Regulation of Kif18A by Plk1 phosphorylation   .1 Kif18A and Plk1 localization at the kinetochore

Thus,  it  is worth  to  test whether cells  expressing  GFP‐Kif18A^S674A display  an  increased  cold‐sensitivity  indicative  of  impaired  kinetochore‐microtubule  interactions compared to cells expressing GFP‐Kif18A^WT and if so, to test whether  components of the spindle assembly checkpoint localize to these kinetochores. It  would be also of interst to investigate whether the phosphorylation of Kif18A at  S674 facilitates the interaction to other plus tip binding factors like CENP‐E or  CENP‐F. 

To conclude, of particular interest is to investigate whether Cdk1 phosphorylation  does directly affect the intrinsic kinetic properties of Kif18A e.g. increase in the  affinity  for  the  plus  tips  or  indirect  by  regulating  the  activity  of  Kif18A  by  facilitating the interaction to other proteins which in turn regulate its activity.  

For example, recent studies demonstrate that the depolymerase activity of MCAK  (kinesin‐13) is coregulated by Aurora B (mitotic kinase) and inner centromere Kin‐I  stimulator ICIS¹²⁶. 

3.2.3 Regulation of Kif18A by Plk1 phosphorylation   3.2.3.1 Kif18A and Plk1 localization at the kinetochore 

Co‐immunostaining with Plk1 antibodies and GFP‐Kif18A revealed that in a subset  of sister kinetochores pairs, Kif18A colocalized with Plk1 at kMT plus‐ends. At  other kinetochores GFP‐Kif18A localized in a gradient along spindle MTs close to  the kMTs plus‐ends and thus did not show co‐localization with Plk1.  

This observation raises the interesting question at which kinetochores (mono‐or  biorientated, attached or unattached, lagging or laeding) Kif18A  and Plk1 co‐

localize and at which not. 

Recent studies indicate that Kif18A localizes asymmetrically to sister kinetochores²⁴,  however experimental evidence to which of the both sister kinetochores is lacking.  

Given the length dependent accumulation of kinesin‐8 at the microtubule plus end  revealed in in vitro studies, it is assumed that the motor preferentially targets to the  longer kMTs^24; 66. Recent reports demonstrate that the kinase activity of Plk1 is  asymmetrically  distributed,  high  kinase  levels  of  Plk1  were  observed  at  kinetochores lacking stable attachment to spindle microtubules¹²⁷. Hence, careful  analysis of kinetochores costained with Kif18A, Plk1 and a markerprotein which  e.g. only localizes to kinetochores which are under tension (pBubR1) could gain  insights into the underlying mechanism of the asymmetric localization of Kif18A  and its regulation e.g. by Plk1.  

3.2.3.2 Plk1 phosphorylation impairs Kif18A localization    

Our immunofluorescence analyses revealed that in Kif18A RNAi‐background, GFP‐

Kif18A^WT and GFPKif18A^S859A but not GFPKif18A^S859E efficiently accumulated at the  plus tips of kinetochore microtubules (Fig 2.3.5B). The localization of the non‐

phosphorylatable Plk1 phosphorylation mutant GFP‐Kif18A^S859A to the plus tips of   kMTs is consistent with our data demonstrating that Kif18A localizes to the ends of  spindle microtubules in the absence of Plk1 kinase activity. 

Thus, it is likely that the phosphorylation at S859 by Plk1 negatively regulates either  the targeting of Kif18A to or maintaining at the kMTs plus ends. Given the high  kinase  activity  of  Plk1  at  the  kinetochores  which  have  not  yet  made  stable  attachments raises the interesting question whether the phosphorylation of Plk1  inhibits  Kif18A  from  specifically  targeting  to  the  plus  ends  of  kinetochore  microtubules which are not under tension.  

Or does this phosphorylation directly or indirectly prevent the accumulation of  Kif18A at the plus ends of kMTs? Does this phosphorylation event may act in  concert with other factors (e.g. the presence of more dynamic microtubules at  kinetochores which have not established stable attachments) to ensure that Kif18A  is not localized to these kinetochores. 

In trying to find answers to these questions one may has to re‐consider what  functions Plk1 and Kif18A fulfill at the plus‐ends of kMTs. Plk1 is thought to  establish and to regulate kinetochore – microtubule interactions thereby promoting  stable attachments between kinetochores and spindle microtubules^86; 128. Consistent  with this function of Plk1 is the particular high kinase activity on the kinetochores  of those chromosomes that have not yet been attached to both poles of the mitotic  spindle and are not under tension^86; 127. Kif18A is thought to play an essential role in  reducing  the  oscillatory  speeds  of  biorientated  chromosomes  to  control  their  alignment in the spindle equator. Consistent with this function are localization  studies of Kif18A indicating that the motor is found along spindle microtubules in  prometaphase and concentrates at the kMTs plus‐ends of more or less aligned  chromosomes (Fig 2.1.2 and²⁴). 

Therefore  is is  likely  that  the  high  kinase activity of  Plk1  at the  unattached  kinetochore, inhibits the motor from accumulating at kinetochores which have not  yet made stable attachments to spindle microtubules. What is the physiological  relevance of this phosphorylation? It might be that with this phosphorylation event  the cell ensures that Kif18A is only localized to biorientated kinetochores with  stable attachments thereby promoting the selective suppression of kMTs dynamics  within  their  k‐fibers. Thus,  this  phosphorylation  event may  either  allows the  selective enrichment of Kif18A at attached kinetochores (low Plk1 kinase acivity,  hence accumulation of Kif18A) thereby controlling the efficient alignment of these  sisterchromatids  and  the  metaphase  plate  and  moreover  allows  the  selective  inhibition  of  Kif18A  association  to  unattached  kinetochores  allowing  high  microtubule dynamics and/or turnover to either generate stable attachments or to  correct improper ones. 

3.2.3.3 Plk1 phosphorylation of Kif18A and mitotic progression   

Our  functional  analysis  of  Kif18A‐RNAi  cells  expressing  Kif18A^S859E  were  characterized  by  an  increase  in  the  duration  from  NEBD  to  anaphase  onset  compared to Kif18A‐RNAi cells expressing Kif18A^WT or Kif18A^S859A (Fig 2.3.5B). Our  immunofluorescene studies indicate that cells stably expressing GFP‐Kif18A^S859E are  characterized by defects in chromosome alignment (Fig 2.3.5B). Thus, these studies  indicate that the phosphorylation of S859 is critical for timely progression through  mitosis.  

Therefore it is interesting to consider if this site is dephosphorylated by e.g. protein  phosphatase 1 PP1 or 2A PP2A to dynamically regulate Kif18A localization and/or  activity for either the leading or lagging kinetochore. Interstingly, PP1 is localized  to  the  outer  kinetochore  and  both  phosphatases  are  implicated  in  regulating  microtubule dynamics during mitosis^129‐130.  

Thus,  a  dynamic  balance  of  phosphorylation  of Kif18A  mediated  by  Plk1  in  prometaphase (and probably other kinases) and may phosphatases regulate the  association of Kif18A with kMTs plus‐ends and hence control for the dynamic  movements of chromosomes to the spindle equator.  

3.2.4 Cdk1 and Plk1 phosphorylation and the effects on basic kinetic