., 2002; Meyer et al., 2004; Domergue et al., 2005; Hoffmann et al., 2008). Lediglich eine Acyl-CoA-spezifische Δ4-Desaturase wurde bisher noch nicht identifiziert. Aus diesem Grund musste für den letzten Reaktionsschritt, der Desaturierung von 22:5n-3 zu 22:6n-3, eine lipidabhängige Δ4-Desaturase aus der zu den Euglenaphyceae zählenden Alge Euglena gracilis eingesetzt werden (Meyer et al., 2003).

Die erstellten zwölf Expressionskonstrukte sind in Tab. 25 und Tab. 26 aufgelistet. Die Konstrukte unterscheiden sich hauptsächlich durch die Gene, deren Genprodukte die Synthese von 20:5n-3 katalysieren. Für die Synthese von 22:6n-3 entlang des CoA I-Weges (Tab. 25) wurden die Acyl-CoA-spezifischen Desaturasen MsΔ6 und MsΔ5 aus M. squamata, die Δ6-Elongase PSE1 aus P. patens sowie die Δ5-Elongase OtELO2 aus O. tauri und die lipidabhängige Δ4-Desaturase EgΔ4 aus E. gracilis verwendet. Der CoA II-Weg setzt sich zusammen aus den Acyl-CoA-spezifischen Desaturasen OtΔ6 und OtΔ5, der Elongase OtELO1 aus O. tauri sowie der Δ5-Elongase OtELO2 und Δ4-Desaturase EgΔ4. Die an der DHA-Synthese beteiligten Gene wurden zusätzlich mit den Acyltransferasen OtDGAT2A, OtDGAT2B, OtDGAT2C und OtPDAT sowie der prozessiven bifunktionalen OleoylΔ12/Linoleoyl-ω3-Desaturase An1 aus dem filamentösen Schimmelpilz

Die erstellten rekombinanten Expressionskonstrukte wurden durch Agrobakterien-vermittelten Gentransfer in das Genom von A. thaliana integriert. Die Expression der Gene wurde durch den USP-Promotor reguliert. Zur Identifizierung von Transgenen enthielten die Expressionskonstrukte zusätzlich ein Herbizidresistenz-vermittelndes Gen. Als Referenz wurde der Leervektor transformiert, der den Pflanzen lediglich die Resistenz gegenüber Glufosinat vermittelt.

Tab. 25 Übersicht der Expressionskonstrukte CoA I für die DHA-Biosynthese in A. thaliana.

Die verschiedenen Expressionskonstrukte wurden in den Pflanzen-Transformationsvektor pCAM3300 kloniert.

Neben den Enzymen für die DHA-Synthese (MsΔ6, PSE1, MsΔ5, OtElO2, EgΔ4) enthielten die Expressionskonstrukte kein weiteres Gen (-frei-), die Desaturase An1 oder eine der angegebenen Acyltransferasen. Des Weiteren gibt die Übersicht die Anzahl der selektierten Pflanzen nach Herbizid-Behandlung und die Anzahl der Pflanzen, deren Samen 20:4n-6 und 20:5n-3 beinhaltet an. Mit – gekennzeichnete Linien wurden nicht analysiert.

Tab. 26 Übersicht der Expressionskonstrukte CoA II für die DHA-Biosynthese in A. thaliana.

Die verschiedenen Expressionskonstrukte wurden in den Pflanzen-Transformationsvektor pCAM3300 kloniert.

Neben den Enzymen für die DHA-Synthese (OtΔ6, OtELO1, OtΔ5, OtELO2, EgΔ4) enthielten die Expressionskonstrukte kein weiteres Gen (-frei-), die Desaturase An1 oder eine der angegebenen Acyltransferasen. Des Weiteren gibt die Übersicht die Anzahl der selektierten Pflanzen nach Herbizid-Behandlung und die Anzahl der Pflanzen, deren Samen 20:4n-6 und 20:5n-3 beinhaltet an. Mit –

OtΔ6, OtELO1, OtΔ5, OtELO2, EgΔ4 Anzahl transgener Pflanzen

A

Abb. 50 Mit der gewählten Enzymkombination konnte die DHA-Biosynthese in A. thaliana nicht etabliert werden.

Jeweils 1 mg Samen wurde für die Analyse der Fettsäureprofile eingesetzt. Dargestellt sind die Werte der einzelnen Pflanzen und die daraus resultierenden Mittelwerte (A) der endogenen Fettsäuren 18:3n-3, (B) das Produkt der Δ6-Desaturasen 18:4n-3 und (C) das Produkt der Elongase 20:4n-3. Weitere Intermediate der DHA-Biosynthese und DHA selbst wurden nicht detektiert.

Aus den zwölf Transformationsereignissen erhaltene Pflanzen der T1-Generation wurden nach der Herbizid-Selektion bis zur vollständigen Reife der Samen unter Gewächs-hausbedingungen angezogen. Die Anzahl der selektierten, transgenen Pflanzen ist in Tab. 25 und Tab. 26 aufgelistet. Die Analyse der Fettsäurezusammensetzung des T2-Samens von zwei ausgewählten Linien ist in Abb. 50 zusammenfassend dargestellt. Unabhängig von den Biosynthesewegen CoA I und CoA II wurde in keinem der analysierten Samen die Bildung von 22:6n-3 festgestellt. Ebenso waren die Vorstufen 22:5n-3 und 20:5n-3 nicht detektierbar.

Vermutlich liegt ein Grund für den Abbruch der DHA-Synthese in der geringen oder fehlenden Aktivität der Δ5-Desaturasen MsΔ5 für CoA I und OtΔ5 für CoA II, so dass keine

Die ersten beiden Reaktionsschritte der DHA-Synthese waren dagegen in den Fett-säureprofilen wiederzuerkennen. Wie bereits von Hoffmann et al. (2008) beobachtet, führt die Enzymkombination MsΔ6 und PSE1 (Abb. 50, CoA I) zu einer nahezu vollständigen Elongation des primären Produktes 18:4n-3 zu 20:4n-3 in transgenen A. thaliana-Pflanzen.

Diese Beobachtung wird durch die hier vorliegenden Daten bestätigt. Die gewählte Enzym-kombination sowie die Elongase OtELO1 (Abb. 50, CoA II) scheinen dagegen für eine effiziente Elongation von 18:4n-3 weniger gut geeignet zu sein. Ähnliches gilt auch für 18:3n-6, dem zweiten Produkt der Δ6-Desaturase OtΔ6 (Daten nicht gezeigt). Beide C18-Fettsäuren akkumulierten im Samen und wurden nur sehr ineffizient elongiert. Die in Abb. 50 gezeigten Ergebnisse ließen die Schlussfolgerung zu, dass auch die weiteren in Tab. 25 und Tab. 26 aufgeführten Linien kein DHA synthetisieren würden. Aus diesem Grund wurde die Analyse der Fettsäureprofile des Samens dieser Linien nicht weiter verfolgt.